Ⅰ 微生物基因建庫怎麼做
cDNA 文庫的構建
1.1 cDNA 文庫構建的基本原理與方法
cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經典 cDNA 文庫構建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當的連接接頭，連接到適當的載體中獲得文庫。其基本步驟包括：RNA 的提取(例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍—有機溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據不同的樣品而定)，要構建一個高質量的 cDNA 文庫，獲得高質量的 mRNA 是至關重要的，所以處理 mRNA 樣品時必須仔細小心。由於 RNA 酶存在所有的生物中，並且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環境，因此建立一個無 RNA 酶的環境對於制備優質 RNA 很重要。在獲得高質量的 mRNA 後，用反轉錄酶 Oligo(dT) 引導下合成 cDNA 第1鏈， cDNA 第2鏈的合成(用 RNA 酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶 I，同時包括使用 T4 噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 DNA 連接酶進行的修復反應)，合成接頭的加入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴增 cDNA 文庫、對建立的 cDNA 文庫進行鑒定。這里強調的是對載體的選擇，常規用的是 λ 噬菌體，這是因為 λ DNA 兩端具有由12個核苷酸的粘性末端，可用來構建柯斯質粒，這種質粒能容納大片段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全長文庫
經典 cDNA 文庫的構建雖然高效、簡便，但文庫克隆的片段一般較小，單個克隆上的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要幾個克隆才能覆蓋一個完整的全基因的 cDNA。為了克隆到真正的 cDNA 全長，建立富含全長的 cDNA 文庫具有重要意義。為此，必須克服僅用 mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆轉錄酶作用特點所導致的局限性。全長 cDNA 文庫，是指從生物體內一套完整的 mRNA 分子經反轉錄而得到的 DNA 分子群體，是 mRNA 分子群的一個完整的拷貝。全長 cDNA 文庫不僅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通過基因序列比對得到 mRNA 剪接信息，此外，還可以對蛋白質序列進行預測及進行體外表達和通過反向遺傳學研究基因的功能等。目前所報道的對全長文庫的構建一般按照美國 CLONTECH 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 方法或 GeneRacer 試劑盒 (Invitrogen，USA) 使用說明進行。判斷一個 cDNA 文庫中的 cDNA 序列是否是全長基因的 cDNA，主要方法有以下幾種。
1.2.1 直接從序列上評價
5'端：如果有同源全長基因的比較，可以通過與其它生物已知的對應基因5'末端進行比較來判斷。如果無同源基因的新基因，則首先判斷編碼框架是否完整，即在開放閱讀框的第1個 ATG 上游有無同框架的終止密碼子；其次，判斷是否有轉錄起始點，一般加在5'帽結構後有一段富含嘧啶的區域，或者是 cDNA 5'序列與基因組序列中經過酶切保護的部分相同，則可以確定得到的 cDNA 的5'端是完整的。3'端：同樣可以用其它生物已知的對應基因3'末端進行比較來判斷，或編碼框架的下游有終止密碼子，或有1個以上的 PolyA 加尾信號，或無明顯加尾信號的則也有 PolyA 尾。
1.2.2 用實驗方法證實
可以通過引物延伸法確定5'端和3'端的長度，如：5'端 RACE，3'端 RACE，或者通過 Northern Blot 證實大小是否一致。
1.3 對 cDNA 文庫的分析
對 cDNA 文庫質量的評價主要有兩個方面。第一方面為文庫的代表性，cDNA 文庫的代表性是指文庫中包含的重組 cDNA 分子反映來源細胞中表達信息(即 mRNA 種類)的完整性，它是體現文庫質量的最重要指標。文庫的代表性好壞可用文庫的庫容量來衡量，它是指構建的原始 cDNA 文庫中所包含的獨立的重組子克隆數。庫容量取決於來源細胞中表達出的 mRNA 種類和每種 mRNA 序列的拷貝數，1個正常細胞含10000～30000種不同的 mRNA，按豐度可分為低豐度、中豐度和高豐度三種，其中低豐度 mRNA 是指某一種在細胞總計數群中所佔比例少於0.5％時。滿足最低要求的 cDNA 文庫的庫容量可以用 Clack-Carbor 公式 N=Ln(1-P)/(1-1/n) 計算( P 為文庫中任何一種 mRNA 序列信息的概率，通常設為99％；N 為文庫中以 P 概率出現細胞中任何一種 mRNA 序列理論上應具有的最少重組子克隆數；n 為細胞中最稀少的 mRNA 序列的拷貝數；T 為細胞中表達出的所有 mRNA 的總拷貝數)。第二方面是重組 cDNA 片段的序列完整性。在細胞中表達出的各種 mRNA 片段的序列完整性。在細胞中表達出的各種 mRNA 盡管具體序列不同，但基本上都是由3部分組成，即5'端非翻譯區，中間的編碼區和3'端非翻譯區。非翻譯區的序列特徵對基因的表達具有重要的調控作用，編碼序列則是合成基因產物—蛋白質模板。因此，要從文庫中分離獲得目的基因完整的序列和功能信息，要求文庫中的重組 cDNA 片段足夠長以便盡可能地反應出天然基因的結構。
2 cDNA 文庫構建的其它類型
2.1 均一化 cDNA 文庫
它是指某一特定組織或細胞的所有表達基因均包含其中，且在 cDNA 文庫中表達基因對應的 cDNA 的拷貝數相等或接近。WEISSMAN 早就提出了可以通過基因組 DNA 飽和雜交的原理將 cDNA 文庫進行均一化的理論。但該理論一直以來都被認為不能應用於實際。其主要限制因素是難以提供足量的極低表達豐度的 cDNA 用於飽和雜交，從而可能會造成部分基因的 cDNA 的丟失。20年前，基於 DNA-RNA 雜交的研究就已經將基因的轉錄水平分為高中低3類。隨後研究進一步表明，絕大多數基因是處於中等或低等表達豐度的，在單個細胞中含有近1～15個拷貝，而高豐度表達基因的轉錄產物在單個細胞中最高可達5000個左右拷貝，約占總表達量的25％。這種基因表達能力上的巨大差異成了獲得一個具有完整代表性的 cDNA 文庫的障礙，其表達量上的巨大差異更為大規模研究增添了困難。對單一組織的 cDNA 文庫而言，高拷貝基因序列的大量存在給基因的篩選和鑒定帶來不必要的浪費，尤其是在大規模的 EST 測序中。
