1. 我們採取哪些方法控制微生物的繁殖與生長
其哪些方法可以控制微生物的繁殖與生長，那就是缺氧，如果是控制了氧氣，那麼微生物生長，就會成為一種。障礙，所以說，嗯，那就把它隔斷氧氣，隔斷在真空裡面，所以說這樣就可以控制微生物的繁殖和生長。
2. 如何利用微生物生態學的原理來控制環境中的有害微生物
二、微生物生長的控制途徑
1. 遺傳學特性 2. 培養基組成 3. 培養條件
三、微生物生長的控制因素
（一）化學因素
1.殺菌劑又稱為抗微生物劑，是一類能夠殺死或抑制微生物生長的化學物質。 可分為抑菌劑、殺菌劑和溶菌劑。
2.抗代謝劑抗代謝劑就是與生長因子結垢類似的特殊化學物質。
3.抗生素 抑制細菌細胞壁合成、破壞細胞膜、干擾氧化磷酸化以及抑制蛋白質和核酸合成。
4. pH(氫離子濃度) 每種微生物都有其最適pH值和一定的pH范圍。
5.氧化還原電勢對好氧菌的影響較大。
6.鹽、鹼和金屬離子 影響滲透壓
微量的金屬離子對微生物的生命活動有著重要作用。
（二）化學因素
1. 溫度
每種微生物都有自己的生長溫度三基點：最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度；此外還有致死溫度。
根據微生物最適生長溫度的高低，將微生物分為三類。 溫度對生長速率的影響為曲線型。
溫度升高時，生長速率倍增，但超過最適生長溫度時，生長速率都很快下降。 大多數微生物對低溫有較強的抵抗力，低溫下微生物生長代謝緩慢甚至停止。
微生物對高溫較敏感，高溫對菌體蛋白質、核酸、酶有破壞作用。 2. 電磁輻射 紫外線、γ射線、X射線 3. 滲透勢
細胞內溶質濃度與胞外溶質濃度（如0.85％NaCl溶液）相等時的狀態，稱為等滲狀態。
溶液的溶質濃度高於胞內溶質濃度，則稱為高滲溶液，能在此環境中生長的微生物，稱為耐高滲微生物。當溶質濃度很高時，細胞就會脫水，發生質壁分離，甚至死亡。鹽漬（5%～30%食鹽）和蜜餞（30％～80％糖）可以抑制或殺死微生物，這是一些常用食品保存法的依據。
若溶液的溶質濃度低於胞內溶質濃度，則稱為低滲溶液，微生物在低滲溶液中，水分向胞內轉移，細胞膨脹，甚至脹破。
4. 乾燥
水分活度（Activity of the water, Aw）是用來表示微生物在天然環境可人為環境中實際利用游離水的含量。是指在相同條件下，密閉容器內該溶液的蒸汽壓(p)與純水蒸汽壓(p0)之比，即Aw= p/p0 。
乾燥環境(aw＜0.60～0.70）條件下，多數微生物代謝停止，處於休眠狀態，嚴重時引起脫水，蛋白質變性，甚至死亡，這是乾燥條件能保存食品和物品，防止腐敗和霉變的原理。不同微生物在不同的生長時期對乾燥的抵抗能力不同。 一般細菌AW min=0.90 酵母菌AW min=0.88 嗜鹽細菌AW min=0.75 霉 菌AW min=0.80 耐滲透壓酵母菌AW min= 0.60 四、微生物生長的控制方法 （一）微生物生長的控制理論
1. 微生物生長速率與營養物質濃度
2. 微生物生長的連續培養理論
3. 控制微生物生長繁殖的主要方法及原理有哪些
摘要 1.
