如何篩選能高效降解石油的微生物

❶ 如何設計篩選高效降解某種有機物的微生物實驗方案

生物降解是指由生物催化的復雜化合物的分解過程。而在石油降解中微生物首先通過自身的代謝產生分解酶，裂解重質的烴類和原油，降低石油的粘度。

另外在其生長繁殖過程中，能產生諸如溶劑、酸類、氣體、表面活性劑和生物聚合物等有效化合物利於驅油，然後由其他的微生物進一步的氧化分解成為小分子而達到降解的目的。

注意事項：

海洋中最主要的降解細菌屬於：無色桿菌屬、不動桿菌屬、產鹼桿菌屬、節桿菌屬、芽孢桿菌屬、黃桿菌屬、棒桿菌屬、微桿菌屬、微球菌屬、假單胞菌屬以及放線菌屬、諾卡氏菌屬。在大多海洋環境中，上述這些細菌是主要降解菌。

在真菌中，金色擔子菌屬、假絲酵母屬、紅酵母屬和擲孢酵母屬是最普遍的海洋石油烴降解菌。一些絲狀真菌如麴黴屬、毛霉屬、鐮刀霉屬和青黴屬也應被歸入海洋降解菌中。土壤中主要的降解菌除了上面提到的細菌種類外，還包括分枝桿菌屬以及大量絲狀真菌。麴黴屬和青黴屬某些種在海洋和土壤兩種環境中都有分布。木霉屬和被孢霉屬某些種是土壤降解菌。

❷ 如何利用微生物勘探石油和提高採油量

微生物採油對低產、枯竭油田特別有吸引力，能提高採收率。

4
、不污染環境

微生物採油技術不污染環境，不損害油地層，可在同一油藏區或同一油井中反復使用。

（三）採油微生物的生物學特性

用於油田開採的微生物一般具有以下鮮明的生物學特徵：

1
、厭氧或兼性厭氧。在地層無氧條件下能生長繁殖並進行厭氧發酵，在地上有氧條件下也
能生長繁殖。

2
、在油層高溫、高壓、高鹽等極端環境下能生長繁殖並代謝。

3
、多數採油微生物能以烴類作碳源，能以貯油層

內的無機鹽作氮源或作營養元素。

4
、採油微生物必須與其注入油層的環境條件相配伍相適應，要在油層內能運移，能生長繁
殖，能產生有機酸、氣體、表面活性物質、生物聚合物、有機溶劑等多種代謝產物。能在
50°
以上的溫度及缺氧條件下生長的中度嗜鹽細菌，是微生物採油中最常用的菌種。

（四）微生物採油技術

微生物採油技術是指將篩選的微生物或微生物代謝產物注入油藏，
經微生物的代謝活動
和產生的代謝產物，
作用於原油，
改變原油的某些物理化學特性，
從而提高原油採收率的技
術。

根據實施過程與方法的不同，
微生物採油技術可分為地上微生物採油技術和地下微生物
採油技術。

1
、地上微生物採油技術

地上微生物採油技術是指在地上通過微生物發酵、生產微生物的某種代謝產物，如生物
多糖聚合物或生物表面活性劑，
然後將發酵產品注入油藏而提高原油採收率。
該技術的實質
是利用選育的優

良菌種在地上發酵生產採油制劑的技術。

目前，地上微生物採油技術主要是在地上發酵生產採油中廣泛應用微生物多糖和微生物
表面活性劑。

（
1
）微生物多糖

據研究，
有百種以上的微生物能產生結構、
性能各異的胞外多糖。
能產胞外多糖的主要
微生物類群是：明串珠菌屬、黃單胞菌屬、固氮菌屬和小核菌屬等。

採油工業中應用最廣泛的微生物多糖是：
腸膜明串珠菌或葡聚糖明串珠菌產生的右旋糖
酐葡聚糖、
普魯蘭出芽短梗霉產生的普魯蘭糖、
齊整小核菌或葡聚糖小核菌產生的小核菌葡
聚糖。採油中最具開發應用潛力的是野油菜黃單胞菌產生的胞外多糖黃原膠。

（
2
）微生物表面活性劑與乳化劑

以烴為碳源的微生物是生物表面活性劑的重要來源。
因為石油微生物必須分泌表面活性
劑，才能促使烴與水乳化。烴只有均勻地分散在水中，才能被石油微生物吸收利用。所以石
油微生物是表面活性劑最豐富的基因庫。

假單胞菌屬、節桿菌屬、不動桿菌屬和棒桿菌屬等是產生生物表面活性劑

的主要微生
物類群。微生物產生的生物表面活性劑就其化學組成來分，主要可分為糖脂類和脂肽類

。
分子的極性端或是多羥基的糖類或是氨基酸類，
非極性端是長鏈脂肪酸的長鏈烴部分。
微生
物表面活性劑的粗製品或純品注入貯油岩層，
作用於油一岩石一水三相體系，
降低油水界面
張力，增強油水乳化，提高原油採收率。

2
、地下微生物採油技術

地下微生物採油（
MEOR
）技術是指將在地上模擬油藏條件篩選的微生物菌種與營養物
注入油藏，
微生物在油藏中運移，生長繁殖，
產生多種代謝產物，
作用於原油而提高原油采
收率；
或用生長繁殖的菌體細胞及代謝產物封堵貯油岩層大的孔道，
調整水驅油剖面；
或只
將營養物注入油藏，激活油藏內的原生微生物，靠其生命活動提高原油採收率。

根據單井增產措施的處理方法和提高原油採油率的要求，地下微生物採油可分為
6
類：

（
1
）單井周期注人微生物採油

為提高低產油井的原油日產量，
在油井高壓注入採油微生物，
關井，
使微生物運移到油
井周圍直徑
10m
左右的貯油岩層，經微生物的生命活動，疏通被堵塞的油層空隙通道，增
加原油的流動性，提高原油採收率。
為了保持高產，需要不間斷地、周期性地注入採油微生
物。

（
2
）微生物驅油

採油微生物從注水井注入油層，
微生物隨注水向油井貯油層深部移動，
同時進行生長繁
殖，並產生多種代謝產物。細胞和代謝產物綜合作用於原油，降低黏度，增加原油流動性，
提高原油採收率。