均一化 cDNA 文庫是克服基因轉錄水平上巨大差異給文庫篩選和分析帶來障礙的有效措施，有利於研究基因的表達和序列分析。現在，在構建均一化的 cDNA 文庫中至少有2種主要的觀點：一種是基於復性動力學的原理，高豐度的 cDNA 在退火條件下復性的速度快，而低豐度的 cDNA 復性要很長時間，從而可以通過控制復性時間來降低豐度；另一種是基於基因組 DNA 在拷貝數上具有相對均一化的性質，通過 cDNA 與基因組 DNA 飽和雜交而降低在文庫中高拷貝存在的 cDNA 的豐度。第一種方法的掌握對技術的要求比較高，對多數人而言需要多次摸索才能找到最適條件；而後一種方法易於掌握，但有研究者根據復性動力學的原理也提出了其不利因素，即採用基因組 DNA 飽和雜交的方法會因為低拷貝的表達基因拷貝數少而無法被雜交上。目前已報到的均一化 cDNA 文庫多是根據第二種原理構建的，常用策略有基於 PCR 技術利用 cDNA 多次復性 mRNA-cDNA 雜交等。有研究報道，針對各自選擇的高表達靶序列進行分析後，均一化處理後文庫的高豐度表達 cDNA 是處理前的0.3％～2.5％，基本滿足節約篩選的要求。
均一化 cDNA 文庫具有以下4方面的優點：第一，在經濟上具有廣泛的應用空間，可以節約大量試驗成本。第二，增加克隆低豐度 mRNA 的機會，適用於分析各種發育階段或各種組織的基因表達及突變檢測。第三，與原始豐度的 mRNA 拷貝數相對應的 cDNA 探針與均一化的 cDNA 文庫作雜交，可以估計出大多數基因的表達水平及發現一些組織特異的基因。而以往的文庫構建，忽略了 mRNA 豐度的影響。第四，可以用於遺傳圖譜的製作和進行大規模的原位雜交，作為優化的文庫系統還可以用於大規模的測序或晶元製作等研究。
2.2 差減 cDNA 文庫 (Subtractive cDNA library)
差減文庫也稱扣除文庫，使用兩種遺傳背景相同或大致相同但在個別功能或特性上不同的材料(如不同基因處理細胞系或植物的近等基因系等)提取 mRNA (或反轉錄後合成 cDNA)，在一定條件下用大大過量不含目的基因的一方作為驅動子( Driver )與含有目的基因的試驗方( Tester )進行雜交，選擇性的祛除兩部分共同基因雜交形成的復合物，往往進行多次的雜交—祛除過程，最後將含有相關目的基因的未雜交部分收集後，並連接到載體形成文庫。消減雜交是構建差減 cDNA 文庫的核心，差減文庫是否構建成功很大程度上決定於差減雜交的效率。差減雜交的方法主要有(1)羥基磷灰石柱層析法 (HAP)；(2)生物素標記、鏈親和蛋白結合排除法；(3)限制性內切酶技術相結合的差減方法；(4)差減抑制雜交法 (SSH)；(5)磁珠介導的差減法 (MAST)，其中 SSH 法最為常用。
抑制性消減雜交技術 (Suppression Subtractive Hybridization，SSH) 是 DIATCHENKO 等人於1996年依據消減雜交和抑制 PCR 發展出來的一種分離差異表達基因的新方法，主要用於分離兩種細胞或兩種組織的細胞中的差異表達基因。它主要是利用抑制 PCR 對差減雜交後豐度一致的目的材料中兩端連有不同接頭的差異表達片段進行指數擴增，而兩端連接上同一接頭的同源雙鏈片段僅呈線形擴增，從而達到富集差異表達基因的目的。因此應用該技術能夠對兩個有差異表達的材料(細胞或組織)高、中、低豐度目的基因都進行有效、快速、簡便克隆。近年來已成功應用於植物發育、腫瘤與疾病、以及外界因子誘導組織細胞中相關的應答基因的分析和克隆。
2.3 固相 cDNA 文庫構建
cDNA 的固相合成是人們早為熟知的技術，但局限之處 oligo(dT) 與纖維素膠粒或磁珠的結合比較牢固，將 cDNA 洗脫下來時得率不是很高，而且以後的反應步驟也不能都在介質上進行，這可能是該技術應用並不十分廣泛的原因。
最近 THOMAS ROEDE 提出了一種新的 cDNA 文庫固相合成方法( THOMAS ROEDE，1998)，克服了以前文庫構建中存在的缺點，所用的酶和試劑與傳統方法完全相同，不同的是 cDNA 的合成和修飾均在固相支持物—磁珠上完成。cDNA 通過一個生物素固定在鏈黴素偶聯的磁珠上，這樣在反應過程中就可以簡便而迅速的實現酶和緩沖液的更換，因此它將快速與高質量的文庫構建結合在一起(構建文庫只需1 d)，並且構建的文庫適合大多數的研究目的。
固相 cDNA 合成法的主要優點是可以簡便 cDNA 合成的操作。在進行緩沖液更換時既沒有 cDNA 的丟失之憂，也無其它物質污染之憂。另外，用此方法可以得到真實的代表性文庫，它包含有短小的 cDNA，這是因為在克隆之前省去了分級分離的步驟。總之，固相法結合了傳統的 cDNA 合成的優點並彌補了其不足。這種方法簡便易行，可靠低廉，所建文庫高質量，因此它可能會替代目前應用的 cDNA 文庫操作方法。
另外，最近發展起來的微量 RNA 的 cDNA 構建，是使用 PCR 技術，在實驗室條件下擴增的 mRNA 的 cDNA 量，其 PCR 檢測的靈敏度遠遠大於反轉錄 PCR(RT-PCR) 法。微量 RNA 的 cDNA PCR 文庫的構建可為有關微量活性物質遺傳基因的研究提供方便。
3 cDNA 文庫應用於分離新基因的方法
發現並分離克隆新基因始終是分子生物學研究的主要任務和目的，雖然 cDNA 文庫的用途很多，但是，應用於分離新基因是其最重要的用途。前述的不管是哪種類型的 cDNA 文庫，都可以用於分離新基因，只是使用的方法有差異。分離方法主要有兩種：第一，對於非全長 cDNA 文庫，即不管是經典的 cDNA 文庫方法或差減法構建的 cDNA 文庫，需要利用已經獲得的新 cDNA 序列片段，通過 RACE 方法獲得新基因的全長序列。第二，利用全長 cDNA 文庫與目的基因片段作為探針的雜交篩選。
3.1 從非全長 cDNA 文庫中篩選新基因
3.1.1 RACE 法
RACE 文庫即快速擴增 cDNA 末端法( Rapid Amplification of cDNA End，RACE )只需知道 mRNA 內很短的一段序列即可擴增出其 cDNA 的5'(5' RACE )和3'端(3' RACE )。該法的主要特是利用一條根據已知序列設計的特異性引物和一條與 mRNA 的 PolyA (3' RACE )或加至第一鏈 cDNA 3'端的同聚尾(5' RACE )互補的通用引物，由於同聚體並非良好的 PCR 引物，同時為了便於 RACE 產物的克隆，可向同聚體引物的5'端內加入一內切酶位點。所用的 cDNA 模板可以使用多聚 dT 引物延伸合成(3'，5'-RACE 均可)。當 RACE PCR 產物為復雜的混合物時，可取部分產物作模板，用另一條位於原引物內側的序列作為引物與通用引物配對進行另一輪 PCR (巢式 PCR )。早在1988年，FROHMAN 等即用此方法成功地獲得了4種 mRNA 的5'合3'末端序列。