4. 如何如何更好的控制微生物
簡述微生物控制5種方法類型
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（1）滅菌：採用強烈的理化因素使任何物體內外部的一切微生物永遠喪失繁殖能力的措施，稱為滅菌，例如各種高溫滅菌措施等。
（2）消毒：指採用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的病原菌，而對被消毒的物體基本無害的措施。
（3）防腐：利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達到防止食品等發生霉腐的措施。其主要措施有：
①低溫。利用4℃以下低溫可以保藏食物、葯品。
②缺氧。採用在密閉的容器中加入除氧劑來有效地防止食品和糧食等的霉腐、變質，達到保鮮的目的。
③乾燥。採用曬干或紅外線乾燥等方法對糧食、食品等進行乾燥保藏是最常見的防止霉腐的方法。
④高滲。通過鹽腌和糖漬等高滲措施來保存各種食物的防腐方法。
⑤高酸度。用高酸度也可達到防腐的目的。
⑥防腐劑。在有些食品、調味品、飲料或器材中，可以加入適量的防腐劑以達到防霉腐的目的。
5. 如何進行微生物檢驗分析中的質量控制
一、診斷性抗血清試劑，實驗當日至少應做多價血清陰性和陽性質控。定性試驗試劑每次檢測時應至少包括陽性和陰性質控菌株。不含內質控的直接抗原檢測試劑，實驗當日應檢測陽性和陰性質控。使用的染色劑（革蘭染色、特殊染色和熒光染色），至少每周（若檢測頻率小於每周1此，則實驗當日）用已知陽性和陰性（適用時）的質控菌株檢測。凝固酶、過氧化氫酶、氧化酶、β-內醯胺酶，實驗當日應做陰性和陽性質控，商業頭孢菌素試劑的β-內醯胺酶試驗可遵循製造商的建議。
二、實驗室採用的抗菌葯物敏感性試驗方法的質控：應以質控標准菌株連續檢測20—30天，每一組葯物/細菌超出參考范圍（抑菌圈直徑或MIC）的頻率應不超過（≤）1/20或1/30；也可採用替代質控方案，即連續5天，每天對每一組葯物/細菌重復測定3次，每次單獨制備接種物，15個數據超出參考范圍（抑菌圈直徑或MIC）的結果應不超過（≤）1個，若失控結果為2-3個，則如前述，再進行5天，每天3次重復試驗，30個數據失控結果應不超過（≤）3個。此後，應每周使用標准菌株進行質控。若檢測頻率小於每周1次，則每個檢測日應進行質控。採用自動或者半自動儀器檢測MIC值時，應按照製造商的要求進行質控。
三、厭氧菌培養：還需要使用有效的方法檢測厭氧培養環境（如以亞甲蘭試條、厭氧菌或其它適當方法）。分枝桿菌檢測：抗酸染色應在實驗當日用適當的陰性和陽性質控驗證；熒光染色應每次實驗以陰性和陽性質控驗證。真菌檢測：直接染色（如：抗酸染色，PAS，吉姆薩染色，墨汁染色）檢查患者樣品時，應在實驗當日做陰性和陽性質控（某些染色如吉姆薩染色，玻片本身作為陰性質控。KOH制備的玻片不需要質控）。病毒：連續細胞傳代時應定期監測支原體污染（宜監測陰性未傳代的質控株，而不是培養支原體）；應監測用於細胞生長培養液的動物血清的細胞毒性；應具備相應的細胞株用於病毒培養。
6. 控制微生物生長的方法
控制水分、碳源、氮源、能源、礦質元素、生長因子等必須條件，調節溫度、濕度等環境條件，添加抗生素、提供短波射線等
7. 如何對無菌制劑生產車間微生物污染進行控制
如何對無菌制劑生產車間微生物污染進行控制
防止微生物污染的原則：
1. 了解污染源
