① 生物學重復必須同一時間去做嗎
實驗設計原則的正確把握：重復原則及其作用
重復原則通常有三層含義，即「重復取樣」、「重復測量」和「重復實驗」，實驗設計中所講的重復原則指的是「重復實驗」。本文本文以實例的方式說明一下臨床實驗中違背重復原則和重復原則使用不當的常見情況。
重復原則及作用
重復原則的概念
重復通常有三層含義，即「重復取樣」、「重復測量」和「重復實驗」。從同一個樣品中多次取樣，測量某定量指標的數值，稱為「重復取樣」；對接受某種處理的個體，隨著時間的推移，對其進行多次觀測稱為「重復測量」。實驗設計中所講的重復原則指的是「重復實驗」，即在相同的實驗條件下，做兩次或兩次以上的獨立實驗。這里的「獨立」是指要用不同的個體或樣品做實驗，而不是在同一個體或樣品上做多次實驗。整個實驗設計所包括的各組內重復實驗次數之和，稱為樣本大小或樣本含量。
重復原則的作用
同一個實驗條件下為何要做多次獨立的重復實驗呢？只做一次不更節省時間柏費用嗎？
關鍵在於觀測的結果是否具有變異性，若對每一個正常人觀測其有多少個手指，只需觀測一個人即可，因為每個正常人的手指都有10個，它是一個不具有變異性的定量指標。若對每一個正常入觀測其血小板的含量是多少，僅觀測一個人就作出關於正常人血小板含量為多少的結論顯然是可笑的，因為每個正常人血小板含量是不盡相同的。只有觀測了大量正常人血小板的含量後，其取值規律性才有可能表現出來，初步的印象是取值接近該組被觀測的全部受試者算術平均值的人較多，取值偏離此均值較遠的人較少，取值特別小和特別大的人就吏少了。即便這樣一種非常簡單的規律，也只有在進行了大量重復實驗之後才能夠表現出來。
由此可如重復原則的作用就在於它有利於使隨機變數的統計規律性充分地顯露出來。
96孔板的實驗，比如MTT，luciferase reporter等實驗室，單次至少3個復孔，需要至少3次獨立重復實驗（肯定不是一天做的）。
WB實驗，收樣的時候可以不用做復孔，分裝蛋白的時候可以分幾份跑膠，也可以就跑一次。但是結果至少重復3次（三批的樣本）保證重現性。
PCR實驗，收樣的時候不需要復孔，但是p的時候至少設置3個復孔，且至少3次獨立重復實驗，也就是說你等收三批以上的RNA樣本。
染色實驗，組織樣本，至少來源於3隻以上的動物，這個具體看你用什麼模式生物，小鼠得6隻，大鼠3隻。每個組織至少有3-5張切片進行染色。最後分析的時候如果是掃描圖片可以是一張整圖，如果是放大的截取的圖片，那至少觀察5個以上的視野。細胞樣本染色，6孔板或者比6孔板大的染色，我一般做1-2個復孔，其實一個也可以。96孔這種，至少也需要3個復孔.且都需要做3批以上。
CoIP, IP pulldown因為最後處理相當於WB,參考WB即可。
ChIP參考PCR即可。
RNA-seq, ChIP-seq,>3個重復樣本。
注意：文章中的n=5，動物實驗的話是指有5隻動物，細胞實驗是指5個獨立實驗，也就是5批實驗的結果，不是5個復孔的意思。
② 2個生物學重復的熒光定量結果怎麼分析 作圖
ct mean,是你相同樣品的幾個重復的CT值得平均值如果是做的相對定量，用CTmean的結果就可以了，計算方法就是R＝2-ΔΔCt，現在很多儀器你只要設置的時候明確標出內參基因和目的基因，這個結果也是會有自帶給計算出來的。如果你是做絕對定量，那更方便，你只要在儀器設置的時候把你的標准品含量依次輸入，最後會自動生成標准曲線什麼的，你最後只要分析og sq的結果就可以了。
③ WGBS測序深度和生物學重復知多少
轉錄水平的研究中設置多少生物學重復和測序深度比較合適？
生物學重復可以定義為使用來自不同抽提的樣本進行實驗，例如，上圖中同一來源獨立制備的3隻老鼠。對每一個樣本制備來說，只要抽提之後的步驟是獨立進行的，那麼分析測量就是獨立的。雖然對於特定的基因，生物學重復的變異大於技術重復，但是由每一個獨立樣本引入的偏差通過取每一個測量的平均值幾乎消除，因此生物學重復的實驗結果易於廣泛概括。通常，生物學重復用於概括性結論的驗證，技術重復用於減少這些結論的變異性。這也是為啥高分文章需要更多生物學重復。具體兩個例子說明下設置生物學重復的重要性：
案例1：Sequencingtechnology does not eliminate biological variability.
圖說明：A plot of the expression for two genes COX4NB (left column, pink)and RASGRP1 (right column, blue) as measured with sequencing (top row) andmicroarrays (bottom row) versus biological sample. Mean-centered measurementsfrom the two studies are plotted as circles and triangles, respectively.