（
3
）激活油藏微生物群落驅油

油藏中存在著天然的微生物群落，
但由於營養物質貧乏，
數量很少。
從注水井將營養物
注入油層，激活天然微生物群落，讓其生長繁殖，產生多種代謝產物驅油。

（
4
）微生物選擇性封堵

將體形較大且產生表面黏稠物質的微生物菌種從注水井注入，
運移到大孔道或有溶洞的
貯油岩層部位，用生長繁殖的大菌體細胞和表面黏稠物質形成的生物膜封堵大孔道或溶洞，
防止注入水
「
指狀
」
流動，提高原油採收率。

（
5
）微生物壓裂液壓裂

將厭氧條件下大量產生有機酸的微生物及營養物注入空隙度甚小、滲透率很低的貯油
層，在高壓下用有機酸溶解岩層使之形成縫隙，有利於原油流動，提高原油採收率。

（
6
）微生物油井清蠟

原油中含蠟量較高，
會析出蠟晶固著在井壁，
堵塞貯油層通往井壁的空隙通道，
降低原
油流動性，
減少單井原油日產量。
注入產生表面活性劑或溶劑的採油微生物，
用其代謝產物
表面活性劑、乳化劑清洗井壁，溶解固形石蠟，提高原油採收率。

（五）微生物在石油污染中的生物修復作用

1
降解石油的微生物種類及分布

據目前的研究
,
能降解石油的微生物有
70
個屬
,
其中
28
個屬細菌
, 30
個屬絲狀真菌
, 12
個屬酵母
,
共
200
多種微生物。海洋中最主要的降解細菌有：無色桿菌屬
(Achromobacter)
、
不
動
桿
菌
屬

(Acinetobacter)
、
產
鹼
桿
菌
屬
(Alcaligenes)
等
;
真
菌
中
有
金
色
擔
子
菌
屬
(Aureobasidium)
、假絲酵母屬
(Candida)
等。石油降解菌通常生長在油水界面上
,
而不是油液
中。據丁美麗等
[5]
在膠州灣的實驗證明
,
膠州灣的石油降解菌在表層水體中的最高值可達

4.6×
102
個
/mL
。

石油降解菌數量僅與海水的石油污染情況有關。
石油降解微生物的種類和
數量對海洋中石油的降解有明顯的影響。
一般情況下
,
混合培養的微生物對石油的降解比純
培養的微生物快
,
但是崔俊華等在實驗中篩選出了
7
株高效原油降解菌。

2
石油降解菌的作用

（
1
）作為油污染的生物指示

以往大多數調查結果表明
,
在海洋中石油烴降解細菌的數量或種群與水域受到油類物
質污染的程度有密切關系
,
通常在被油污染的水域中
,
石油烴降解細菌的數量明顯地高於非
油污染的水域。

烴類降解菌數和異養細菌數的比值能在一定程度上反映水域受油污染的狀
況。

丁美麗等在膠州灣的工作以及史君賢等在浙江省海島海域的工作都證明了這一點。石
油污染可以誘導石油降解菌的增殖及生長
,
Atlas
報道在正常環境下降解菌一般只佔微生物
群落的

1%,
而當環境受到石油污染時
,
降解菌比例可提高到
10%
。說明石油污染可以使降
解菌發生富集
,
降解菌可以作為石油污染的生物指示。

（
2
）通過自身代謝作用降解石油

向水體中投加菌種凈化水體的技術是從清除海洋石油污染開始的。
實驗室研究表明
,
單
一菌劑除油率為

20%
～
50%,
而混合菌劑除油率可達

71.4%
。
丁明宇等
[8]
從青島近海海水中
分離、

篩選到

73
株細菌和

10
株真菌
,
並對其降解石油的能力進行了研究
,
結果表明
,
多
數菌具有明顯的降解石油的能力
,
其中
,
有

3
個菌株對石油的生物降解率分別高達
58.35%
、

62.75%
、

71.06%
。史君賢等
[9]
在浙江沿海海水中分離石油烴降解細菌
,
並實驗
證明降解菌對正烷烴有明顯的降解作用
,
混合菌株的降解率明顯高於單菌株的降解率。在
20
℃的條件下
,
經過

21d
後
,
絕大部分的正烷烴被降解
,
總的降解率為

94.93%,
其中細菌
的降解率為

75.67%,
理化降解率為
19.26%
。在實施接種的現場生物修復處理中
, 1990
年在
墨西哥灣和

1991
年在得克薩斯海岸都獲得了成功
,
現場觀察表明
,
在開放水體中添加降解
菌是有效的。

（
3
）合成生物表面活性劑
,
加速石油的降解

生物表面活性劑
(Biosurfactants,
簡稱

BS)
是細菌、

真菌和酵母在某一特定條件下
(
如合
適的碳源、

氮源、

有機營養物、

pH
值以及溫度
) ,
在其生長過程中分泌出的具有表面活

性的代謝產物。
生物表面活性劑可以強化生物修復
,
它能將烴類物質乳化
,
進而促進其降解
,
尤其適合處理海上溢油。
Chabrabarty
曾報道
,
由

Pscndomona
acruginosa
(
銅綠假單胞菌
)
生成的一種生物表面活性劑
(
海藻糖酯
)
由於能有效地將石油分散成水液滴
,
因而可促進石油
污染海岸的生物修復
,
大大提高了

Exxon
Valdez
原油泄漏造成的阿拉斯加污染區域石油烴
的降解速度。

（
4
）基因工程菌

基因工程菌是將不同細菌的降解基因進行重組
,
將分屬於不同細菌個體中的污染物代
謝途徑組合起來以構建具有特殊降解功能的超級降解菌
,
可以有效地提高微生物的降解能
力
,
從而提高生物修復效果。

通常石油降解菌只能降解某一種石油成分
,
並且由於石油的種類不同
,
所需降解菌也不
相同
,
天然環境中存在的石油降解菌不能高效地降解多種石油成分
,
使基因工程菌的出現成
為必然。同時
,
復雜的烴類化合物混合物的降解需要有混合菌株的參與
,
但不同菌株之間可
能會產生競爭或拮抗作用
,
從而對降解產生負面影響。使用基因工程菌可以避免此類問題。