迄今已有幾種改良的 RACE 方法，通過修飾與優化，與最初的 FROHMAN 報道有所不同：(1) BARSON 等採用鎖定寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸引物「鎖定」基因特異性序列的3'末端與其 Poly (A) 尾的連接處，進行第1條 cDNA 鏈的合成，消除了在合成第1條 cDNA 鏈時寡聚 (dT) RNA 模板 Poly (A) 尾任何部位結合而帶來的影響。(2) EDWARDS 和 TROUTT 小組利用 T4 RNA 連接酶把寡核苷酸連接到單鏈 cDNA 的5'末端，然後用一個3'末端特異性引物和一個錨定引物就可以直接對錨定連接的 cDNA 進行體外 PCR 擴增和克隆。隨後，BERTLING 等又用 DNA 連接酶代替 RNA 連接酶。這些方法都避免了在第2條 cDNA 鏈內同聚序列區互補而導致截斷 cDNA 的產生。(3) MARUYAMA 等提出 cRACE 法，採用的引物為基因特異性的，所以非特異性 PCR 產物基本上不會產生。Clontech 等公司也根據 RACE 法的更新，相繼推出了 RACE 的相應試劑盒，為克隆 cDNA 提供了方便的工具。最近 HUANG 等人即用 RACE 試劑盒克隆了一種含有類植物血凝素免疫受體 ITIM。
3.1.2 用 PCR 法從 cDNA 文庫中快速克隆基因
通過對文庫的篩選或適用簡並引物進行 PCR 反應，常常只能獲得不完整的 cDNA 片段。為了得到 cDNA 全長，常常要重新篩選文庫。重新篩選文庫工作量大，RACE 雖然為此提供可方便，但應用該方法需重新提取 mRNA 和反轉錄。而用 PCR 法從 cDNA 文庫中快速克隆基因的方法，只需提取 λ 噬菌體 DNA，按保守序列設計 PCR 引物便可將未知片段進行克隆。特別是在基因的兩端變異較大而中間某區域保守的情況下，用 PCR 法很容易獲取 cDNA 的全長。同一轉錄產物，又是存在著不同的拼接方式，通過篩庫的辦法同時將不同拼接方式的克隆篩選出來可能性較小，而使用 PCR 擴增後，有利於觀察到不同的拼接方式。另外，為研究基因在不同組織中表達情況，常根據差異顯示法找出特異的 mRNA。
3.2 從全長 cDNA 文庫中進行雜交篩選
3.2.1 標記探針 cDNA 文庫篩選法
cDNA 文庫通常塗抹到母盤培養基上，然後再把這些菌落的樣品吸印到硝酸纖維素膜或尼龍膜上；這時加入標記的探針，如果出現雜交信號，那麼從母盤上就可以把包含雜交信號的菌落分離、培養出來。以此篩選出陽性克隆，進行序列分析，以獲得 cDNA 全長。該方法能避免 PCR 擴增的非特異性擴增或錯配，是一種比較准確可靠的 cDNA 克隆方法。主要缺點是克隆過程需要一系列的酶促反應、產率低、費時長、工作量大。該方法適合於表達豐度高的基因的篩選分離。用於做標記探針的 DNA 片段可以是其它生物的基因片段，在這種情況下篩選出來的基因往往是已分離基因的同源基因；如果用於做標記探針的 DNA 片段是通過新分離蛋白質的氨基酸反推設計的 DNA 序列，或者是特異分子標記子 DNA 序列，那麼可以篩選得到新功能基因。
3.2.2 反式 PCR
反式 PCR 克隆 cDNA 全長的基因原理是：雙鏈 cDNA 合成後進行尾—尾連接，環化的 cDNA 用位於已知序列內的限制性內切酶酶切位點造成缺口或用 NaOH 處理使之變性，然後用2條基因特異性引物對重新線性化或變性的 cDNA 進行擴增。反式 PCR 的優勢在於，它採用了2條基因特異性引物，因此不易產生非特異性擴增。該方法可以快速、高效地擴增 cDNA 或基因組中已知序列兩側位置的片段。
4 小結
隨著生物及信息技術的迅速發展，尋找新基因、克隆新基因、進而研究基因的功能已成為功能基因組研究中的一項重要工作。在過去尋找新基因的方法中，以消減雜交、mRNA 差異顯示，cDNA 的代表性差異顯示分析法、差異消減展示等方法應用最廣。這些方法在新基因的發現方面都各有其獨特的優勢，可尋找出一些差異表達序列，但這些差異表達序列大部分情況都是不完整的基因。目前，比較可行而且應用較多的方法主要還是 cDNA 文庫的篩選。一方面 cDNA 文庫只代表一定時期一定條件下正在表達的基因，是整個真核基因組中的少部分序列，因此 cDNA 克隆的復雜程度比直接從基因組克隆的要小得多；另一方面由於每個 cDNA 克隆只代表一種 mRNA 序列，因此在基因克隆過程中出現假陽性的概率比較低，所以 cDNA 文庫的構建已成為當前分子生物學研究和基因工程操作的基礎。本文涉及到的有關 cDNA 文庫構建方法，是目前比較常用的，這些方法各有優缺點，研究者應根據自己的實際情況，選擇合適的技術，已達到自己預期的目的。
Ⅱ 試述從環境中篩選某種微生物並對其進行初步鑒定和研究的具體實驗步驟
用伊紅美藍培養基鑒定水中大腸桿菌
步驟如下：
①製作伊紅美藍培養基，趁熱注入培養皿中，凝成平板，待用。
②用滅過菌的錐形瓶盛取河水或溝水，按1：10稀釋。
③取0.1毫升稀釋液接種於伊紅美藍培養基上。用平板劃線分離法進行分離。
④將劃線後的培養皿倒置37℃溫箱中培養18～24小時。培養基中會出現大腸桿菌菌落，菌落中心呈暗藍黑色，發金屬光澤。
⑤將菌落接種於斜面培養基上（由營養瓊脂培養基製成）。
Ⅲ 結合你所學到的環境微生物學方面的知識，談談對環境微生物學在環境科學和環境治理領域中的應用和發展前景
摘要：微生物在環境中充當著極其重要的角色，它在自然界的生態平衡和物質循環中起著不可替代的作用。同時，在環境污染和治理方面，微生物也起著重要作用。環境微生物學的興起是微生物學與環境科學交叉發展的必然結果。它由普通微生物學發展起來的環境科學和環境工程的一門學科.它以普通微生物學為基礎，在研究微生物學一般規律的同時，著重微生物和環境之間互相作用的規律，微生物活動對環境和人類產生的有益和有害的影響以及在環境污染控制工程中有關的微生物原理的研究，是環境科學和環境工程的重要理論基礎。環境微生物學的內容十分廣泛，而且該學科近年來的發展十分迅速，一些生物學的新技術手段被不斷應用到環境微生物學領域中。
關鍵詞:環境科學；環境工程；微生物學；環境微生物學
1 微生物學的發展簡史
微生物學是研究微生物及其生命活動的科學。微生物具有種類繁多、體積微小、比表面積大、代謝類型多、代謝強度高、生長繁殖速度快、容易變異、種類多等多種特點。它廣泛分布於空氣、水、土壤、人體及動植物體內獨立或寄生生活。大多數微生物對人類和動植物是有益的，特別是它與人類的生活有密切的關系，對工農業生產、人類的生活環境與健康衛生有極大的影響[1]。
