微生物計數如何消除抑菌活性

『壹』 如何判定哪些葯品需要做控制菌檢測

品微生物限度檢查是控製品質量的一個重要檢查項目。中國典2005年版規定，不同的品微生物限度檢查中的細菌數、黴菌及酵母菌數測定、各控制菌的檢查，必須按照經過驗證的方法進行。一些中西制劑由於品本身的理化性質及抑菌活性，干擾品污染的微生物計數測定和控制菌的檢出，帶來檢查結果的不準確性。如在細菌數測定中，低稀釋級的平均平板菌落數低於高稀釋級，呈現細菌的不正常分布，即品顯現出干擾或抑菌作用；反映在控制菌檢查中，陽性對照試驗呈陰性反應，其檢驗結果不能反映品被微生物污染的真實狀況，得出不準確的結果或假陰性結果。由於2005年版以前的中國典，沒有要求對微生物限度檢查中的各項目進行方法學驗證，以至於這類方法學問題越來越多，影響微生物限度檢查結果的准確性。2002年10月～2003年4月我所參加中檢所組織品微生物限度檢查方法驗證試驗協作課題。選擇了4種審核檢驗的中西制劑品種，其原品標准沒有進行微生物限度檢查方法驗證考察，也未見相關文獻報道。為對微生物限度檢查方法進行考察，選用4種代表菌做了微生物計數的菌回收率試驗。根據各品種的要求對控制菌做檢出率測定的研究。得出的結果說明這些品微生物限度檢查方法存在的問題，並為該課題提供了試驗數據。

『貳』 含抑菌劑產品微生物限度檢查如何去除活性

含抑菌劑產品微生物限度檢查如何去除活性
微生物限度檢查法系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法.檢查項目包括細菌數、黴菌數、酵母菌數及控制菌檢查.
微生物限度檢查應在環境潔凈度10000級下的局部潔凈度 100級的單向流空氣區域內進行.檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出.單向流空氣區域、工作檯面及環境應定期按《醫葯工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標准進行潔凈度驗證.
供試品檢查時,如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑,應證明其有效性及對微生物無毒性.
除另有規定外,本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為30℃～35℃；黴菌、酵母菌培養溫度為23℃～28℃.
檢驗結果以 1g、1ml、10g、10ml或10cm2 為單位報告,特殊品種可以最小包裝單位報告.
檢驗量
檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml 或cm2）.
除另有規定外,一般供試品的檢驗量為10g 或10ml；膜劑為100cm2；貴重葯品、微量包裝葯品的檢驗量可以酌減.要求檢查沙門菌的供試品,其檢驗量應增加20g 或20ml（其中10g或10ml用於陽性對照試驗）.
檢驗時,應從2 個以上最小包裝單位中抽取供試品,膜劑還不得少於4 片.
一般應隨機抽取不少於檢驗用量（兩個以上最小包裝單位）的3 倍量供試品.
供試液的制備
根據供試品的理化特性與生物學特性,採取適宜的方法制備供試液.供試液制備若需加溫時,應均勻加熱,且溫度不應超過45℃.供試液從制備至加入檢驗用培養基,不得超過1 小時.

『叄』 中國葯典微生物限度檢查法的細菌、黴菌及酵母菌計數

細菌、黴菌及酵母菌計數用的培養基應進行培養基的適用性檢查，成品培養基、由脫水培養基或按處方配製的培養基均應檢查。
菌種
試驗用菌株的傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍乾燥菌種為第0代），並採用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。
大腸埃希菌（Escherichia coli[CMCC ( B ) 44l02]
金黃色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ]
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ) [ CMCC ( B ) 63501 ]
白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC ( F ) 98001〕
黑麴黴（Aspergillus niger) [ CMCC ( F ) 98003 ]
菌液制備
接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，培養18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，培養24～48小時。上述培養物用0 . 9%無菌氯化鈉溶液製成每lml含菌數為50～100cfu的菌懸液。接種黑麴黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，培養5～7天，加人3～5ml含0.05 % ( ml /ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然後，採用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05 % ( ml / ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液製成每lml含孢子數50～100cfu的孢子懸液。
菌液制備後若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在2～8 ℃，可在24小時內使用。黑麴黴孢子懸液可保存在2～8 ℃，在驗證過的貯存期內使用。
適用性檢查
取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置30～35 ℃培養48小時，計數；取白色念珠菌、黑麴黴各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置23～28 ℃培養72小時，計數；取白色念珠菌50～100cfu，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基．平行制備2個平皿，混勻，凝固，置23～28 ℃培養72小時，計數。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。
結果判定
若被檢培養基上的菌落平均數不小於對照培養基上的菌落平均數的70 %，且菌落形態大小與對照培養基上的菌落一致，判該培養基的適用性檢查符合規定。 當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所採用的方法適合於該產品的細菌、黴菌及酵母菌數的測定。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，計數方法應重新驗證。
驗證時，按供試液的制備和細菌、黴菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證。
菌種及菌液制備
同計數培養鑒的適用性檢查。
驗證方法
驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗，並分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。
( l )試驗組平皿法計數時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液lml和50～100cfu試驗菌，分別注人平皿中，立即傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。薄膜過濾法計數時，取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最後一次的沖洗液中加人50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數。
( 2 )菌液組測定所加的試驗菌數。
( 3 )供試品對照組取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。
( 4 )稀釋劑對照組若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每lml供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。
結果判斷
在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低於70 %。若試驗組的菌數回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率）均不低於70%，照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、黴菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌數回收率低於70 %，應採用培養基稀釋法、離心沉澱法、薄膜過濾法、中和法（常見干擾物的中和劑或滅活方法見表1）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。
表l 常見干擾物的中和劑或滅活方法 干擾物 可選用的中和劑或滅活方法 戊二醛 亞硫酸氫鈉 酚類、乙醇、吸附物 稀釋法 醛類 稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽 季銨類化合物（QACs）、對羥基苯甲酸酯卵磷脂、聚山梨酯 汞類制劑 亞硫酸氫鈉、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽 雙胍類化合物 卵磷脂 碘酒、洗必泰類 聚山梨酯 鹵化物 硫代硫酸鹽 乙二胺四乙酸（EDTA ) 鎂或鈣離子 磺胺類 對氨基苯甲酸 β-內醯胺類抗生素 β-內醯胺酶 若沒有適宜的方法消除供試品的抑菌活性，那麼驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌污染。但是，供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑製作用，而對其他菌株沒有抑製作用。因此，根據供試品須符合的微生物限度標准和菌數報告規則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應採用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。
計數方法驗證時，採用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那麼選擇回收率最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。
驗證試驗也可與供試品的細菌、黴菌及酵母菌計數同時進行。