目前
,
已有人在實驗室條件下獲得基因工程菌並在實驗室取得滿意的降解效果。
例如美
國的

Chakrabaty
等使用具有

CAM
、

OCT
、

XAL
和

NAH4
種降解質粒的

「
多質粒超級
菌
」
,
可以使海上浮油在幾個小時內降解
,
而在自然條件下這些浮油需要

1a
時間才能被降
解。這項技術取得了美國的專利權。但是考慮到在開放環境中使用基因工程菌的安全問題
,
目前基因工程菌的使用僅限於實驗室
,
尚不能大規模使用。

另外
,
目前在研製基因工程菌時
,
都採用給細胞增加某些遺傳缺陷的方法或是使用攜帶一段
「
自殺基因
」
,
使該工程菌。在非
指定底物或非指定環境中不易生存或發生降解作用。

3
微生物降解石油的方式

石油烴化合物可分為

4
類
:
飽和烴、

芳香族烴類化合物、樹脂及瀝青質。其中
,
短鏈
的飽和烴在溢油發生初期通過揮發等作用進入大氣
,
其他的石油烴中
,
飽和正烷烴最易降解
,
其次是分支烷烴
,
再次是低分子量芳香烴
,
多環芳烴很難降解
,
樹脂和瀝青質極難被降解。

直鏈烷烴的降解方式主要有

3
種
:
末端氧化、

亞末端氧化和氧化。
芳香烴在好氧條件
下先被轉化為兒茶酚或其衍生物
,
然後再進一步被降解。
高分子量多環芳烴降解菌報道很少
,
許多四環或多環高分子量多環芳烴的降解是以共代謝
(Cometabolism)
的方式進行的。但是共
代謝完全是間接或偶然的事件
,
並且風險較大
,
可能會產生比母體毒性更大的化學物質。

樹
脂和瀝青質極難被降解
,
但是有報道稱
,
有著復雜構造的樹脂和瀝青質也能受到某種程度的
分解
[14]
。

冷凱良等的實驗表明
,
微生物降解原油代謝產物主要是乙酸和棕櫚酸為主的脂肪酸與
鼠李糖形成的糖脂類表面活性劑。

4
石油降解菌的獲得

由於天然海洋環境中石油降解菌數量較少
,
一旦發生溢油
,
不能及時對石油進行降解
,
所以
在溢油發生後一般要向環境中添加石油降解菌以保證石油的高效降解
,
但是考慮到安全等
方面的問題
,
菌種不能盲目投加。

一般來說
,
可以把取自自然界的微生物
,
經人工培養後再
投入到污染環境中去治理污染。

具體到海洋石油降解菌的獲得
,
一般為
:
首先選擇油污染環
境
,
從中分離出適應性菌株
,
並將其中的石油降解菌富集培養
,
通過反復適應和馴化或遺傳
修飾進行進一步篩選
,
從而培養出高效降解的菌株
,
將其進一步繁殖後投加至受污染環境中
或分類保存。

根據微生物與石油的作用機制
,
選擇高效降解微生物的標准包括：

( 1)
對石油有較高的耐性。

( 2)
對海洋環境的適應性較強。

( 3)
對石油的降解效率高
,
專一性強。

( 4)
不影響海洋環境中原有的生物多樣性。

雖然微生物修復主要是依靠微生物的降解能力降解污染物
,
但是微生物對污染物的分
解、轉化也是需要條件的
,
所以除了投加高效降解菌之外
,
還要為這些降解菌創造必要的生
存、

降解條件。這樣才能有效地進行石油污染修復。

5
影響微生物降解石油污染物的因素

微生物在降解石油污染物的過程會受到營養元素、表面活性劑、
O
2
通量、溫度、
pH
值
等外界因素的影響。其中
,
營養元素對降解率的影響較大，尤其是
N
、
P
元素。
何良菊等專門
對石油烴微生物降解的營養平衡進行了研究，
表明氮、
磷營養物質的缺乏直接限制了石油烴
的微生物降解
,
但添加過量反而有抑製作用
,
因而存在一個經濟合理的添加量及添加比例，實
驗表明氮磷比在
5
∶
1~6
∶
1
比較適宜，
,
無機氮源比有機氮源好，硝酸鹽形式的氮比銨態的
氮更合適。而國內有其他研究卻更傾向於氮磷比為
1
：
1
，且最佳氮源為氯化銨，最佳磷源
為磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀。兩種研究得出的結果不一致。

表面活性劑是影響降解效率的又一重要因素。表面活性劑對石油烴具有一定的增溶和
分散作用，
從而對石油降解菌的降解效率有重要作用，
而有研究則指出表面活性劑對微生物
存在一定毒害作用。
劉慶新等通過研究，
表明表面活性劑的加量多少對石油烴降解菌的影響
比較復雜：
加少量的表面活性劑會促進石油烴降解菌的生長，
但隨著表面活性劑加量的增加
,
菌量反而減少，證實了上述論斷。

在自然環境中，大多數的石油烴類是在好氧條件下被降解的，但是微生物對石油烴的
降解在有氧及缺氧兩種情況下都會進行，
最近有研究表明厭氧降解對飽和烴及芳香烴有著極
為重要的作用。

能降解石油的微生物有嗜冷菌、嗜熱菌和嗜中溫菌，因此在溫度低於
0
℃和在
70
℃左
右的環境中均有能降解石油的微生物，大多數石油降解菌屬嗜中溫菌，最適溫度在
30
℃上
下，溫度過高過低都會對降解效率產生抑制。

普遍認為石油降解菌是產酸菌，且適宜生長於中鹼性環境中。劉慶新等研究得最佳
pH
值為
8.0
，而其文章中也指出與一般認為的
7.0
不符。而
Stapleton
[20]
等發現在
pH 2.0
的一處
土樣中，萘和甲苯仍然被降解為
CO
2
和
H
2
O
。