人類對微生物的利用甚早。我國在利用微生物方面，更有著豐富的經驗和悠久的歷史。早在公元前3世紀，在《呂氏春秋》里就有「儀狄作酒禹飲而甘之」之說。在公元6世紀，後魏賈思勰所著的《齊民要術》一書中就詳細記載了制曲和釀酒的技術，還記載了栽種豆科植物可以肥沃土壤，當時雖不知根瘤菌的存在，也不知固氮作用，而會利用根瘤菌積累氮肥等等。
1676年，微生物學的先驅列文虎克用自製的單式顯微鏡首次觀察到了細菌的個體，為揭開微生物世界的奧秘打開了大門，具有劃時代的意義。在之後近200年的時間里，人們對微生物的研究僅停留在出於個人愛好對一些微生物進行形態描述的低級水平上，包括細菌、原生動物和真菌，但對它們的生理活動機理及其與人類實踐活動的關系卻未加研究，因此，微生物作為一門學科在當時還未形成。
在19世紀末和20世紀初微生物學被牢固地建立起來。法國的巴斯德和德國的科赫，分別被稱為微生物學的奠基人和細菌學的奠基人。巴斯德在研究釀酒生產中酒質變酸的問題時，指出發酵是微生物的作用。巴斯德創立了培養基和玻璃器皿的滅菌方法及巴氏消毒，建立完成了稀釋和次代培養的無菌技術。為生物學的發展做出了突出的貢獻。科赫在培養細菌學的巨大貢獻是發明了用固體培養基的「細菌純培養法」和把混合培養物純化的技術，並用在固體培養基上劃線接種的方法獲得了單一的純種。這種技術使得培養細菌學發生革命性變化，並使得十九世紀最後二十年中這個學科得以開出絢麗的花朵。進入二十世紀，微生物學獲得了飛速的發展，研究重點逐漸轉移到了生化水平及分子生物學的水平上。工業微生物學與發酵工程、遺傳工程、細胞工程、酶工程和生物反應器工程一起組成了生物工程學這個當代高科技領域。
隨著社會經濟發展的需要，人們不斷加強對微生物的研究，己形成了許多微生物學的分支學科。例如有普通微生物學、微生物生理學、微生物生態學、微生物遺傳學；有病毒學、細菌學、真菌學；還有土壤微生物學、海洋微生物學；再有醫學微生物學、工業微生物學、農業微生物學、環境微生物學、石油微生物學等等， 由此可見微生物學的發展無不體現著學科的交叉，特別是相關的細胞生物學，生物化學，遺傳學及分子生物學間的相互促進，由此推動整個生命科學的飛速發展。同時物理，化學，計算機技術及材料科學的發展，為微生物學的發展提供了必要的技術手段。所以，微生物學的發展歷史是輝煌的[2~4]。
2、環境微生物學的研究內容
環境微生物學主要是介紹環境微生物學的發展和生物學基礎知識；在環境中存在的微生物主要種類和特點；微生物的生理和代謝，微生物生長和環境因子對微生物的影響；微生物的遺傳和變異，微生物的生態及其分布；在各種環境條件下微生物的存在和變化，微生物的代謝活動對環境的影響；微生物在自然界中的地位和作用，在生物地球化學循環中的作用；在環境領域中微生物所起的作用，微生物對污染物產生抗性的分子機理，以及對污染物降解的代謝途徑。
3、環境微生物學的發展
隨著人類的生活要求和工農業生產的迅速發展，大量人工合成的並難以被天然微生物迅速降解轉化的污染性化合物進入到自然環境中。嚴重威脅人類及其他生物正常生存發展。其中，普遍存在於土壤環境中的重要有機污染物如多環芳烴，農葯類等，因其致癌性，致畸性，致突變性而被認為是危險物質。分子生物學技術的應用為污染治理、防治提供了新的思路和方法[5] 。同時，污染導致資源環境中的生物重組，對環境中復雜的混合微生物群落進行及時監控和准確鑒定變得越來越重要。而分子生物學技術因其快速、准確、靈敏的特點，正逐步取代某些傳統的研究方法而被廣泛用於環境微生物的監測[6] 。
3.1與環境微生物研究相關的各種分子生物學技術
3.1.1核酸探針檢測技術
利用能與特定核苷酸序列發生特異性互補的已知核苷酸片段作探針分析DNA序列及片段長度多態性。被標記(放射性或非放射性的)的探針以原位雜交、Southern印跡雜交、斑點印跡和狹線印跡雜交等不同的方法，可直接用來探測溶液中、細胞組織內或固定在膜上的同源核酸序列。由於核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的高度靈敏性，使得核酸分子雜交技術廣泛應用於對環境中微生物的檢測，定性、定量分析它們的存在、分布、豐度和適應性等研究目標。
熒光原位雜交(FISH)是目前單個細胞水平上分析微生物群落結構的常用分子生態學方法。目前可利用FISH的方法，使用一整套特異的寡核苷酸探針可進行單個細胞的快速分類[7~8]。流式細胞計(FCM)是另一種能快速分析和分類單細胞群體的技術。適用於對有關微生物群落的組成和動態進行快速和頻繁的監測。RFLP標記基於Southern印跡雜交的技術，即DNA限製片段長度多態性，是在生物多樣性研究中廣泛應用的DNA分子標記。可作為一種能高度靈敏檢測污染環境下微生物種群變化的方法。
3.1.2 PCR及相關技術
PCR是一種體外擴增核酸序列從而得到多個核酸拷貝的技術。根據擴增的模板，引物序列來源及反應條件的不同可將PCR技術分為以下幾種：(1)反轉錄PCR技術是在mRNA反轉錄之後進行的PCR擴增，可以用來分析不同生長時期的mRNA表達狀態的相關性。(2)競爭PCR是一種定量PCR，通過向PCR反應體系中加入人工構建的帶有突變的競爭模板、控制競爭模板的濃度來確定目的模板的濃度，對目的模板作定量研究。競爭性PCR曾被用來測定受多環芳烴污染的沉降物中的編碼鄰基二酚-2，3-加雙氧酶的dmpB基因濃度[9]。(3)擴增的rDNA限制酶切分析技術，是美國最新發展起來的一項現代生物鑒定技術，它根據原核生物rDNA序列的保守性，將擴增的rDNA片段進行酶切。然後通過酶切圖譜來分析菌間的多樣性。
3.1.3電泳分離及顯示方法
除我們熟知的瓊脂糖凝膠電泳並用溴乙錠(EB)染色方法和聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE分離)銀染的方法外，還有一些通過特殊的電泳分離技術而建立的分子標記。如變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳、單鏈構象多態性等，都是通過實施一些變性條件改變DNA雙螺旋結構(如添加線性梯度的變性劑或建立變性溫度梯度等)，由於序列不同的DNA片段，其部分解鏈程度也不同，不同的結構對DNA在凝膠中遷移速率影響很大，結果不同序列的DNA片段在凝膠上得以高解析度的分離。
3.1.4 基因重組技術
利用DNA體外重組或擴增技術從供體生物基因組中分離感興趣的基因或DNA片段，或經人工合成的方法獲得基因，然後經一系列切割，加工修飾，連接反應產生重組DNA分子，再將其轉入適當的受體細胞，以期獲得基因表達的過程。此技術用於環境微生物的研究可構建出各種生物降解特性增強的重組菌用於污染環境的治理修復或發酵某些廢棄物生產天然氣。如將微生物分解纖維素和木質素的基因轉入到中溫細菌中，使發酵能在較高溫度下進行，提高轉化速度，用於蔗糖發酵生產天然氣[10] 。