對葯品生產全過程可能造成污染的來源，進行深入的了解研究，從而設計一個完好的生產工藝，制定規章制度和標准操作規程，從各個環節採取消毒和衛生措施來防止微生物污染，使產品達到所要求的衛生學質量，包括穩定性及各種微生物參數。
2. 進行微生物監測
在葯品生產過程中，應按GMP要求不斷進行各項微生物衛生學監測。例如：對潔凈室空氣中的浮游菌、沉降菌的監測；對無菌設備清潔滅菌的驗證；對非無菌葯品進行細菌和活菌數測定和病原菌的限制性檢查等。
葯品生產人員衛生注意事項：
新進人員的健康檢查：葯品生產企業在招收新職工時，一定要對新職工進行全面的健康檢查，要確保新進廠的職工不患有急性或慢性傳染病。另外還要根據新進職工安排的具體崗位性質再確定其它具體檢查的項目。
建立生產人員健康檔案：葯品生產企業應對職工建立個人健康檔案，以便於檢查、了解、追蹤個人健康好壞的狀況
培養葯品生產人員良好的個人衛生習慣 ：
勤洗手、勤剪指甲
定期洗澡、勤理發
勤換衣服、勤洗工作服
在生產區內做到三個嚴禁 ：禁止吃東西、禁止吸煙、禁止大聲喧嘩
潔凈區生產人員要求：
1. 鞋的凈化：可使用一種地墊，它具有粘性表面，能殺滅細菌並經抗靜電劑的處理，可除去人員腳上的塵粒。
2. 工作服的凈化：工作服的使用，可沉積吸附大量微生物和不清潔物，衣服本身也會散發纖維屑，故應經常清潔、滅菌。
3. 手的凈化：手是交叉污染的媒介，要教育生產人員警惕對產品的污染。用消毒皂和流水洗。
4. 頭罩：頭罩必須把全部毛發遮住。
5. 口罩：常用的口罩由4～6層紗布製成。帶口罩一定要遮住口、鼻；不能帶潮濕的口罩；使用不能超過4h；不可正反兩面使用。
潔凈區工作人員要盡可能少而精，只有工作需要時才能進入；
操作人員在潔凈區動作盡量要緩慢，避免劇烈運動，以減少人的發塵量；
潔凈區的門應關緊，避免不必要的移動，以保持潔凈區的風速、風量、風型和風壓；
如果是無菌區的話，操作人員的自我約束就更多，要嚴格按無菌操作規程執行。
8. 微生物復習-微生物的生長繁殖及其控制
第五章 微生物的生長繁殖及其控制
重點：細菌生長曲線的定義、各時期的特點、應用及生產指導意義。控制微生物生長繁殖及控制微生物生長的條件及原理。
微生物在適宜的環境條件下，不斷地吸收營養物質，並按照自己的代謝方式進行代謝活動，如果同化作用大於異化作用，則細胞質的量不斷增加，體積得以加大，於是表現為生長。簡單地說，生長就是有機體的細胞組分(constituent)與結構在量方面的增加。單細胞微生物如細菌，生長往往伴隨著細胞數目的增加。當細胞增長到一定程度時，就以二分裂方式，形式兩個基本相的子細胞，子細胞又重復以上過程。在單細胞微生物中，由於細胞分裂而引起的個體數目的增加，稱為繁殖。在多細胞微生物中，如某些黴菌，細胞數目的增加如不伴隨著個體數目的增加，只能叫生長，不能叫繁殖。例如菌絲細胞的不斷延長或分裂產生同類細胞均屬生長，只有通過形成無性孢子或有性孢子使得個體數目增加的過程才叫做繁殖。
在一般情況下，當環境條件適合，生長與繁殖始終是交替進行的。從生長到繁殖是一個由量變到質變的過程，這個過程就是發育。
微生物處於一定的物理、化學條件下,生長、發育正常，繁殖速率也高；如果某一或某些環境條件發生改變，並超出了生物可以適應的范圍時，就會對機體產生抑制乃至殺滅作用。
第一節細菌純培養的群體生長規律
大多數細菌的繁殖速度都很快。大腸桿菌的適宜條件下，每20分鍾左右便可分裂一次，如果始終保持這樣的繁殖速度，一個細菌48個小時內，其子代總重量可達2.2×10 31克，這是一個巨大的數字。然而，實際情況是不可能的。那麼，細菌的群體生長規律到底怎樣呢?