6
生物降解石油烴污染物的應用

利用生物降解石油烴類污染物最早見於
20
世紀

80
年代末美國在

Exxon
Vadez
油輪
石油泄露的生物修復項目中，
該項目在短時間內清除了污染，
治理了環境，
是生物修復成功
應用的開端，同時也開創了生物修復在治理海洋污染中的應用。
20
世紀
90
年代以來，生物
修復技術在石油污染治理方面逐漸成為核心，
取得了理論突破和重要成果。
國內學者也做了
大量工作，但主要為石油污染土壤和地下水的生物修復研究
[38]
，對海洋石油污染的生物修
復研究相對較少，
而且研究工作也大多停留在實驗室模擬實驗的水平上。
閆毓霞利用土著微
生物對勝利油田含油污泥進行修復實驗；黃廷林等
[40]
對黃土地區石油污染土壤進行了室內
模擬生物修復研究。

石油降解菌在實際應用中存在著很多問題，集中表現在投加高效石油降解菌來處理污
染時：投加菌面臨與土著微生物的競爭作用；投加菌需要適應新的生長環境；

投加菌要經
受環境污染物的毒性影響。這些壓力使接種的外源微生物的存活率很低或者活性較弱
,
限制
了它的實際應用。

7
展望

石油降解菌降解石油烴類污染物具有物理、化學方法所不具備的優點，它高效、經濟、
安全、
無二次污染，
在機械裝置無法清除的薄油層而且化學葯劑被限制使用時，
生物法處理
溢油的優越性便更加顯著，
具有廣闊的研究及應用前景。
目前國內外對石油降解菌的研究呈
現出一定特點：

(1)
對一般性降解菌研究多，對極端環境下的石油降解微生物研究少，尤其是對低溫、
耐鹽的石油降解菌。中國北方的大部分濕地，鹽鹼程度比較高，常年氣溫（尤其冬季）氣溫
較低，
而無論是來源海上還是來源於石油化工的污染都比較嚴重。
在這種條件下的石油降解
菌研究具有很廣闊的前景。

(2)
對石油降解菌的研究多而應用少。
對石油降解菌的所有研究到最終肯定要歸結到實
際應用中去，
目前國內很多學者都對石油降解菌的單純研究感興趣，
同時出現了大量的重復
研究。國外已有成功應用先例，證明石油降解菌可以用來修復實際污染，國內仍止步不前，
難於踏出實際應用的第一步。

隨著大量學者的不斷研究，對石油降解菌的認識肯定會不斷深化，其應用也會逐漸成熟

❸ 為什麼要密封培養能降解石油的微生物

（1）在長期被石油污染的土壤中生存下來的微生物，能降解石油，所以土壤取樣時，應從含石油多的土壤中採集．
（2）篩選和純化該類微生物，應選用以石油作為微生物生長的唯一碳源的選擇培養基．
（3）該類微生物是厭氧微生物，接種後應密封培養；培養一段時間後在培養基上可形成降油圈，降油圈越大，說明該處的微生物降解石油的能力越強，所以應選擇降油圈大的菌落進行培養以獲得高效菌株．
故答案為：
（1）長期被石油污染（含石油多的）
（2）石油作為微生物生長的唯一碳源
（3）厭氧型 降油圈大的菌落

❹ 處理石油的微生物有哪幾種墨西哥石油泄漏，英國石油公司採取的方法

用於脫硫的微生物及脫硫機理
已從煉油廠污水處理的活性污泥、煤焦油污染的或煤礦附近的土壤、溫泉、實驗室培養菌中篩選分離出一些可用於脫硫的微生物，其中大多數微生物對脫除無機硫及非雜環硫較有效，對雜環硫的脫除效果甚微. 少數可脫雜環中有機硫的微生物有兩種氧化方式: C-C鍵斷裂氧化和C-S鍵斷裂氧化. 在前一途徑中, DBT的一個芳香環被氧化降解, 雜環硫不從環中脫除, 而是生成水溶性3-羥基-2-醛基-苯噻吩除去, 導致烴燃燒值降低. 而在後一途徑中雜環硫被脫出但不引起芳香環碳骨架的斷裂, 這是一個較為理想的途徑，因此受到重視.
脫除無機硫的微生物主要是化能自養菌屬Thiobacillus sp.以及嗜熱硫化裂片菌屬Sulfolobus sp.中的一些菌. 這些菌氧化無機硫化物有間接作用和直接作用兩種作用機理. 間接作用機理為細菌氧化溶解Fe2+，生成的強氧化劑Fe3+再將硫化物氧化生成S0，然後Fe2+又被氧化，沉積在煤和石油中的硫再被Fe3+氧化生成水溶性硫酸鹽. 直接氧化的機理則為細菌直接與硫化物的含硫部位接觸, 在細菌生物膜內作用生成還原性谷光甘肽(GSH)的二硫衍生物GSSH，GSSH被一氧化酶氧化並水解成亞硫酸鹽，亞硫酸鹽又被氧化為硫酸鹽，生成的還原性輔酶被細胞色素氧化還原劑中的溶解氧再氧化. 細菌的直接作用著重於還原性硫的酶氧化. 這兩種途徑作用的產物都是水溶性的，因此，脫硫的同時也脫除了燃料中的金屬.
研究較多的脫有機硫菌有以有機硫化物(主要是DBT)作為碳源斷C-C鍵的Pseudomonas sp.和Brevibacterium sp.菌，還有以DBT作為唯一硫源的專一性斷CS鍵的Rhodococcus Strain, Sulfolobus Scidocaldarius., Desulfovibrio desulfuricans M6及Corynebacterium sp.菌\. 微生物脫有機硫有兩種途徑，由於中間產物和終產物的不同，C-S鍵專一斷裂途徑中又可能存在三個不同序列.