3.1.5 基因晶元技術
基因晶元技術作為生物晶元技術一個發展最完備的分支，基因晶元可以分為cDNA晶元和寡核苷酸晶元cDNA晶元有多種制備方法，在基因表達相關研究方面具有重大價值;寡核苷酸晶元主要應用於雜交測序、單核苷酸多態性分析和突變檢測。基因晶元，又稱DNA微陣列，是指按照預定位置固定在固相載體上很小面積內的千萬個核酸分子所組成的微點陣陣列。在一定條件下，載體上的核酸分子可以與來自樣品的序列互補的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進行標記，在專用的晶元閱讀儀上就可以檢測到雜交信號。cDNA晶元即在玻璃片、矽片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等固相載體上固定的成千上萬個cDNA分子組成cDNA微陣列。
3.2 分子生物學技術在環境微生物研究中的應用
3.2.1重組細菌用於環境污染防治
Pseudomonas sp.P2是一株甲醯磷降解菌，羅如新等人(1999)[11]克隆了氯苯降解菌L1的鄰苯二酚1,2-雙加氧酶基因，在表達載體PKT230攜帶下轉入了P2菌中，使P2獲得高效的鄰苯二酚1,2-雙加氧酶酶活，該酶活性甚至比天然宿主還高21倍。
植物根際是一個有潛力的污染降解地點，在植物根際由植物供給能被微生物利用的營養物質使微生物繁殖，最終進行污染物的消除。在外來微生物中表達與脫毒有關的酶類也能在實地應用中提供專一選擇優勢。該例利用了小麥根際微生物對土壤中的三氯乙烯(TCE)脫毒。D.C.yec等人(1998)[12]將洋蔥伯克霍爾德菌G4的甲苯鄰單加氧酶基因轉入熒光假單子孢菌2-79中後，熒光假單孢菌比小麥根際其它菌長得好。
3.2.2 胞內酶在細胞表面表達更好發揮生物降解功能
當有重金屬存在時，較高等植物可產生相應的金屬硫蛋白(MTs)。MTs是含半胱氨酸豐富的蛋白質，能結合鎘、鉻、汞和銅等重金屬離子。在E.coli中表達MTs是一項有希望的技術，但細胞內的MTs對金屬離子的吸附能力有限。解決這一困難的一條途徑是在細胞表面表達MTs，據報道把MTs插入LamB序列的153位點而證實了這一可能性[13]，雜合蛋白的表達提高了對鎘的結合力達15~20倍，由於MTs定位於細胞表面，即使細胞死亡，仍可用於金屬的吸附和積累。有機磷廣泛用於農業製造殺蟲劑，由土壤微生物中分離到的有機磷水解酶(OPH)能有效降解這些殺蟲劑。但OPH純化所需的成本高，而用完整的細胞脫毒受到轉運有機磷通過細胞膜屏障的限制。在細胞表面表達0PH的完整細胞降解磷!硫和Paraoxon比在細胞內表達OPH的細胞快幾倍[14]。得到的酶活定位於細胞表面的生物催化劑比純化的0PH明顯更穩定，也更活躍。
3.2.2 分子生物學技術在環境微生物監測中的應用
環境中存在的大量微生物中，僅有1%可通過傳統的培養方法在培養皿上進行培養和進一步分離，而絕大多數細菌要求非常嚴格的營養條件或是難以培養 [15] PCR技術及衍生出的一系列生物技術，使得在復雜環境中對那些混合物內低含量的群體成員或生物群中某個特異基因的檢測與研究成為可能。
Fantroussi等人[16]用嵌套式PCR(nestedPCR)來監測未被污染的土壤淤泥實驗生態系中3-氯苯脫氯細菌的外源基因的種類。Selvaratnam等人[17]用編碼苯酚單加氧酶的dmpN基因的PCR擴增來檢測處理廢水的分批式反應器中的降解酚的假單胞桿菌。PCR技術還與其它方法結合應用於環境監測中。Chandler等人[18]用MPN/PCR技術來估測被燃料污染的土壤中的萘過氧化物酶基因nahAc、鏈烷單加氧酶基因alkB及dmpB的數量。PCR技術與核酸雜交技術結合，用來進一步檢測PCR擴增產物，核實被擴增的序列即目的序列。
環境微生物監測環境中微生物的研究難點是常常無法准確定性和直接定量地檢測環境中可能存在的眾多微生物種群。基因晶元技術的出現和發展為微生物學領域的研究者提供了高效快捷的技術方法，為科研迅速向縱深化發展提供了可能[19]。一些作為分子標記的基因工程菌也應用到環境生物技術中，主要用來監測投放到環境中的微生物的情況。許多學者對細菌中的熒光基因(luxgene)進行克隆，轉移到具有分解能力的特種微生物體內，具有分解能力的菌體中就有了特定的熒游標記，通過對熒光菌和熒光量的監測可以達到對專門細菌的跟蹤，並可以了解到它們與其它菌株之間在分解過程中的關系[20]。
3.2.3 分子生物技術在環境基因工程菌的穩定性和安全性研究中的應用
對轉基因生物的環境安全問題需進行長期的系統的研究，因風險的出現有長期滯後性。在關於被引入遺傳物質的穩定性和新的遺傳物質是否轉移到其他微生物中，通過生物的表型可初步判斷，進一步的證實則可以利用DNA序列分析，探針雜交等。關於生物圍堵，目的是加強對重組微生物的行為和命運的可預見性。生物圍堵系統可以是被動的，如對菌株引入培養缺陷型，recA-等突變；或是主動的系統，指向細胞中引入誘導細胞死亡的自殺基因。化學誘導自殺作為生物圍堵的基本原理，其策略是將殺傷功能與生物降解途徑的調節系統相聯系，細胞在非生物物質存在時存活(自殺基因被遏制)，但非生物物質完全降解後，自殺基因開啟，細胞死亡。
隨分子生物學技術的發展和對環境微生物研究的深入，分子生物學技術在環境微生物中的應用越來越廣泛也越來越重要。分子生物學技術的應用不僅擴大了環境微生物研究的廣度而且加大了研究的深度。隨著越來越多微生物全部基因序列的解碼，對各種細菌體內降解基因的分布和表達會有更深入的了解，這方面技術的成熟必將對環境微生物的研究有一個整體的系統的生態水平上的認識，必將使研究更具目標性，應用更具可控性[21]。
Ⅳ 環境微生物群落heatmap圖怎麼畫
稀釋性曲線（Rarefaction Curve）採用對測序序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數與它們所能代表OTU的數目構建曲線，即稀釋性曲線。當曲線趨於平坦時，說明測序數據量合理，更多的數據量對發現新OTU的邊際貢獻很小；反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU。橫軸：從某個樣品中隨機抽取的測序條數；"Label 0.03" 表示該分析是基於OTU 序列差異水平在0.03，即相似度為97% 的水平上進行運算的，客戶可以選取其他不同的相似度水平。縱軸：基於該測序條數能構建的OTU數量。曲線解讀：Ø 圖1中每條曲線代表一個樣品，用不同顏色標記；Ø 隨測序深度增加，被發現OTU 的數量增加。當曲線趨於平緩時表示此時的測序數據量較為合理。2. Shannon-Wiener 曲線反映樣品中微生物多樣性的指數，利用各樣品的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數構建曲線，以此反映各樣本在不同測序數量時的微生物多樣性。