『肆』 關於微生物如何計數的問題

細菌懸液可以通過測OD值法來確定數目，但要做標准曲線，比較麻煩
還可以用血球計數板進行計數，但計的數包括活菌與死菌
還可以通過平板塗布法來計數，此方法計的都是活菌數，比較准確

『伍』 微生物計數方法驗證需要怎麼准備

微生物限度檢查方法學驗證

1、供試品：XXXXX膠囊（批號：XXXXXX）

2、菌種：

菌落計數用菌種：

(1) 枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]

(2) 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]

(3) 大腸埃希菌[CMCC（B）4]

(4) 白色念珠菌[CMCC (F) 98001]

控制菌檢查用菌種：

(1) 大腸埃希菌[CMCC（B）4]

(2) 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]

3、培養基：營養肉湯培養基、改良馬丁培養基、營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、4-甲基傘形酮葡糖苷培養基（MUG）。

4、預試驗 按照中國葯典2005年版微生物限度檢查法中常規法及培養基稀釋法檢驗，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均小於70%，本品有抑菌作用。

5、細菌、黴菌及酵母菌計數

按照中國葯典2005年版微生物限度檢查法進行細菌、黴菌及酵母菌計數的方法學驗證試驗及菌落計數。

5.1菌液制備：

(1) 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至10ml營養肉湯中，35～37℃培養18～24小時，取此培養液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，使菌數約為50～100cfu/ml。

(2) 接種白色念珠菌的新鮮培養物至10ml改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48小時，取此培養液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，使菌數約為50～100cfu/ml。

5.2 供試液的制備 取供試品10g，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml，振搖，使呈1：10的供試品儲備液。取1：10的供試品儲備液 10ml

『陸』 葯品領域的微生物檢測及標准

中國葯典微生物限度檢查法，為《中國葯典》附錄收載的關於葯品微生物檢查的法定方法。葯品的不同劑型的微生物檢測標准不同，具體如下：

1、制劑通則品種

制劑通則、品種項下要求無菌的制劑及標示無菌的制劑應符合無菌檢查法規定。

2、口服給葯制劑

細菌數每1g不得過l000cfu。每lml不得過100cfu。

黴菌和酵母菌數每lg或lml不得過100cfu。

大腸埃希菌每1g或lml不得檢出。

3、耳、鼻及呼吸道吸入給葯制劑

細菌數每1g、lml或l0cm²，不得過100cfu。

黴菌和酵母菌數每1g、lml或l0cm²，不得過10cfu。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每1g、lml或l0cm²不得檢出。

大腸埃希菌鼻及呼吸道給葯的制劑，每1g、lml或l0cm²，不得檢出。

4、陰道、尿道給葯制劑

細菌數每1g、lml或l0cm²，不得過100cfu。

黴菌數和酵母菌數每1g、lml或l0cm²應小於10cfu。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌每1g、lml或l0cm²，不得檢出。

5、直腸給葯制劑

細菌數每1g不得過l000cfu。每lml不得過100cfu。

黴菌和酵母菌數每1g或lml不得過100cfu。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每lg或lml不得檢出。

6、其他局部給葯制劑

細菌數每1g、lml或l0cm²不得過100cfu。

黴菌和酵母菌數每1g、lml或l0cm²不得過100cfu。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每1g、lml或l0cm²不得檢出。