參考資料： 石油和煤微生物脫硫技術的研究進展 姜成英, 王蓉, 劉會洲, 陳家鏞 石油生物催化脫硫技術是採用微生物體內的酶來催化氧化油品中的有機硫，使之轉化為水溶性硫化物加以除去，從而實現生物催化脫硫。
該技術在美國已實現了工業化，與加氫脫硫技術相比其設備投資低50%，操作費用降低15%。

❺ 如何用牛肉膏蛋白腖培養基篩選,分離一種能降解石油的細菌,你認為應如何做

石油的成分太復雜了。不過裡面大部分是有機成分，碳源氮源都有，如果篩選的話你應該可以選出來很多。因為不同的菌可能會利用石油裡面的不同物質。如果想篩選的話可以按照以下步驟。

1. 配製固體培養基：成分為基本無機營養鹽，瓊脂（高級點的，裡面不能有雜質）， 加一定濃度的滅過菌的石油。倒平板。這個平板上碳源氮源都只是石油，所以是選擇培養基。

2. 取1mL石油，稀釋10，100，1000，10000倍，每種稀釋液取100uL塗平板。一個做三個重復，看看有沒有東西長出來。

3. 有長出來的話，根據形態觀察，挑選不同的再分別繼續塗在平板上純化，分離。

補充：結果是你可能會得到非常多的細菌。。。先去網上搜一下已有的文獻吧，別直接動手。實驗設計比做實驗更重要。

❻ 研究被石油污染過的土壤中細菌數量，並從中篩選出能分解石油的細菌．為了分離和純化高效分解石油的細菌，

（1）培養基滅菌突觸使用用高壓蒸汽滅菌，為篩選出能分解石油的細菌，所以石油是唯一碳源．
（2）接種細菌常用的方法有平板劃線法和稀釋塗布平板法．圖B為平板劃線法，如圖甲所示．
（3）步驟⑤進一步操作是為篩選出分解石油能力最好的細菌，微生物計數可用稀釋塗布平板法和血球計數板計數法．
故答案為：
（1）高壓蒸汽滅菌 石油是唯一碳源
（2）平板劃線法和稀釋塗布平板法甲
（3）篩選出分解石油能力最好的細菌稀釋塗布平板法 顯微鏡直接計數（血球計數板計數法） 血細胞計數板（血球計數板）