一、細菌純培養的群體生長規律（詳細講解，讓學生理解並掌握）
將少量單細胞純培養接種到一恆定容積的新鮮液體培養基中，在適宜的條件下培養，定時取樣測定細菌含量，可以看到以下現象：開始有一短暫時間，細菌數量並不增加，隨之細菌數目增加很快，繼而細菌數又趨穩定，最後逐漸下降。如果以培養時間為橫坐標，以細菌數目的對數或生長速度為縱坐標作圖，可以得到如圖6-6的曲線，稱為繁殖曲線，對單細胞微生物而言，雖然生長和繁殖是兩個不同的概念，但由於在測定方法上，多以細菌數增加(即繁殖)作為生長指標，它們的繁殖也可視為群體的生長，所以，繁新的適宜的環境中生長繁殖直至衰老死亡全過程的動態變化。根據細菌生長繁殖速率的不同，可將生長曲線大致分為延遲期、對數期、調整期或滯留適應期。
（一）延遲期 處於延遲期細菌細胞的特點可概括為8個字：分裂遲緩、代謝活躍。細胞體積增長較快，尤其是長軸，例如巨大芽孢桿菌，在延遲期末，細胞平均長度比剛接種時大6倍以上；細胞中RNA含量增高，原生質嗜鹼性加強；對不良環境條件較敏感，對氧的吸收、二氧化碳的釋放以及脫氨作用也很強，同時容易產生各種誘導酶等。這些都說明細胞處於活躍生長中，只是細胞分裂延遲。在此階段後期，少數細胞開始分裂，曲線略有上升。
延遲期出現的原因，可能是為了調整代謝。當細胞接種到新的環境(如從固體培養接種至液體培養基)後，需要重新合成必需量的酶、輔酶或某些中間代謝產物，以適應新的環境。
延遲期的長短與菌種的遺傳性、菌齡以及移種前後所處的環境條件等因素有關，短的只需幾分鍾，長的可達幾小時。因此，深入了解延遲期產生的原因，採取縮短延遲期的措施，在發酵工業上具有十分重要的意義。在生產實踐中，通常採取的措施有增加接種量，在種子培養中加入發酵培養基的某些營養成分，採用最適種齡(即處於對數期的菌種)的健壯菌種接種以及選用繁殖快的菌種等措施，以縮短延遲期，加速發酵周期，提高設備利用率。
在延遲期末，每個細胞已開始分裂，但並非所有的機體都同時結束這一時期，所以細菌數逐漸增加，曲線稍有上升，直至這一階段結束，進入下一階段。
(二) 對數期(log phase) 對數期又稱指數期(exponential phase)。在此期中，細胞代謝活性最強，組成新細胞物質最快，所有分裂形成的新細胞都生活旺盛。這一階段的突出特點是細菌數以幾何級數增加，代時穩定，細菌數目的增加與原生質總量的增加，與菌液混濁度的增加均呈正相關性。這時，細菌純培養的生長速率也就是群體生長的速率，可用代時(generation time)表示。所謂代時，即單個細胞完成一次分裂所需的時間，亦即增加一代所需的時間(也叫增代時間或世代時間)。在此階段，由於代時穩定，因此，只要知道了對數期中任何兩個時間的菌數，就可求出細菌的代時。
不同的細菌，其對數期的代時不同，同一種細菌，由於培養基組成和物理條件的影響，如培養溫度、培養基pH、營養物的性質等，代時也不相同。但是，在一定條件下，各種菌的代時又是相對穩定的，多數種為20-30分鍾，有的長達33小時，而有的繁殖極快，增代時間只9.8分左右。表6-4示不同細菌的代時。
處於對數期的微生物，其個體形態、化學組成和生理特性等均較一致，代謝旺盛，生長迅速，代時穩定，所以是研究基本代謝的良好材料，也是發酵生產的良好種子，如果用作菌種，往往延遲期很短以至檢查不出，這樣可在短時間內得到大量微生物，以縮短發酵周期。
(三) 穩定期(stationary phase) 又稱恆定期或最高生長期。處於穩定期的微生物，新增殖的細胞數與老細胞的死亡數幾乎相等，整個培養物中二者處於動態平衡，此時生長速度，又逐漸趨向零。