從圖上看，測序和技術的結果一致性很好（其實測序和晶元技術各有優劣勢，以後有機會再說）。COX4NB在生物學重復樣本中表達差異非常小；但在同樣情況下，RASGRP1的生物學差異很大。這結果意味著：不同實驗組間COX4NB的表達水平的變化存在研究意義；而同樣情況下RASGRP1的檢測數據可能不能說明問題。通俗點說，如果癌和癌旁的差異表達是「COX4NB」基因表達形式，那麼很容易重復做出結果，而如果三對三篩選出「RASGRP1」的基因表達形式，那麼你擴大樣本驗證就會出現和前期篩選不一致的結果。
案例2：GEO資料庫下載兩組數據的分析
下圖是兩組數據，癌（黃線左側）和正常組織（黃線右側）篩選的部分差異基因。如果選擇3個重復如上方箭頭標出的，這個基因就沒有差異。如果選擇4個重復如下方箭頭標出的，這個基因就出現相反的變化水平。
作圖軟體源自微信公眾號《實驗萬事屋》介紹的GENE-E
說了這么多，大家都知道實驗設計中重復越多越好，但是具體多少比較合適，下面幾篇文獻供參考：
文獻A. Howmany biological replicates are needed in an RNA-seq experiment and whichdifferential expression tool should you use?
數據來源：RNA was sequenced from 48 biological replicate samples ofSaccharomyces cerevisiae（釀酒酵母）in eachof two well-studied experimental conditions; wild-type (WT) and a Δsnf2mutant. Quality control and data processing steps rejectseveral replicates from each condition resulting in 42 WT and 44 Δsnf2biological replicates of 「clean」 data totaling ∼889M aligned reads.
這篇文章主要提出了2個問題：
1. 在RNA-Seq實驗中需要多少生物學重復提高差異基因鑒定工作的准確性和靈敏度？
參考答案是：至少6個重復以上，12個以上更佳。至於你糾結6個重復怎麼來的，請看下圖:
2. 在一定重復數量的RNA-Seq中，用哪種統計演算法或工具更合適？
參考答案是：.如果每組少於12個重復，相對的edgeR更優秀一些，如果超過12個重復，DESeq更佳。文章使用的統計演算法如下表：
另外值得一提的是，這篇文章中的模式生物是釀酒酵母。我「網路」（別鄙視，沒辦法用google）了下，釀酒酵母菌屬於酵母菌科，是一種單細胞生物，成卵圓形或球型，繁殖方式為出芽繁殖，孢子繁殖，接合繁殖三種，形態簡單但生理復雜，工業上用於釀酒。它的參考基因組如下:
至於你問我其他物種多少生物學重復合適，我只能說越多越好了。
文獻B.Differential expression in RNA-seq: A matter of depth
④ 根據生物學重復,兩個樣本對應不上號應該怎麼區分啊
你好，這是正常現象，我們可以去兩個樣本的平均值。
生物重復：指對同一個處理組中獨立來源的重復樣本分別進行獨立分析，是整個實驗的完全重復，如將具有同一基因型的多個細胞株進行獨立地測定。由於遺傳和環境等因素的影響會引起有機體的個體差異，因此需要採用生物重復的實驗設計方法來消除該差異。目前都以3次生物學重復實驗設計為主，要求嚴格的實驗可以做5次重復。發現生物重復是衡量實驗的總波動的（處理組間的差異不列入此處的波動，他們應該稱為效應），它包括樣本個體間差異和技術重復差異。
⑤ 宏基因組測序對樣品的生物學重復有什麼要求如何避免重復性較差的問題出現
土壤、水體等生態環境樣本建議5個或5個以上的生物學重復；取樣時每個樣品均需多點取樣後混勻，降低單個樣本特異性。
人和動物樣本因個體特異性較大，建議10個以上生物學重復；腸道、瘤胃或糞便樣本因含有較多厭氧菌，要快速取樣、迅速低溫保存，針對較難富集微生物的樣品，如各種物體表面，可採用緩沖液洗脫或棉簽擦拭等方法。
樣品取好後避免長時間放置，需盡快進行DNA提取，送樣測序。
⑥ 物理重復和生物學重復都必須要嗎
可以都要
如果你的高通量的數據是要放到文章裡面去的，甚至有人僅僅晶元的數據就發一篇文章，那一定要有n>=3的生物學重復。如果只是自己看一看，找個方向，那可以不做重復。但是，問題來了，如果是組織樣，組內差異很大，不做重復也沒意義。如果是細胞株，可能好一些。生物學重復是必要的，就是樣本和總體的關系，樣本越大越能代表總體
⑦ RNA-seq沒有生物學重復 被審稿人argue怎麼辦