❼ 運用所學的微生物學知識談談如何從環境中分離能降解硝基苯(或石油)的細菌

用硝基苯（石油）加水做培養基，能夠在上面生長的微生物就有可能降解硝基苯（石油），把這些微生物再分離，分類，純化，分別實驗，最終分離出有用的微生物。

❽ 功能微生物篩選過程及應用價值

菌株分離（separation）就是將一個混雜著各種微生物的樣品通過分離技術區分開，並按照實際要求和菌株的特性採取迅速、准確、有效的方法對他們進行分離、篩選，進而得到所需微生物的過程。菌株分離、篩選（screening）雖為兩個環節，但卻不能絕然分開，因為分離中的一些措施本身就具有篩選作用。工業微生物產生菌的篩選一般包括兩大部分：一是從自然界分離所需要的菌株，二是把分離到的野生型菌株進一步純化並進行代謝產物鑒別。 ? {cF'RB.
在實驗工作中，為使篩選達到事半功倍的效果，總的說來可從以下幾個途徑進行收集和篩選： 4jis\W}%L3
（1）向菌種保藏機構索取有關的菌株，從中篩選所需菌株。 ^5u} 
（2）由自然界採集樣品，如土壤、水、動植物體等，從中進行分離篩選。 O|%><I?I
（3）從一些發酵製品中分離目的菌株，如從醬油中分離蛋白酶產生菌，從酒醪中分離澱粉酶或糖化酶的產生菌等。該類發酵製品經過長期的自然選擇，具有悠久的歷史，從這些傳統產品中容易篩選到理想的菌株。 rN$_(%m_N
菌株的分離和篩選一般可分為采樣、富集、分離、產物鑒別幾個步驟。 8*4X%a=O f
第一節 含微生物樣品的採集 Q?7U iTZ
自然界含菌樣品極其豐富，土壤、水、空氣、枯枝爛葉、植物病株、爛水果等都含有眾多微生物，種類數量十分可觀。但總體來講土壤樣品的含菌量最多。 G+^HZ4jg
一、從土壤中采樣 $0D]d.w=
土壤由於具備了微生物所需的營養、空氣和水分，是微生物最集中的地方。從土壤中幾乎可以分離到任何所需的菌株，空氣、水中的微生物也都來源於土壤，所以土壤樣品往往是首選的採集目標。一般情況下，土壤中含細菌數量最多，且每克土壤的含菌量大體有如下的遞減規律：細菌（108）>放線菌（107）>黴菌（106）>酵母菌（105）>藻類（104）>原生動物（103），其中放線菌和黴菌指其孢子數。但各種微生物由於生理特性不同，在土壤中的分布也隨著地理條件、養分、水分、土質、季節而有很大的變化。因此，在分離菌株前要根據分離篩選的目的，到相應的環境和地區去採集樣品。 M*8Ef^-U`t
（一）根據土壤特點 8_8 R$ =V
1．土壤有機質含量和通氣狀況 &'c1"%*%8>
一般耕作土、菜園土和近郊土壤中有機質含量豐富，營養充足，且土壤成團粒結構，通氣飽水性能好，因而，微生物生長旺盛，數量多，尤其適合於細菌、放線菌生長。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落葉多，有機質豐富，且陰暗潮濕，適合黴菌、酵母菌生長繁殖，微生物數量相應也比較少。 VCNg`6!x
從土層的縱剖面看，1～5cm的表層土由於陽光照射，蒸發量大，水分少，且有紫外線的殺菌作用，因而微生物數量比5～25cm土層少；25cm以下土層則因土質緊密，空氣量不足，養分與水分缺乏，含菌量也逐步減少。因此，采土樣最好的土層是5～25cm。一般每克土中含菌數約幾十萬到幾十億個，並且各種類型的細菌和放線菌幾乎都能分離到。如好氣芽孢桿菌、假單胞菌、短桿菌、大腸桿菌、某些嫌氣菌等。但總的說來酵母菌分布土層最淺，約5～10cm，黴菌和好氧芽孢桿菌也分布在淺土層。 \@GA;~x.b
2.土壤酸鹼度和植被狀況 -fT]}T6=
土壤酸鹼度會影響微生物種類的分布。偏鹼的土壤（pH7.0～7.5）環境，適合於細菌、放線菌生長。反之在偏酸的土壤（pH7.0以下）環境下，黴菌、酵母菌生長旺盛。由於植物根部的分泌物有所不同，因此，植被對微生物分布也有一定的影響。如番茄地或腐爛番茄堆積處有較多維生素C生產菌。葡萄或其他果樹在果實成熟時，其根部附近土壤中酵母菌數量增多。豆科植物的植被下，根瘤菌數量比其他植被下占優勢。 m:)v>vu
3．地理條件 bh3}[O,L A
南方土壤比北方土壤中的微生物數量和種類都要多，特別是熱帶和亞熱帶地區的土壤。許多工業微生物菌種，如抗生素產生菌，尤其是黴菌、酵母菌，大多從南方土壤中篩選出來。原因是南方溫度高，溫暖季節長，雨水多，相對濕度高，植物種類多，植被覆蓋面大，土壤有機質豐富，造成得天獨厚的微生物生長環境。 +0;6
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4．季節條件 75jq+O_:
不同季節微生物數量有明顯的變化，冬季溫度低，氣候乾燥，微生物生長緩慢，數量最少。到了春天隨著氣溫的升高，微生物生長旺盛，數量逐漸增加。但就南方來說，春季往往雨水多，土壤含水量高，通氣不良，即使有微生物所需的溫度、濕度，也不利於其生長繁殖。隨後經過夏季到秋季，約有7～10個月處在較高的溫度和豐富的植被下，土壤中微生物數量比任何時候都多，因此，秋季采土樣最為理想。 /3L1Un*
（二）采樣方法 z
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用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5～25處的土樣10～25，裝入事先准備好的塑料袋內紮好。北方土壤乾燥，可在10～30處取樣。給塑料袋編號並記錄地點、土壤質地、植被名稱、時間及其他環境條件。一般樣品取回後應馬上分離，以免微生物死亡。但有時樣品較多，或到外地取樣，路途遙遠，難以做到及時分離，則可事先用選擇性培養基做好試管斜面，隨身帶走。到一處將取好的土樣混勻，取3～4撒到試管斜面上，這樣可避免菌株因不能及時分離而死亡。 &Op, ?\ 
二．根據微生物生理特點采樣 wbyY?tH
1.根據微生物營養類型 %r=uS.+hrF
每種微生物對碳\氮源的需求不一樣,分布也有差異。研究表明，微生物的營養需求和代謝類型與其生長環境有著很大的相關性。如森林土有相當多枯枝落葉和腐爛的木頭等，富含纖維素，適合利用纖維素作碳源的纖維素酶產生菌生長；在肉類加工廠附近和飯店排水溝的污水、污泥中，由於有大量腐肉、豆類、脂肪類存在，因而，在此處采樣能分離到蛋白酶和脂肪酶的產生菌；在麵粉加工廠、糕點廠、酒廠及澱粉加工廠等場所，容易分離到產生蛋白酶、糖化酶的菌株。若要篩選以糖質為原料的酵母菌，通常到蜂蜜、蜜餞、甜果及含糖濃度高的植物汁液中采樣。在篩選果膠酶產生菌時，由於柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有較多的果膠，因此，從上述樣品的腐爛部分及果園土中采樣較好。若需要篩選代謝合成某種化合物的微生物，從大量使用、生產或處理這種化合物的工廠附近採集樣品，容易得到滿意的結果。在油田附近的土壤中就容易篩選到利用碳氫化合物為碳源的菌株。Hartman等人曾從乙烯氯化物的工廠附近分離到一株以乙烯氯化物為碳源和能源的分枝桿菌。含1%乙烯氯化物的空氣通過該菌培養可除去93%的毒性。也有人從含油污泥中篩選出能以20#機械潤滑油為惟一碳源的3株石油降解菌菌株，分別為動膠菌屬（Zoogloea sp.）、氮單胞菌屬（Azomonas sp.）和假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。當然，也可將一種需要降解的物質作為樣品中微生物的惟一碳源或氮源進行富集，然後分離篩選。 X2}\i5{
此外，不少微生物對碳源的利用是不完全專一的，如以油脂為碳源的某些脂肪酶產生菌同樣也可以分解澱粉或其他糖類物質獲得能源而生長。以石油等碳氫化合物為碳源的油田微生物，也可以利用一些糖類為碳源。具有以上特性的微生物在一般土壤、水、及其他樣品中也會存在。不過數量較少。 \ ExM.T
2.根據微生物的生理特性 w-C ~ Ik
在篩選一些具有特殊性質的微生物時，需根據該微生物獨特的生理特性到相應的地點采樣。如篩選高溫酶產生菌時，通常到溫度較高的南方，或溫泉、火山爆發處及北方的堆肥中採集樣品；分離低溫酶產生菌時可到寒冷的地方，如南北極地區、冰窖、深海中采樣；分離耐壓菌則通常到海洋底部采樣。因為深海中生活的微生物能耐很高的靜水壓，如從海中篩到一株水活微球菌（Micrococcus aquivivus）,它能在600個大氣壓下生長。分離耐高滲透壓酵母菌時，由於其偏愛糖分高、酸性的環境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜餞或甘蔗渣堆積處采樣。如有人曾在花蜜中分離到一株能耐30%高糖的耐高滲透壓的酵母菌。 AE={P*g
三、特殊環境下采樣 @{iws@.
1．局部環境條件的影響 jr bEJ.
值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和環境條件綜合因素的影響之外，還要受局部環境條件的影響。如北方氣候寒冷，年平均溫度低，高溫微生物相對較少。但在該地區的溫泉或堆肥中，卻會出現為數眾多的高溫微生物。氧氣充足的土層中按理只適合於好氧菌生長，實際上也有一些嫌氣菌生活，原因是好氣菌生長繁殖消耗了土層中大量氧氣，為嫌氣菌創造了局部生長的有利環境，故一般土壤中也能分離到嫌氣菌。 X/ gIH/
海洋對於微生物來說是一個特殊的局部環境，盡管許多微生物也是經河水、污水、雨水或塵埃等途徑而來，但由於海洋獨特的高鹽度、高壓力、低溫及光照條件，使海洋微生物具備特殊的生理活性，相應也產生了一些不同於陸地來源的特殊產物。前蘇聯學者發現，20%～50%的海鞘、海參體內的微生物可產生具有細菌毒性和殺菌活性的化合物。此外，美國馬里蘭大學也曾從海綿體內的共生或共棲的細菌中分離到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物質。日本發現深海魚類腸道內的嗜壓古細菌，80%以上的菌株可以生產EPA 和DHA，最高產量可達36%和24%。筆者從鱈魚腸道中分離到一株pj20細菌，產EPA14.78mg/L，在15℃培養時EPA占脂肪酸的12.7%。日本也從海洋Thraustochvtrium aureum中篩選到一株產DNA達290mg/L的菌株。從海洋中采樣時，可參考其中不同種類微生物的分布規律：表層多為好氣異養菌，底層由於有機質豐富，硫化氫含量高，厭氣性腐敗菌和硫酸鹽還原菌較多，兩層中則多為紫硫菌。 u_;*Ay
具有特殊性質的微生物通常分布在一些特殊的環境中。如得克薩斯州中南部的一個岩洞中存在著大量嗜鹼性的，能進行氨氧化和產幾丁質酶的微生物，其原因是這里生活這2000萬只蝙蝠，它們每晚吃釣5萬lb（磅）昆蟲，其排泄物造成了洞內0m深的豐富營養層，這種特殊的環境對該種微生物起了選擇和富集的作用。還有人從侵蝕木船的一種蠕蟲腸道中分離到既能固氮又能降解纖維素的微生物。從考拉(Koala)熊腸中也曾分離到萜烯分解酶的產生菌，這可能因為考拉專吃含有高萜烯的桉樹類植物，給該種微生物創造了一個適宜的生長環境。美國從用硝酸處理過的花生殼中分離到一株節桿菌，該菌以木質素為唯一碳源，它對處理過的花生殼的消化率可達到63%，再加入釀酒酵母使其蛋白質含量達到13.6%，可作為牛、豬、雞飼料的添加劑。 |NJe4lw+?
2．極端環境條件的影響 MqGF~h|+
微生物一般在中溫、中性pH條件下生長。但在絕大多數微生物所不能生長的高溫、低溫、高酸、高鹼、高鹽或高輻射強度的環境下，也有少數微生物存在，這類微生物被稱為極端微生物。生活所處的特殊環境，導致它們具有不同與一般微生物的遺傳特性、特殊結構和生理機能，因而在冶金、采礦及生產特殊酶制劑方面有著巨大的應用價值。 Z.am^Q^Y!
嗜冷菌（thermophiles）的最適生長溫度為15℃，在0℃也可生長繁殖，最高溫度不超過20℃。主要分布於寒冷的環境中，如南北兩極地區、冰窟、高山、深海和土壤等低溫環境中。這類微生物在低溫發酵時可生產許多風味食品且可節約能源及減少中溫菌的污染。最適生長pH在8.0以上，通常在pH9～10之間的微生物，稱之為嗜鹼菌（alkaliphiles）。大量不同類型的嗜鹼菌已經從土壤、鹼湖、鹼性泉甚至海洋中分離得到。由於大部分鹼湖伴有高鹽，許多嗜鹼菌同時也是嗜鹽菌。該類菌所產生的酶如耐鹼蛋白酶和鹼性纖維素酶可作為洗滌劑的舔加成分，也可將鹼性澱粉酶用於紡織品工業。嗜鹼菌中的基因還可以用來調節其他細菌中基因產物的表達和分泌。嗜熱微生物是嗜熱菌最好的來源。有人從溫泉和海底火山口分離出了極端嗜熱菌。從義大利境內的噴硫磺氣的火山口中分離到一種原始的微生物，在pH2和90℃時生長最好，其代謝類型極不尋常，既能作為耗氧型自養菌將硫氧化成硫酸，使自己增殖，又能作為厭氧菌用氫還原硫，生成H2S。 l=8)_z;~D
第二節 含微生物樣品的富集培養 $#2ik~]>
富集（enrichment）培養是在目的微生物含量較少時，根據微生物的生理特點，設計一種選擇性培養基，創造有利的生長條件，使目的微生物在最適的環境下迅速地生長繁殖，數量增加，由原來自然條件下的劣勢種變成人工環境下的優勢種，以利分離到所需要的菌株。 v_)a=I%o&2
富集培養主要根據微生物的碳、氮源、pH、溫度、需氧等生理因素加以控制。一般可從以下幾個方面來進行富集。 ;ZHKTOoK
一、控制培養基的營養成分 )67_yHW
微生物的代謝類型十分豐富，其分布狀態隨環境條件的不同而異。如果環境中含有較多某種物質，則其中能分解利用該物質的微生物也較多。因此，在分離該類菌株之前，可在增殖培養基中人為加入相應的底物作惟一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的營養而迅速繁殖，其他微生物則由於不能分解這些物質，生長受到抑制。當然，能在該種培養基上生長的微生物並非單一菌株，而是營養類型相同的微生物群。富集培養基的選擇性只是相對的，它只是微生物分離中的一個步驟。 sDT(3{)L7
現舉兩例，如要分離水解酶產生菌，可在富集培養基中以相應底物為惟一碳源，加入含菌樣品，給目的微生物以最佳的培養條件（pH、溫度、營養、通氣等）進行培養。能分解利用該底物的菌類得以繁殖，而其他微生物則因得不到碳源無法生長，菌數逐漸減少。此時分離將得到所需的微生物。又如要分離耐高滲酵母菌，由於該類菌在一般樣品中含量很少，富集培養基和培養條件必須嚴密設計。首先要到含糖分高的花蜜、糖質中去取樣。富集培養基為5%～6%的麥牙汁，30%～40%葡萄糖，pH3～4，在20～25℃溫度下進行培養，可以達到富集的目的。 , mEFp_a+
在富集培養時，還需根據微生物的不同種類選用相應的富集培養基，如澱粉瓊脂培養基通常用於絲狀真菌的增殖，配方為（%）：可溶性澱粉4，酵母浸膏0.5，瓊脂2，pH6.5～7.0。在配製時要特別注意酵母浸膏加量，過多會刺激菌絲生長，而不利於孢子的產生。 Y:[WwX|
根據微生物對環境因子的耐受范圍具有可塑性的特點，可通過連續富集培養的方法分離降解高濃度污染物的環保菌。如以苯胺作惟一碳源對樣品進行富集培養，待底物完全降解後，再以一定接種量轉接到新鮮的含苯胺的富集培養液中，如此連續移接培養數次。同時將苯胺濃度逐步提高，便可得到降解苯胺占優勢的菌株培養液，採用稀釋塗布法或平板劃線法進一步分離，即可得到能降解高濃度苯胺的微生物。移種的時間既可根據底物的降解情況，也可通過微生物的生長情況確定。如在分離環己烷降解菌時，樣品經環己烷為惟一碳源的培養基富集後，培養液由原來的無色變為渾濁的乳白色。同時錐行瓶壁上也可觀察到微生物的生長情況。此時可以2%的接種量移入新鮮的富集培養基中繼續培養。連續富集培養的方法雖耗時較長，有時甚至需要6～7個月，但效果較好。通過該方法分離DDT、甲基對硫磷（MP）及其他一些污染物的分解菌，也都取得了滿意的結果。 W6ZXb_X
二、控制培養條件 OSk:njyC[
在篩選某些微生物時，除通過培養基營養成分的選擇外，還可通過它們對pH、溫度及通氣量等其他一些條件的特殊要求加以控制培養，達到有效的分離目的。如細菌、放線菌的生長繁殖一般要求偏鹼（7.0～7.5），黴菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）。因此，富集培養基的pH值調節到被分離微生物的要求范圍不僅有利於自身生長，也可排除一部分不需要的菌類。 P1;T-.X~&
分離放線菌時，可將樣品液在40℃恆溫預處理20分鍾，有利於孢子的萌發，可以較大的增加放線菌數目，達到富集的目的。 ,cPNZ-%
篩選極端微生物時，需針對其特殊的生理特性，設計適宜的培養條件，達到富集的目的。 3p{N7/z(
一般所篩選的微生物通常是好氧菌，但有時也需分離厭氧菌。因嚴格厭氧菌不僅可省略通氣、攪拌裝置，還可節省能耗。這時除了配置特殊的培養基外，還需准備特殊的培養裝置，創造一個有利於厭氧菌的生長環境，使其數量增加，易於分離。 WJ=DTON