在一定容積的培養基中，細菌為什麼不能按對數期的高速率無限生長呢?這是由於對數期細菌活躍生長引起周圍環境條件條件發生了一系列變化，某些營養物質消耗，有害代謝產物的積累，以及諸如pH、氧化還原電位、溫度等的改變，限制了菌體細胞繼續以高速度進行生長和分裂。
此階段初期，細菌分裂的間隔時間開始延長，曲線上升逐漸緩慢。隨後，部分細胞停止分裂，少數細胞開始死亡，致使細胞的新生與死亡速率處於動態平衡。這時培養物中細胞總數達到最高水平，接著死亡細胞數大大超過新增殖細胞數，曲線出現下降趨勢。
穩定期的細胞內開始積累貯藏物，如肝糖、異染顆粒、脂肪粒等，大多數芽孢細菌也在此階段形成芽孢。如果為了獲得大量菌體，就應在此階段收獲，因這時細胞總數量最高；這一時期也是發酵過程積累代謝產物的重要階段，某些放線菌抗生素的大量形成也在此時期。
從上可以看出，穩定期的微生物，在數量上的達到了最高水平，產物的積累也達到了高峰，此時，菌體的總產量與所消耗的營養物質之間存在著一定關系，這種關系，生產上稱為產量常數，可用下式表示：
γ=菌體總生長量/消耗營養物質總量
式中γ值的大小可說明該種細菌同化效率的高低。根據這一原理，可用適當的微生物作為指示，對維生素、氨基酸或核苷酸等進行定量的生物測定。穩定期的長短與菌種和外界環境條件有關。生產上常常通過補料、調節pH、調整溫度等措施，延長穩定期，以積累更多的代謝產物。
(四) 衰亡期(decline hpase) 穩定期後如再繼續培養，細菌死亡率逐漸增加，以致死亡數大大超過新生數，群體中活菌數目急劇下降，出現了"負生長"，此階段叫衰亡期。其中有一段時間，活菌數換幾何級數下降，故有人稱之為"對數死亡階段"。這一階段的細胞，有的開始自溶，產生或釋放出一些產物，如氨基酸、轉化酶、外肽酶或抗生素等。菌體細胞也呈現多種形態，有時產生畸形，細胞大小懸殊，有的細胞內多液泡，革蘭氏染色反應的陽性菌變成陰性反應等。在學習細菌生長曲線的有關知識時，應注意各生長期之間的過渡階段。從圖6-6可以看到培養物是逐步地從一個生長期進入到下了個生長期的。也就是說，並不是所有細胞在接近某一生長期的末尾時均處於完全相同的生理狀態，因此，在細菌生長的整個周期，細菌數和培養時間，若以線性關系表示，往往是一條緩慢上升以後又逐漸下降的曲線，而不是一個階段分明的直線。
認識和掌握細菌生長曲線，不僅對指導發酵生產具有很大作用，而且對科學研究也是十分必要的。例如，為了得到研究材料，往往少不了要預計一細胞群體生長到一定數量水平需要多長時間，這就必須計算生長速率和代時。另外，正確認識正常生長曲線的完整意思也很重要，在某個生長時期細胞年幼而代謝活躍，哪個時期細胞老化並瀕於死亡，因不同生長期的細胞在結構和生理上可能有很大差別，了解了這些，就能根據需要進取樣和收獲。同時，在不同的生長期里理化因子對微生物的影響了可能不同。一般來說，對數生長期的細胞較為一致，因此常用於研究細胞的新陳代謝。
二、微生物生長的測定（詳細講解，讓學生理解）
微生物特別是單細胞微生物，體積很小，個體的生長很難測定，而且也沒有什麼實際應用價值。因此，測定它們的生長不是依據細胞個體的大小，而是測定群體的增加量，即群體的生長。例如用直接或間接的方法測定群體的增加量；或測定群體的原生質量；或測定細胞中某些生理活性的變化等。就一般單細胞微生物而言，尤其在對數生長期，像細菌的生長量與細菌的數目之間完成是一種正比例關系。因此，某些情況下，細菌的數目就表示了它的生長量。測定生長量的方法很多，概括起來有以下幾種。