一般一篇RNA-seq類的文章，其結論主要涉及兩個方面的問題。對於文章中結論中涉及的具體與某個性狀相關的基因，還是建議你把與結論重要的相關基因使用Qpcr驗證一遍，然後就有底氣回復了：「雖然沒有重復，Qpcr的結果支持我的關注的這些基因嘛」。（比如我們之前就分享了一篇大牛的文章，只有2個重復的lncRNA，通過多種後期實驗驗證發了8分的文章，戳這里查看）如果你的文章重點討論的是某些通路或一類基因集合，全部Qpcr驗證一遍工作量太大，不現實啊。
還有一個辦法，去資料庫查找類似的研究數據來支持我們的結論。例如，華南農大周碧燕教授今年剛剛發表的研究超氧化物對荔枝退化葉影響的文章（查看文獻解讀戳這里~）。雖然設計了重復，審稿人依然不過癮：能不能再找些證據？在和周教授協商後，我們從NCBI下載了一篇研究超氧化物對擬南芥影響的文章的數據。在進行分析比較後，我們發現擬南芥差異表達基因幾乎在荔枝的差異基因中都能找到同源基因。於是，審稿人就再也不提這個問題了。如果是醫學類的項目，找到同類數據應該理論上也更加容易。
當然，如果要發表5分以上的文章，建議還是設置生物學重復比較保險一些。以上的策略，也只能保證能夠應答大部分審稿人的質疑，但有時候也會遇到死揪不放的審稿人。那麼，額，還是撤稿換投吧，說不定知音就在下一家雜志社喲。
⑧ 如何來設定轉錄組測序中的生物學重復
如何來設定轉錄組測序中的生物學重復
1.區分生物學重復與技術重復
生物學重復：指樣本重復，比如3隻小鼠，同時做一種處理，就是三個生物學重復。
技術重復：一般是三次實驗，比如對一塊組織，提了三次RNA，做三次real time。
2.設置生物學重復的意義
由於新一代測序技術的優越性以及高成本，曾一度忽略了「生物學重復」的重要性。但生物學重復對於測序實驗的設計以及實驗數據的解讀和分析都非常重要。
設置生物學重復：
能夠消除組內誤差：生物學重復可以測量變異程度
增強結果的可靠性：測序的樣本數越多，越能夠降低背景差異
檢測離群樣本：異常樣本的存在，會嚴重影響測序結果的准確性，通過計算樣本間的相關性可以發現異常樣本，將其排除。
案例一：
註：COX4NB和RASGRP1基因在生物學重復樣本中表達值的散點圖：
左邊紅色，COX4NB基因表達值的散點圖
右邊藍色，RASGRP1基因達值的散點圖
上面一行，測序數據的散點圖
下面一行：晶元數據的散點圖
COX4NB在生物學重復樣本中表達差異非常小；但在同樣情況下，RASGRP1的生物學差異很大。結果意味著：不同實驗組間 COX4NB的表達水平的變化存在研究意義；而同樣情況下RASGRP1的檢測數據可能不能說明問題。
由此可知，設計的實驗如果沒有生物學重復，或者生物學重復的數量不夠，就不能得到有統計意義的實驗結果；獲得的差異表達的基因很可能僅僅是少數個體差異的表現，並不能反映疾病或者某種特定生理狀態的群體本質特徵。
3.生物學重復設置幾個合適？
您是不是有同樣的問題：轉錄組測序是否必須進行生物學重復啊，是否要3個重復，是否可以用3個樣品的RNA等量混合代替生物學重復，如果不重復能否發文章…..？一方面是有限的經費，一方面是編輯的質疑；實在很難抉擇呀~~~
目前沒有生物學重復的實驗發文章比較困難，尤其是IF≥5的雜志。如果確實受限於研究經費，無法設置生物學重復。文章投出之後，遭編輯質疑。那就得結合強有力的實驗數據做支撐，比如定量實驗，FISH熒光原位雜交，或者是northern 雜交等，用實驗數據說服編輯。重復設置原則上越多越好，然而考慮到現實條件，重復設置≥3。一般不建議設置兩個重復，因為如果兩者結果不一致，我們無法確定以哪個數據為參考。
註：3個生物學重復，不等同於將3個樣品的RNA等量混合後測序。3個樣品等量混合測序，相當於將3個樣本的基因表達量取了平均值，其實就是相當於取了一個樣本，由此得到的差異基因同樣不可信，不能反應群體生物學現象。
4.生物學重復分析結果展示
以公司做項目的經驗來看，原核生物以及真菌生物學重復的效果>植物>動物，這是由於動植物個體差異較大所導致。所以動植物在選取生物學重復時，應按照嚴格的篩選條件進行取樣，方可得到理想結果。
⑨ 生物醫學研究中的重復性，可以理解為下述哪些項
那麼這只能是一個站不住腳的生物實驗原則中可重復性原則怎麼理解我認為生物學實驗的可重復性並不差。原則上, Nature。 如果一個實驗結果，片面的實驗，需要特定的人在特定的時間和地點來重復。 但是，幾乎一切現象都可以套用因果關系來解釋。只要因果關系是成立的，那麼實驗就應該是可重復的，這個數據的權威性就要受到質疑。因果關系沒有搞清楚，能夠發表的數據。重復不出來只有兩種可能，即使是CNS級別（Cell, Science三大期刊）的文章，要麼操作有問題，也會有很多實驗結果是重復不出來的，都應該是可以重復的，要麼數據是不成立的。當我們純粹的談論科學時