當曲線趨向平坦時，說明測序數據量足夠大，可以反映樣品中絕大多數的微生物物種信息。橫軸：從某個樣品中隨機抽取的測序條數。縱軸：Shannon-Wiener 指數，用來估算群落多樣性的高低。Shannon 指數計算公式：其中，Sobs= 實際測量出的OTU數目；ni= 含有i 條序列的OTU數目；N = 所有的序列數。曲線解讀：Ø 圖2每條曲線代表一個樣品，用不同顏色標記，末端數字為實際測序條數；Ø 起初曲線直線上升，是由於測序條數遠不足覆蓋樣品導致；Ø 數值升高直至平滑說明測序條數足以覆蓋樣品中的大部分微生物。3.Rank-Abundance 曲線用於同時解釋樣品多樣性的兩個方面，即樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長度來反映，曲線越寬，表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻程度由曲線的形狀來反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高。橫軸：OTU 相對豐度含量等級降序排列。縱軸：相對豐度比例。曲線解讀：Ø 圖3與圖4中每條曲線對應一個樣本（參考右上角圖標）；Ø 圖3與圖4中橫坐標表示的是OTU（物種）豐度排列順序，縱坐標對應的是OTU（物種）所佔相對豐度比例（圖3為相對百分比例，圖4為換算後Log值），曲線趨於水平則表示樣品中各物種所佔比例相似；曲線整體斜率越大則表示樣品中各物種所佔比例差異較大。4. 樣本群落組成分析：多樣本柱狀圖/ 單樣本餅狀圖 根據分類學分析結果，可以得知一個或多個樣品在各分類水平上的物種組成比例情況，反映樣品在不同分類學水平上的群落結構。柱狀圖（圖5）橫軸：各樣品的編號。縱軸：相對豐度比例。圖標解讀：Ø 顏色對應此分類學水平下各物種名稱，不同色塊寬度表示不同物種相對豐度比例；Ø 可以在不同分類學水平下作圖分析。餅狀圖（圖6）在某一分類學水平上，不同菌群所佔的相對豐度比例。不同顏色代表不同的物種。5. 樣品OTU 分布Venn 圖用於統計多個樣品中共有或獨有的OTU數目，可以比較直觀地表現各環境樣品之間的OTU 組成相似程度。不同樣品用不同顏色標記，各個數字代表了某個樣品獨有或幾種樣品共有的OTU 數量，對應的OTU編號會以EXCEL 表的形式在結題報告中呈現。分析要求單張分析圖，樣本分組至少兩個，最多5 個。Ø 默認設置為97% 相似度水平下以OTU 為單位進行分析作圖。6. Heatmap 圖用顏色變化來反映二維矩陣或表格中的數據信息，它可以直觀地將數據值的大小以定義的顏色深淺表示出來。將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度來反映多個樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。相對豐度比例：熱圖（圖8）中每小格代表其所在樣品中某個OTU 的相對豐度。以圖8為例，紅框高亮的小格所對應的信息為：樣本（R11-1Z）中OTU（OTU128）的相對豐度比例大概為0.2%。豐度比例計算公式（Bray Curtis 演算法）：其中，SA,i = 表示A樣品中第i個OTU所含的序列數SB,i = 表示B樣品中第i個OTU所含的序列數樣品間聚類關系樹：進化樹表示在選用成圖數據中，樣本與樣本間序列的進化關系（差異關系）。處於同一分支內的樣品序列進化關系相近。物種/OTU 豐度相似性樹：豐度相似性樹表示選用成圖的數據中樣品與樣品中的OTU 或序列在豐度上的相似程度。豐度最相近的會分配到同一分支上。客戶自定義分組：根據研究需求對菌群物種/OTU 研究樣本進行二級分組Ø 二級物種/OTU 分組：將下級分類學水平物種或OTU 分配到對應的上級分類學水平，以不同顏色區分；Ø 二級樣品分組：根據研究需要，對樣品進行人為的分組，以不同顏色區分。7. 主成分分析PCA (Principal Component Analysis)在多元統計分析中，主成分分析是一種簡化數據集的技術。主成分分析經常用於減少數據集的維數，同時保持數據集中對方差貢獻最大的特徵，從而有效地找出數據中最「主要」的元素和結構，去除噪音和冗餘，將原有的復雜數據降維，揭示隱藏在復雜數據背後的簡單結構。通過分析不同樣品的OTU 組成可以反映樣品間的差異和距離，PCA 運用方差分解，將多組數據的差異反映在二維坐標圖上，坐標軸為能夠最大程度反映方差的兩個特徵值。如樣品組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。橫軸和縱軸：以百分數的形式體現主成分主要影響程度。以圖9為例，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）是造成四組樣品（紅色，藍色，黃色和綠色）的兩個最大差異特徵，貢獻率分別為41.1% 和27.1%。十字交叉線：在圖9中作為0 點基線存在，起到輔助分析的作用，本身沒有意義。圖例解讀：Ø PCA 分析圖是基於每個樣品中所含有的全部OTU 完成的；Ø 圖9中每個點代表了一個樣本；顏色則代表不同的樣品分組；Ø 兩點之間在橫、縱坐標上的距離，代表了樣品受主成分（PC1 或 PC2）影響下的相似性距離；Ø 樣本數量越多，該分析意義越大；反之樣本數量過少，會產生個體差異，導致PCA分析成圖後形成較大距離的分開，建議多組樣品時，每組不少於5個，不分組時樣品不少於10個；Ø 圖10中的圓圈為聚類分析結果，圓圈內的樣品，其相似距離比較接近。8. RDA/ CCA 分析圖基於對應分析發展的一種排序方法，將對應分析與多元回歸分析相結合，每一步計算均與環境因子進行回歸，又稱多元直接梯度分析。主要用來反映菌群與環境因子之間的關系。RDA 是基於線性模型，CCA是基於單峰模型。分析可以檢測環境因子、樣品、菌群三者之間的關系或者兩兩之間的關系。橫軸和縱軸：RDA 和CCA 分析，模型不同，橫縱坐標上的刻度為每個樣品或者物種在與環境因子進行回歸分析計算時產生的值，可以繪制於二維圖形中。圖例解讀：Ø 冗餘分析可以基於所有樣品的OTU作圖，也可以基於樣品中優勢物種作圖；Ø 箭頭射線：圖11中的箭頭分別代表不同的環境因子（即圖中的碳酸氫根離子HCO3-，醋酸根離子AC-等，圖中的其它環境因子因研究不同代表的意義不同，因此不再贅述）；Ø 夾角：環境因子之間的夾角為銳角時表示兩個環境因子之間呈正相關關系，鈍角時呈負相關關系。環境因子的射線越長，說明該影響因子的影響程度越大；Ø 圖11中不同顏色的點表示不同組別的樣品或者同一組別不同時期的樣品，圖中的拉丁文代表物種名稱，可以將關注的優勢物種也納入圖中；Ø 環境因子數量要少於樣本數量，同時在分析時，需要提供環境因子的數據，比如 pH值，測定的溫度值等。9. 