如何鑒別纖維素酶微生物

A. 如何分離土壤中的產纖維素酶的微生物

土樣破碎，無菌水沖懸，低速離心取上清，梯度稀釋，平板塗布，挑單菌落液體培養，並在平板上畫線培養（菌落較單一的話可以省略），在畫方格的纖維素平板上挑單菌落培養，挑水解圈的菌落液體培養，利用濾紙條鑒定水解能力，做生長曲線，優化培養條件。要做鑒定的話就是看菌落形態，理化性質，16s測序做進化樹……自然界中蘊藏著巨大的微生物資源，它們散布於整個地球的各個角落，而且在不同的環境下生存的微生物都有其完全不同的代謝方式，能分解利用不同的底物。這一特徵就為微生物酶品種的多樣性提供了物質基礎。特別是當基因工程介入時，動植物細胞中存在的酶，幾乎都能夠利用微生物細胞獲得。因此，有計劃和仔細地篩選微生物菌種，通常可以獲得能夠生產幾乎任何一種酶的適當菌株。土壤和海水這兩大類資源寶庫的開發具有重要意義。我們可以從土壤、腐木篩選相應的產酶微生物，從污水中篩選各種能夠產生分解糖類、脂類、蛋白質、纖維素、木質素、環烴、芳香物質有機磷農葯、氰化物及某些人工合成的聚合物酶的微生物。在極端環境可篩選嗜熱微生物、嗜鹼微生物、嗜鹽微生物、嗜酸微生物、耐高壓微生物等，並開發極端微生物酶品種。進21世紀以來，各國已在生物產業研究中投入了巨大的財力和科研力量。隨著能源、資源和環境問題的日趨嚴重，生物資源利用已被全球廣泛重視，成為世界各國的戰略性研究重點。在自然界中，纖維素類物質是最廉價、最豐富的一類可再生資源，是人類社會賴以生存的基本物質來源。全世界植物體生成量每年高達1 500億t干物質，其中有50%以上為纖維素和半纖維素。採用生物酶催化技術可將農作物、樹木和其他植物及其殘體、畜禽糞便、有機廢棄物等生物質轉化為工業原料，達到合理、可循環利用自然生物資源的目的。擔子菌亞門Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、半知菌亞門(Deuteromycotina)、絲孢綱(Hyphomycets)和子囊菌亞門(Ascomycotina)的部分真菌都具有很強的產生纖維素酶和漆酶的能力，備受生化工業領域的關注。其中，白腐菌、褐腐菌和軟腐菌是自然界中降解木材的主要真菌。在過去的30多年裡，有關白腐菌的研究主要集中在木素降解酶系方面；有關軟腐菌的研究則集中在纖維素降解酶系方面；而有關褐腐菌的研究主要集中在降解木質纖維素機制方面。

B. 鑒別培養基怎麼鑒別分解纖維素的微生物

先明晰一下概念：
鑒別培養基

      是一類含有某種特定化合物或試劑的培養基。某種微生物在這種培養基上培養後，它所產生的某種代謝產物與這種特定的化合物或試劑能發生某種明顯的特徵性反應，根據這一特徵性反應可以將某種微生物與其他中微生物區別開來。主要用於不同類型微生物的快速鑒定，如用來檢查細菌能否產生硫化氫的醋酸鉛培養基。
鑒別分解纖維素的細菌，就用纖維素作為唯一碳源，並在培養基中加入剛果紅。作用如下：
剛果紅（Congo Red,簡稱CR）是一種燃料，他可與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但並不和纖維素水解後的產物如纖維二糖或葡萄糖發生這種顯色反應，當我們在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養基中的纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素分解菌分泌的纖維素酶分解後，剛果紅-纖維素的復合物就將無法形成，從而在培養基中形成以纖維素分解菌為中心的透明圈，這樣我們就可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。

C. 如何比較兩株微生物長纖維素酶能力的強弱

用以可溶性纖維素這唯一碳源的平板比較。
做同樣的平板，都以可溶性纖維素為唯一碳源，接種兩種微生物，培養觀察。
培養24－48小時後，因微生物產生纖維素酶分解纖維素，會在菌落邊緣出現透明圈，產酶能力越強，透明圈的直徑越大。
以此方法來比較。

D. 鑒定纖維素分解菌時，怎樣利用透明圈判斷

由圖可知，纖維素分解菌產生的纖維素酶將鑒別培養基中的紅色復合物中纖維素分解後，紅色就消失了，出現透明圈，菌落周圍紅色消失有透明圈的菌體初步篩選為纖維素分解菌。

E. 請問下鑒別分解纖維素菌的時候，剛果紅要加多少啊還有採用什麼纖維素呢，普通的做薄層的可以么

鑒別纖維素分解菌用纖維素剛果紅瓊脂平板，剛果紅濃度0.2-0.4g/L，纖維素一般用羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），可以在配製培養基時加剛果紅，培養後顯示降解圈。也可以配製培養基時不加，等菌落長出後用1g/L的剛果紅覆蓋菌落染色30mins，用1mol/L的氯化鈉脫色30mins，顯示降解圈。