(一) 直接計數法(又稱全數法)
1. 塗片染色法 將已知體積的待測材料，均勻地塗布在載玻片的已知面積上，經固定染色後，在顯微鏡下計算染色塗片上的細菌數。一般在載玻片一平方厘米的面積上，均勻塗布0.01毫升樣品。很顯然，在顯微鏡下要觀察整個塗布區域是較困難的，因此，人們常常任意選擇幾個乃至十幾個視野來計算細胞的數量。如果藉助鏡台測微尺測得視野的直徑，就可計算了。視野的面積(面積=πr2，r為視野的半徑)，然後用一平方厘米內的視野數乘以每個視野中的細胞平均數，再乘以100(因只用了0.01毫升樣品塗布)，就等於每毫升菌液的細胞數。其計算公式如下：
每毫升原菌液含菌數=視野中的平均菌數×1cm 2/視野面積×100×稀釋倍數
2.計數器測定法 用特製的細菌計數器或血球計數器進行計數。取一定容積稀釋的單細胞微生物懸液置於計數器載玻片與蓋玻片之間的計數室內。由於計數室的容積是己知的(總面積為1平方毫米，高0.1毫米)，並有一定刻度。因此，可根據計數器刻度內的細菌數，計算出樣品中的含菌數。
根據計數器小格數目的不同，可概括成兩個換算公式：
(1) 16個中格×25個小格的計數器：每毫升原菌液含菌數=100小格內菌數100×400×10，000×稀釋倍數
(2) 25個中格×16個小格的計數器：每毫升原菌液含菌數=小格內菌數80×400×10：000×稀釋倍數
上述兩種計數器有一個共同特點，即每一個大方格均由16×25=400個小方格組成，故可將上面兩個公式歸納成一個通式：
每毫升原菌液含菌數=每小格平均菌數×4，000，000×稀釋倍數
3.比例計數法 將待測的細菌懸液與等體積血液混合後塗片，在顯微鏡下可以測得細菌數與紅細胞數的比例。由於每毫升血液中紅細胞數是已知的，如正常的男性每立方毫米血液中約含400-500萬個，女性約為350-450萬個。這樣，通過細菌數與紅細胞數的比例，就可計算出每毫升樣品中的細菌數。如果測定空氣和水中的微生物時，由於含菌數低，需將一定體積的樣品通過特製的濾器進行濃縮。
上述三種方法都屬於顯微鏡直接計數法。這些方法雖然較麻煩，但在許多有關微生物生長的研究工作中卻很重要。然而也有一定的局限性，主要表現在：死、活細胞不易區分；小的細胞很難在顯微鏡下觀察，有一些細胞可能被遺漏；濃度太低的細胞懸液也不能使用此法，可以計數的最低的群體細胞數與細胞大小有關，就大多靈敏細菌而言，群體數必須每毫升懸液中含菌10 6個以上；精確性也較差。
4.電子自動計數器計數法 電子計數器的工作原理，就是測定一個小孔中液體的電阻變化。
電子自動計數器具有一個特製的有孔玻璃薄膜，當定量的細胞懸液中的菌體高速地通過小孔時，由於懸液與菌體的導電性不同，使得小孔的電導下降，電阻強率明顯增加，並形成一個脈沖，自動記錄在電子記錄尺標裝置上。這樣，一份已知體知的含有待測細胞的菌懸液，讓其通過這一小孔，每當一個細胞通過時就就產一個脈沖被記錄下來。此設備可以高速測定菌數，而且結果也較精確。但是電子計數器不能區別其他顆粒，因此，菌懸液中應無其他碎片。
5.比濁法 這是測定懸液中細胞數的快速方法。其原理是懸液中細胞濃度與混濁度成正比，與透光度成反比。菌體是不透光的，光速通過菌懸液時則會引起光的散射或吸收，從而降低透光量。細菌越多，透光量越低。因此，測定菌懸液的光密度或透光度可以反映細胞的濃度。而光密度或透光度又可借光電池精確地測得。然後將未知細胞數的懸液與已知細胞數的懸