單樣品/ 多樣品分類學系統組成樹根據NCBI 提供的已有微生物物種的分類學信息資料庫，將測序得到的物種豐度信息回歸至資料庫的分類學系統關系樹中，從整個分類系統上全面了解樣品中所有微生物的進化關系和豐度差異。單樣品圖（圖12）：可以了解單樣品中的序列在各個分類學水平上的分布情況。圖例解讀：Ø 圖12中不同的層次反映不同的分類學水平；Ø 分支處的圓面積說明了分布在該分類學水平，且無法繼續往下級水平比對的序列數量，面積越大，說明此類序列越多；Ø 每個分支上的名詞後面的兩組數字分別表示比對到該分支上的序列數和駐留在該節點上的序列數；Ø 圖13中為某單一水平物種分布情況，並非是序列分布。多樣品圖（圖14）：比對多個樣品在不同分類學分支上序列數量差異。圖例解讀：Ø 比對不同樣品在某分支上的序列數量差異，通過帶顏色的餅狀圖呈現，餅狀圖的面積越大，說明在分支處的序列數量越多，不同的顏色代表不同的樣品。Ø 某顏色的扇形面積越大，說明在該分支上，其對應樣品的序列數比其他樣品多。Ø 多樣品在做該分析時，建議樣品數量控制在10個以內，或者將重復樣本數據合並成一個樣本後，總樣品數在10個以內。10.系統發生進化樹在分子進化研究中，基於系統發生的推斷來揭示某一分類水平上序列間鹼基的差異，進而構建進化樹。
Ⅳ 測了細菌的基因組 全序列,然後怎麼做呢
你的目的是什麼？
一般測全基因組後就應該將這些數據組裝起來，成為一個完整的基因組序列。然後可以測轉錄組，標記能夠轉錄的區域，並對應這些可能的「基因區域」尋找近源物種的基因進行比對，注釋功能。若發現新基因則可通過定點敲除手段驗證新基因的功能。注釋基因組結束後可以和近緣微生物的基因序列進行比較，確定該微生物的進化關系和分類地位。
Ⅵ 微生物群落多樣性測序數據怎麼處理
微生物群落多樣性測序數據怎麼處理
微生物群落測序是指對微生物群體進行高通量測序，通過分析測序序列的構成分析特定環境中微生物群體的構成情況或基因的組成以及功能。藉助不同環境下微生物群落的構成差異分析我們可以分析微生物與環境因素或宿主之間的關系，尋找標志性菌群或特定功能的基因。對微生物群落進行測序包括兩類，一類是通過16s rDNA，18s rDNA，ITS區域進行擴增測序分析微生物的群體構成和多樣性；還有一類是宏基因組測序，是不經過分離培養微生物，而對所有微生物DNA進行測序，從而分析微生物群落構成，基因構成，挖掘有應用價值的基因資源。以16s rDNA擴增進行測序分析主要用於微生物群落多樣性和構成的分析，目前的生物信息學分析也可以基於16s rDNA的測序對微生物群落的基因構成和代謝途徑進行預測分析，大大拓展了我們對於環境微生物的微生態認知。目前我們根據16s的測序數據可以將微生物群落分類到種（species）（一般只能對部分菌進行種的鑒定），甚至對亞種級別進行分析，幾個概念：16S rDNA（或16S rRNA）：16S rRNA 基因是編碼原核生物核糖體小亞基的基因，長度約為1542bp，其分子大小適中，突變率小，是細菌系統分類學研究中最常用和最有用的標志。16S rRNA基因序列包括9個可變區和10個保守區，保守區序列反映了物種間的親緣關系，而可變區序列則能體現物種間的差異。16S rRNA基因測序以細菌16S rRNA基因測序為主,核心是研究樣品中的物種分類、物種豐度以及系統進化。OTU：operational taxonomic units (OTUs)在微生物的免培養分析中經常用到，通過提取樣品的總基因組DNA，利用16S rRNA或ITS的通用引物進行PCR擴增，通過測序以後就可以分析樣品中的微生物多樣性，那怎麼區分這些不同的序列呢，這個時候就需要引入operational taxonomic units，一般情況下，如果序列之間，比如不同的 16S rRNA序列的相似性高於97%就可以把它定義為一個OTU，每個OTU對應於一個不同的16S rRNA序列，也就是每個OTU對應於一個不同的細菌（微生物）種。通過OTU分析，就可以知道樣品中的微生物多樣性和不同微生物的豐度。測序區段：由於16s rDNA較長（1.5kb），我們只能對其中經常變化的區域也就是可變區進行測序。16s rDNA包含有9個可變區，分別是v1-v9。一般我們對v3-v4雙可變區域進行擴增和測序，也有對v1-v3區進行擴增測序。
Ⅶ 美吉微生物多樣性中如何上傳自己的環境因子
首先，登錄NCBI主頁面後點擊Submit進入到數據上傳頁面，然後選擇SRA資料庫點擊GO按鈕後接著點擊New submission；
第二步：填寫提交人的個人信息和單位信息；
第三步：填寫BioSample、BioProject和數據釋放時間（之前沒有創建BioSample、BioProject可以選擇NO）；
第四步：項目信息填寫，根據實際情況填寫（帶有*號的為必填，其它可以不填寫）；
第五步：樣本類型選擇；
第六步：樣本具體信息，需要我們下載表格填寫，表格中綠色的為必填，藍色的需要至少填一個，其它內容可以選填或者不填寫，如果是生物學重復需要添加一列replicate,填寫完成後需要將信息粘貼到文本文件中（TXT格式），然後上傳到網站上；
Ⅷ 如何驗證環境有大量微生物並寫出具體方法步驟
空氣中微生物的檢測
（一)實驗目的 (1)了解空氣中微生物的分布狀況。 (2)比較普通實驗室和無菌室空氣中存在的微生物的數量和種類。 (3)驗證無菌操作法在微生物學實驗中的重要性。
（二）實驗原理 在我們周圍的環境中存在著種類繁多、數量龐大的微生物。空氣中也不例外。雖然空氣不是微生物棲息的良好環境。但由於氣流、灰塵和水沫的流動，人和動物的活動等原因，仍有相當數量的微生物存在。當空氣中個體微小的微生物落到適合於它們生長繁殖的固體培養基的表面時，在適溫下培養一段時間後，每一個分散的菌體或孢子就會形成一個個肉眼可見的細胞群體即菌落。觀察大小、形態各異的菌落，就可大致鑒別空氣個存在的微生物的種類。本實驗通過檢測普通實驗室和消毒後的無菌室空氣中存在的微生物，從而判斷無菌室的消毒效果，了解空氣中常見的微生物類群。
（三)實驗器材 (1)培養基： 1)牛肉膏蛋白腖培養基。 2)馬鈴薯蔗糖培養基。 (2)器材：無菌平皿若干套，酒精燈，培養箱等。
(四〕實驗方法 (1)倒平板：按常法配置上述培養基，分裝於三角瓶中，高壓滅菌備用。臨用前將培養基熔化，冷卻至50℃左右，倒平板若干個備用。 (2)檢測：先將無菌室的紫外燈打開，照射15min後關閉。打開上述冷凝了的無菌平板的皿蓋，讓其在無菌室空間和無人走動的普通實驗室空間分別暴露Ih後，蓋上皿蓋。要求每種培養基的平板在每個空間設3個重復。 (3)培養：將細菌培養基平板和真菌培養基平板分別置37℃和28℃的培養箱中倒置培養，1—2d後開始連續觀察，注意不同類別的菌落出現的順序及菌落的大小、形狀、顏色、干濕等的變化。
如果是其他環境中的菌株,比如 土壤 植被 動物毛發 生活器具,可以取少量以上樣品 在無菌水中振盪半小時,然後取其上清液塗布於無菌平板表面.