F. 篩選纖維素分解酶的方法

（1）纖維素酶是一種復合酶，包括C ₁ 酶、C _X 酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖．纖維素分解菌可以用剛果紅染液進行鑒別，剛果紅可以與纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，能夠產生透明圈的菌落就是纖維素分解菌．因此，剛果紅染色法能通過顏色反應直接對微生物進行篩選．
（2）為了確定是纖維素分解菌，還需要進行發酵產纖維素酶的實驗．纖維素酶的發酵方法有液體發酵和固體發酵兩種．
（3）進行菌種保藏時，若採用臨時保藏，將菌種接種在斜面培養基上，放人4℃冰箱中可保藏3～6個月；若要長期保存，可將菌液與滅菌的甘油混勻，放在-20℃的冰箱中保存一年．
故答案為：
（1）復合 葡萄糖
（2）剛果紅染色法 液體發酵 固體發酵
（3）將菌種接種在斜面培養基上，放人4℃冰箱中 將菌液與滅菌的甘油混勻，放在-20℃的冰箱中

G. 剛果紅染色法鑒定纖維素分解菌的方法一會不會出現能產生假陽性反應的產澱粉酶菌

會。

剛果紅可以與纖維素形成紅色復合物，但並不和纖維二糖、葡萄糖發生這種反應。當纖維素被纖維素酶分解後，剛果紅-纖維素復合物就無法形成，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈 。這樣可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。

由於產生澱粉酶的微生物也形成透明圈，所以可能產生假陽性反應，有些微生物具有降解色素的能力，在培養過程中也會形成明顯的透明圈，與纖維素的分解菌不易區分。

(7)如何鑒別纖維素酶微生物擴展閱讀：

注意事項：

1、用於定性組織學染色，有選擇性地使福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的澱粉體顯色。

2、產品有效期：2-8℃，12個月。附件：注冊產品標准，產品說明書。

3、切片脫蠟應盡量干凈，否則影響染色效果。

4、剛果紅染色液染色時盡量採用浸染，如果滴染，應置於濕盒防止溶液揮發。

5、分化時間較短，膠原纖維也被染成紅色，分化過度，澱粉樣物質也被脫色。如果脫 色過度，可以將切片清洗後重新用剛果紅染色液浸染。

6、為了安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。

H. 剛果紅培養基鑒別產纖維素酶菌的原理是什麼（盡量說細致一點，主要是反應機理方面的。）

纖維素酶真菌和不產纖維素酶陰性對照菌毛霉在纖維素-剛果紅培養基中剛果紅染料移動，剛果紅染料進入產纖維素酶真菌，產纖維素酶真菌首先分解纖維素物質為含有葡聚糖等結構的多聚糖類物質，多聚糖與剛果紅形成多聚糖-剛果紅復合物，復合物不僅被吸附在菌絲外，而且能被進一步轉運吸收至菌絲內部。通過進一步的降解，多聚糖被分解而加以利用，而剛果紅則被保留在菌絲體內，使菌落呈現紅色。所以，纖維素-剛果紅培養基可作為分離、篩選纖維素分解真菌的特異性培養基。

I. 鑒別纖維素分解菌採用什麼染色法

1、剛果紅能給纖維素染色，第一種方法是在菌落長出來以後加的剛果紅，產纖維素酶的菌落周圍的纖維素被水解了，因此染色較淺或沒有被染色，從而分辨出產纖維素酶的菌落；而第二種方法是在培養基中直接加入剛果紅，因為培養基中有澱粉物質的存在，產澱粉酶的菌落在水解澱粉的同時可能會使剛果紅的染色變淺，出現水解圈，即假陽性現象。
2、是在培養基中加入剛果紅。

J. 對純化的纖維素分解菌採用什麼方法進行鑒定

先明晰一下概念：鑒別培養基 是一類含有某種特定化合物或試劑的培養基。某種微生物在這種培養基上培養後，它所產生的某種代謝產物與這種特定的化合物或試劑能發生某種明顯的特徵性反應，根據這一特徵性反應可以將某種微生物與其他中微生物區別開來。主要用於不同類型微生物的快速鑒定，如用來檢查細菌能否產生硫化氫的醋酸鉛培養基。鑒別分解纖維素的細菌，就用纖維素作為唯一碳源，並在培養基中加入剛果紅。作用如下：剛果紅（CongoRed,簡稱CR）是一種燃料，他可與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但並不和纖維素水解後的產物如纖維二糖或葡萄糖發生這種顯色反應，當我們在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養基中的纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素分解菌分泌的纖維素酶分解後，剛果紅-纖維素的復合物就將無法形成，從而在培養基中形成以纖維素分解菌為中心的透明圈，這樣我們就可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。