液相比，可以從已知懸液的稀釋倍數，求出未知懸液所含的細胞數。此法比較簡便。但使用時必須注意：樣品顏色不宜太深；樣品中不要混雜其他物質，否則不能使用；同時菌懸液濃度必須在10 7/毫升以上才能顯示可信的混濁度。
(二) 間接計數法(又叫活菌計數法)
直接計數法測定的是死、活細胞總數。在多數情況下，人們所關心的是計算活菌數。間接計數法是基於每個分散的有機體在適宜的培養基中具有生長繁殖的能力，並且一個活細胞能形成一個菌藩。因此，菌落數就是待測樣品的含的活菌數。此法所得的數值往往比直接法測定的數字小。
1.平皿菌落計數法 像稀釋平皿分離法一樣，先將待測菌液作一系列10倍稀釋，使平皿上長出的菌落數在30-300個之間。然後將最後三個稀釋度的稀釋液各取一定量(一般為0.2毫升)與融化並冷至45℃左右的瓊脂培養基一起，傾入無菌平皿中搖勻，靜置，待凝固後進行保溫培養，通過平皿上出現的菌落數，便可推算出原菌液含菌數。計算公式：
總活菌數/毫升=同一稀釋度三次重復的菌落平均數×稀釋倍數×5
此法由於個人掌握程度的不同，結果常不穩定。其成敗關鍵在於應使樣品充分均勻，而且每個稀釋度的菌液應各用一支無菌吸管，以減少吸管壁因存在油脂等物粘上細菌而影響計數的精確度(否則，有時誤差高達15%左右)。為克服這一弱點，近年來有人對此法作了改進。他們認為，對原菌液濃度為10-9/毫升的微生物來說，如果第一次稀釋採用10-4�級(即用毛細吸管吸菌液10微升至100毫升的無菌水中)，第二次稀釋則採用10-2�級(即吸1毫升上述稀釋菌液於100毫升無菌水中)，然後再吸0.2毫升此菌液進行平皿菌落計數(採用表面塗布法)，其結果較為精確可靠(圖6-4)。
平皿菌落計數法是教學、生產、科研中最常見的一種活菌計數法。它不僅適用於多種材料，而且，即使樣品中含菌數量極少也可以測出。常用於測定水、土壤、牛奶、食品及其他材料中的活菌數。必須注意的是：並非所有生活有機體都要在實驗條件下或實驗期間內生長並形成菌落，如果在待測樣品中含有不同生理類型的有機體時更是如此。此外，意外的損傷也可導致菌數減少，例如有些細菌，可能在稀釋和傾倒平皿等過程中遭到損傷，造成人為的誤差。處於融化狀態的瓊脂培養基溫度較高，某些易受熱力影響的微生物往往不能存活；加之人們無法看出產生菌落細胞，因而不能絕對肯定一個菌落僅來源於一個細胞，以致造成實驗誤差。
2.稀釋法 獎待測樣品作一系列稀釋，一直稀釋到該稀釋液的少量(如1毫升)接種到新鮮培養基中沒有或極少出現生長繁殖。根據沒有生長的最低稀釋度與出現生長的最高稀釋度(即臨界級數)，再用"或然率"理論，可以計算出樣品單位體積中細菌數的近似值。具體的說，菌液經多次稀釋後，一定量菌液中可以極少甚至無菌，然後將待測液於液體培養基中，按十倍稀釋度作一系列稀釋，每個稀釋度取3-5次重復，培養後，將有細胞生長的最的三個稀釋度中的出現細菌生長的管數作為數量指示，由統計分配表(表6-2)上查出近似值，再乘以數量指標第一位數的稀釋倍數，即為原菌液中的含菌數。例如：某一細菌在稀釋法中的生長情況如下：
根據上述結果，其數量指標為"541"，查統計分配表得近似值為17。然後乘以第一位數的稀釋倍數(10-5的稀釋倍數為100，000)。那麼，原菌液中的活菌數=17×100，000=10 5。即每毫升原菌液中含活菌數為1，700，000個。統計分配表根據重復次數不同分為三次重復測數統計表，四次重復測數統計表和五次重復測數統計表(又稱五管最或然數表)。
在實踐中，通常以五管重復為一個組，故這里僅列出了五次重復測數統計表。只要知道了數量指標，就可查知近似值。