Ⅸ 對環境樣品中的微生物進行PCR克隆測序後，用什麼軟體比較序列劃分OTU
clastal，treeview等等
Ⅹ 高通量測序中如何判斷土壤微生物數量的多少
在陸地生態系統中，在土壤中生活有數量龐大的微生物種群，包括原核微生物如細菌、藍細菌、放線菌及超顯微結構微生物, 以及真核生物如真菌、藻類( 藍藻除外) 、地衣等。它們與植物和動物有著明確的分工，主要扮演「分解者」的角色，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學反應，擔負著地球C、N、P、S 等物質循環的「調節器」[1 ]、土壤養分植物有效性的「轉化器」和污染環境的「凈化器」等多方面生態功能[2 ]。土壤微生物是氣候和土壤環境條件變化的敏感指標，土壤微生物群落結構和多樣性及其變化在一定程度上反映了土壤的質量。土壤微生物多樣性一般包括微生物分類群的多樣性、遺傳(基因) 多樣性、生態特徵多樣性和功能多樣性[3 ]。由於土壤微生物的復雜性、土壤本身的多變性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人們對土壤微生物多樣性的研究與動、植物相比遠遠落後。隨著多聚酶鏈反應(PCR)、核酸測序等現代生物學分子生物學技術的迅速發展, 人們對土壤微生物多樣性有了更多的了解；高通量測序技術的發展則為研究土壤宏基因組提供了大量數據，為直接探究土壤中的微生物群落結構提供了客觀而全面的信息。
一、對土壤微生物進行研究的方法
1、微生物平板培養法
傳統的土壤生態系統中微生物群落多樣性及結構分析大多是將微生物進行分離培養，然後通過一般的生物化學性狀，或者特定的表現型來分析，局限於從固體培養基上分離微生物。
這種方法只限於極少量（0.1%-1%）可以培養的微生物類群，無法對絕大多數微生物的分類地位和系統發育關系的深入研究。
2、分子生物學技術結合測序的方法
在過去的20多年裡，分子生物學技術，尤其16SrDNA技術已經廣泛應用於鑒定未知菌的研究中。20世紀80年代以來, 逐步建立起了以分子系統發育分析為基礎的現代微生物分子生態學的研究方法, 如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、熒光原位雜交技術(FISH)、基因晶元(Microarry) 、磷脂脂肪酸圖譜分析( Phospholipid fatty acid, PLFA) 、穩定同位素探針( Stable Isotope Probing, SIP) 、PCR-DGGE/TGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 等, 使得研究者能夠在分子水平上對土壤微生物多樣性進行研究。
其中運用比較廣泛並被普遍認可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在於，檢測的DNA片段長度范圍以200bp ～900bp為佳，超出此范圍的片段難以檢測[4]，PCR 擴增所需G/C 鹼基對含量至少達40 % ，通常只能檢測到環境中優勢菌群的存在，只有占整個群落細菌數量約1％或以上的類群能夠通過DGGE檢測到[5]。TGGE 儀器所允許的溫度范圍為15 ℃～80 ℃，較大片段DNA 的Tm 值因為接近80 ℃而使檢測難度提高；若電泳條件不適宜，不能完全保證將有序列差異的DNA片段分開，從而出現序列不同的DNA 遷移在同一位置的現象。
3、高通量測序方法
近年來，16S rRNA/DNA為基礎的分子生物學技術已成為普遍接受的方法[6,7 ]。研究表明，400～600鹼基的序列，足以對環境中微生物的多樣性和種群分類進行初步的估計[8]，因此454高通量測序的方法因其讀長（400~500bp）長和准確性高的特點大量用於微生物多樣性的研究。
有了微生物16S rDNA序列，不論是全長還是部分，都可以提交到GenBank採用BLAST程序與已知序列進行相似性分析。Gen Bank將按照與測得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應的微生物種類，但更為精確的微生物分類還取決於系統發育分析(phylogenetic analysis)。
高通量測序的優越性體現在：測序序列長，可以覆蓋16S /18S rDNA、ITS等高變區域； 測序通量高，可以檢測到環境樣品中的痕量微生物；實驗操作簡單、結果穩定，可重復性強；無需進行復雜的文庫構建，微生物DNA擴增產物可以直接進行測序，實驗周期短；測序數據便於進行生物信息分析。
該方法得到頂級期刊的認可（Nature等），已成為土壤微生物多樣性檢測的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，為客戶提供的土壤樣本進行高通量測序並進行生物信息學分析。高通量測序因其數據量大，操作過程簡單，盡可能避免了繁瑣的實驗操作過程所造成的樣本損失，能夠相對客觀的反應出土壤樣本的真實情況。
二、高通量測序在土壤微生物研究中的應用
1、 研究土壤微生物的物種多樣性
微生物物種多樣性主要從對微生物類群即細菌、真菌和放線菌這三大類群的數量及其比例組成來描述微生物多樣性，或者按照微生物在生態系統中的作用將其劃分成不同的功能群(function group)，通過某一功能群中物種的分類及其數量來研究土壤微生物多樣性，如對土壤中的產甲烷細菌、固氮菌、根瘤菌等的多樣性進行研究。以下是幾篇具有代表性的文章。
Roesch等[9]採用454測序法對西半球的一個大的橫斷面的4類土壤進行檢測和統計學評價。結果表明，這4種土壤中，最豐富的微生物類群擬桿菌綱、β-變形菌綱和α-變形菌綱。與農業土壤相比，森林土壤的微生物多樣性更為豐富，然而檢測結果表明森林土壤中的古生菌多樣性較少，僅為該位點所有序列的0.009%，而農業土壤的比例則為4% -12%。
土壤中細菌的多樣性差距非常大，因土壤結構的不同土壤中的細菌群體也呈現出多樣化。Triplett等[10]基於焦磷酸測序法來對16S rRNA的V2-V3區域進行測序，估測9個草地土壤中的菌群的整體和垂直特性。對所有752,838條數據序列進行聚類分析，探索菌群在豐度、多樣性和組成成分等方面的特異性。作者發現在不同的土壤層中，細菌系統發生的種群或者亞群的不同分配是與土壤的性質有關的，包括有機碳含量、總含氮水平或者微生物生物量。
2、研究土壤微生物功能多樣性
土壤微生物功能多樣性指包括微生物活性、底物代謝能力及與N、P、S 等營養元素在土壤中轉化相關的功能等, 通過分析測定土壤中的一些轉化過程, 如有機碳、硝化作用以及土壤中酶的活性等來了解土壤微生物功能。
氨氧化反應是硝化作用的第一步，也是全球氮循環中由微生物活動形成硝化鹽的重要進程。Leininger[11]檢測了3個氣候區域12塊原始和農業用地的土壤里編碼氨單加氧酶(amoA)的一個亞基的基因豐度。採用反向轉錄定量PCR研究及無需克隆的焦磷酸測序技術對互補DNA測序，證實古細菌的氨氧化活性要遠高於細菌，證實Crenarchaeota可能是土壤生態系統中最富有氨氧化活性的微生物。
Urich等[12]採用基於RNA的環境轉錄組學方法同時獲得土壤微生物種群結構和功能信息。結果認為，通過該方法可以同時研究微生物生種群結構與功能從而避免其他方法所造成的偏差。群落基因組學分析可以通過研究微生物基因組序列與某些表達特徵之間的關系，獲得一些微生物功能方面的信息。但同時也需要運用其他方法將特定功能與具有這種特定功能的微生物群落結構對應起來。對rRNA表達基因和與環境因素相關的主要酶類的基因進行定量化和比較分析，將能了解微生物結構與特定功能之間的關系，如硝化、反硝化和污染物降解。
反硝化作用是參與到氮流失和溫室氣體排放等氮循環過程的重要流程之一。通過宏基因組測序的方法，結合分子檢測和焦磷酸測序，Ryan等分離鑒定了操縱編碼反硝化過程的酶類。通過篩選77,000個土壤宏基因組文庫中得到的克隆，最終分離並鑒定了9個參與反硝化作用的酶簇[13]。
3、 研究環境的突然變化對土壤微生物菌群的影響
環境的突然改變會導致微生物群落的結構和功能發生變化。Zachary等[14]以重水穩定同位素探測技術（H218O-SIP）鑒定與土壤增濕相關的細菌。通過液相色譜/質譜（LC-MS），作者確定H218O中的氧原子結合到了所有的DNA結構成分中。盡管這種結合不是均勻的，還是可以明顯的將標記了18O和未標記的DNA區分開來。作者發現DNA和細胞外的H2O中的氧原子在體外沒有發生交換，表明摻入DNA的18O是相對穩定的，並且摻入到細菌DNA中的18O的比例較高（48-72h）。土壤增濕後，對土壤中16S rRNA進行高通量測序，發現Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相對比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例則降低。作者通過控制土壤濕度的動態變化，對微生物菌群的結構發生變化進行研究和生態類群的劃分。