7、含動物組織

含動物組織（包括提取物）的口服給葯制劑每10g或10ml還不得檢出沙門菌。

8、兼用途徑制劑

應符合各給葯途徑的標准。

(6)微生物計數如何消除抑菌活性擴展閱讀

微生物限度檢查法的注意事項：

1、當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所採用的方法適合於該產品的控制菌檢查。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，檢查方法應重新驗證。

2、檢查項目應當包括細菌數、黴菌數、酵母菌數及控制菌檢查。

3、微生物限度檢查應在環境潔凈度10000 級下的局部潔凈度100 級的單向流空氣區域內進行。

4、檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染。單向流空氣區域、工作檯面及環境應定期按《醫葯工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標准進行潔凈度驗證。

5、除另有規定外，本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為30℃～35℃；黴菌、酵母菌培養溫度為23℃～28℃。

6、檢驗結果以1g、1ml、10g、10ml、10c㎡ 為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。

『柒』 微生物限度檢查法的結果判定

被檢培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數的比值大於70%，且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致。判該培養基的適用性檢查符合規定。計數方法的驗證當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所採用的方法適合於該產品的細菌、黴菌及酵母菌數的測定。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，計數方法應重新驗證。驗證時，按供試液的制備和細菌、黴菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證。菌種及菌液制備 同計數培養基的適用性檢查驗證方法 驗證試驗至少應進行3 次獨立的平行試驗，並分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。
（1）試驗組 平皿法計數時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml 和50～100cfu 試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。薄膜過濾法計數時，取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最後一次的沖洗液中加入50～100cfu 試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數。
（2）菌液組 測定所加的試驗菌數。
（3）供試品對照組 取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。
（4）稀釋劑對照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1ml 供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。結果判斷 在3 次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低於70%。若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率）均不低於70%，照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、黴菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低於70%，應採用培養基稀釋法、離心沉澱法、薄膜過濾法、中和法（表1）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物 可選用的中和劑或滅活方法戊二醛 亞硫酸氫納酚類、乙醇、吸附物 稀釋法醛類 稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽季銨類化合物（QACs）、對羥基苯甲酸酯、 卵磷脂、聚山梨酯汞類制劑 亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽雙胍類化合物 卵磷脂酒、洗必泰類 聚山梨酯鹵化物 硫代硫酸鹽 乙二胺四乙酸（EDTA） 鎂或鈣離子磺胺類 對氨基苯甲酸。
若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，那麼驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌污染。但是，供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑製作用，而對其他菌株沒有抑製作用。因此，根據供試品須符合的微生物限度標准和菌數報告規則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應採用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。計數方法驗證時，採用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那麼選擇回收情況最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。驗證試驗也可與供試品的細菌、黴菌及酵母菌計數同時進行。 取規定量供試液及10～100cfu 試驗菌加入增菌培養基中，依相應控制菌檢查法進行檢查。當採用薄膜過濾法時，取規定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最後一次沖洗液中，過濾後，注入增菌培養基或取出濾膜接入增菌培養基中。結果判斷 若上述試驗檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應採用培養基稀釋法、離心沉澱集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。供試品檢查供試品的控制菌檢查應按已驗證的方法進行，增菌培養基的實際用量同控制菌檢查方法的驗證。陽性對照試驗 供試品進行控制菌檢查時，應做陽性對照試驗。陽性對照試驗的加菌量為10～100cfu，方法同供試品的控制菌檢查。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。陰性對照試驗 取稀釋液10ml 照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應無菌生長。

『捌』 微生物限度檢查方法應該說是「驗證」還是「確認」

微生物限度檢查方法應該說是「驗證」還是「確認」
葯品微生物限度檢查是控制葯品質量的一個重要檢查項目。中國葯典2005年版規定，不同的葯品微生物限度檢查中的細菌數、黴菌及酵母菌數測定、各控制菌的檢查，必須按照經過驗證的方法進行。一些中西葯制劑由於葯品本身的理化性質及抑菌活性，干擾葯品污染的微生物計數測定和控制菌的檢出，帶來檢查結果的不準確性。如在細菌數測定中，低稀釋級的平均平板菌落數低於高稀釋級，呈現細菌的不正常分布，即葯品顯現出干擾或抑菌作用；反映在控制菌檢查中，陽性對照試驗呈陰性反應，其檢驗結果不能反映葯品被微生物污染的真實狀況，得出不準確的結果或假陰性結果。由於2005年版以前的中國葯典，沒有要求對微生物限度檢查中的各項目進行方法學驗證，以至於這類方法學問題越來越多，影響微生物限度檢查結果的准確性。2002年10月～2003年4月我所參加中檢所組織葯品微生物限度檢查方法驗證試驗協作課題。選擇了4種審核檢驗的中西葯制劑品種，其原葯品標准沒有進行微生物限度檢查方法驗證考察，也未見相關文獻報道。為對微生物限度檢查方法進行考察，選用4種代表菌做了微生物計數的菌回收率試驗。根據各品種的要求對控制菌做檢出率測定的研究。得出的結果說明這些葯品微生物限度檢查方法存在的問題，並為該課題提供了試驗數據。