三、抑制不需要的菌類 vA@Kb3 ,
在分離篩選的過程中，除了通過控制營養和培養條件，增加富集微生物的數量以有利於分離外，還可通過高溫、高壓、加入抗生素等方法減少非目的微生物的數量，使目的微生物的比例增加，同樣能夠達到富集的目的。 Kdh(vNB>
從土壤中分離芽孢桿菌時，由於芽孢具有耐高溫特性，100℃很難殺死，要在121℃才能徹底死亡。可先將土樣加熱到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h，殺死不產芽孢的菌種後再進行分離。在富集培養基中加入適量的膽鹽和十二烷基磺酸鈉可抑製革蘭陽性菌的生長，對革蘭陰性無抑製作。分離厭氧菌時，可加入少量硫乙醇酸鈉作為還原劑，它能使培養基氧化還原電勢下降，造成缺氧環境，有利於厭氧菌的生長繁殖。 9+"D8 J7
篩選黴菌時，可在培養基中加入四環素等抗生素抑制細菌，使黴菌在樣品的比例提高，從中便於分離到所需的菌株；分離放線菌時，在樣品懸浮液中加入10滴10%的酚或加青黴素（抑制G+菌）、鏈黴素（抑制G-菌）各30～50U/ml，以及丙酸鈉10μg/ml（抑制黴菌類）抑制黴菌和細菌的生長。另外據報道，重鉻酸鉀對土壤真菌、細菌有明顯的抑製作用，也可用於選擇分離放線菌。在分離除鏈黴菌以外的放線菌時，先將土樣在空氣中乾燥，再加熱到100℃保溫1h，可減少細菌和鏈黴菌的數量。分離耐高濃度酒精和高滲酵母菌時，可分別將樣品在高濃度酒精和高濃度蔗糖溶液中處理一段時間，殺死非目的微生物後再進行分離。 LO]D XW 9
對於含菌數量較少的樣品或分離一些稀有微生物時，採用富集培養以提高分離工作效率是十分必要的。但是如果按通常分離方法，在培養基平板上能出現足夠數量的目的微生物，則不必進行富集培養，直接分離、純化即可。 3{RuR+yi
第三節 微生物的分離 }uo5rB5D
經富集培養以後的樣品，目的微生物得到增殖，佔了優勢，其他種類的微生物在數量上相對減少，但並未死亡。富集後的培養液中仍然有多種微生物混雜在一起，即使佔了優勢的一類微生物中，也並非純種。例如同樣一群以油脂為碳源的脂肪酶產生菌，有的是細菌，有的是黴菌，有的是芽孢桿菌，有的不產芽孢，有的生產能力強，有的生產能力弱等等。因此，經過富集培養後的樣品，也需要進一步通過分離純化，把最需要的菌株直接從樣品中分離出來。 Mm`jk%:%]

❾ （1）有些細菌可分解原油，從而消除由原油泄漏造成的土壤污染．某同學欲從污染的土壤中篩選出能高效降解

（1）①高壓蒸汽滅菌的條件是壓力升至102.9kPa（1.05kg/cm²），溫度達121～126℃，維持20～30分鍾．
②篩選能降解原油的菌株，可以將樣品稀釋液置於以原油為唯一碳源的固體培養基中培養．
③菌株的接種方法，常用的有兩種：平板劃線法和稀釋塗布平板法．
④菌株分解周圍的營養物質，出現分解圈，分解圈大說明該菌株的降解能力強
（2）①在以木糖為唯一碳源的培養基中，只有能分解木糖的酵母菌能生存，可以用來選擇能分解木糖的酵母菌．
②利用質粒標記基因表達的標記性狀可以判斷目的基因是否成功導入受體細胞，故應該選擇缺乏尿嘧啶合成能力的釀酒酵母作為受體菌．
③轉基因釀酒酵母能利用這葡萄糖和木糖進行發酵且對酒精耐受能力強，故應該接種在以葡萄糖和木糖為碳源的培養基中進行發酵能力測試．隨著發酵的持續進行，若該釀酒酵母能夠存活，說明它能利用葡萄糖和木糖產生酒精，且對酒精的耐受能力強．
故答案為：
（1）①121℃；1.05kg/cm² 15
②原油
③平板劃線法和稀釋塗布平板法
④強
（2）①以木糖為唯一碳源
②尿嘧啶合成
③葡萄糖和木糖 利用葡萄糖和木糖產生酒精，且對酒精耐受能力強