例1 經巴斯德消毒的牛奶樣品作10 0、10-1、10-2稀釋，每個稀釋度作五管重復，每個重復管中加入1ml小份樣品接種，培養後，100五管均出現生長10-1有三管生長，而10-2�沒有生長，其數量指標為530，從表6-2查出近似值是7.9，則每毫升牛奶含活菌為：7.9×10個。
例2 牛奶樣品作10-3、10-4、10-5稀釋，同上法各取五個1毫升小份稀釋的樣口接種，經培養，10-3有四管生長，10-4有兩管生長，而10-5沒有生長。其數量指標為420。從表6-2查出近似值是2.2，由於數量指標的第一位數的稀釋倍數是1，000，故每毫升牛奶中含活菌為：2.2×10 3個。此方法只有因某種原因不能使用瓊脂平皿菌落計數時才採用。
從前面可看出，活菌計數法盡管有一定的局限性，但它卻能提供其他方法不能獲得的資料，所以在食品、奶品、醫學及衛生微生物學中經常採用。為了消除上述方法的復雜性，現在不論是培養基、培養條件或是稀釋方法、計算方法，以及結果分析和解釋等方面，通過多年的實踐，都制訂了嚴格的標准。
如果測定量大而且含菌濃度很低樣品(如空氣、水等)中的活菌數時，則應將待測樣品通過微孔薄膜(如硝化纖維素薄)過濾濃庥，再與膜一起放到培養基或浸透了培養液的支持物表面培養，然後根據菌藩數推知樣品含菌數。
(三) 測定細胞物質量
1.測定細胞總含氮量來確定細菌濃度 蛋白質是細胞的主要物質，含量比較穩定，而氮又是蛋白質的重要組成。其方法要點：從一定量培養物中分離出細菌，洗滌，以除去培養基帶入的含氮物質。再用凱氏定氮法法測定總含氮量，以表示原生質含量的多少。一般細菌的含氮量約為原生質乾重的14%。而總氮量與細胞蛋白質總含量的關系可用下式計算：
蛋白質總量=含氮量%×6.25
此法只適用於細胞濃度較高的樣品，同時操作過程也較麻煩，故主要用於科學研究。
2.DNA含量測定法 利用DNA與DABA-2HCl(即新配製的20%W/W，3，5-二氨基苯甲酸-鹽酸溶液)能顯示特殊熒光反應的原理而設計的。將一定容積培養物的菌懸液，通過熒光反應強度，求得DNA的含量，可以直接反映所含細胞物質的量。同時還可根據DNA含量計算出細菌的數量。因為每個細菌平均含DNA8.4×10-5納克。
3.測定細胞乾重法 單位體積培養物中，細胞的乾重可用來表示菌體的生長量。將單位體積培養液中的菌體，以清水洗凈，然後放入乾燥器內加熱或減壓乾燥。其菌體乾重可直接用精密儀器測定。一般來說，細菌的乾重約為濕重的20-25%，即1毫克干菌體=4-5毫克濕菌體=4-5×10 9個菌體。此法較為直接而又可靠，主要用於調查研究。但只適用於菌體濃度較高的樣品，而且要求樣品中不含非菌體的干物質。
4.基他生理指標測定法 微生物新陳代謝的結果，必然要消耗或產生一定量的物質，以表示微生物的生長量。一般生長旺盛時消耗的物質就多，或者積累的某種代謝產物也多。例如通過測定微生物對氧的吸收、發酵糖產酸量、或測定谷氨酸在氨基脫羧酶作用下產生CO2的多少來推知細菌生長情況。這是一種間接方法。使用時必須注意：作為生長指標的那些生理活動項目，應不受外界其他因素的影響或干擾。
可以看出，每種方法都各有優點和局限性。只有在考慮了這些因素同要著手解決的問題之間的關系以後，才能對具體的方法進行選擇。正如前面說過的，平皿菌落計數法是微生物學中應用最多的常規方法，掌握這一方法的原理和實際操作，很有必要。但此法在理論上僅能反映活細胞數。另外，當用兩種不同的方法測量細菌的生長量時，其結果不一致是完全可能的，例如對靜止期培養物進行顯微鏡計數時比平皿菌落計數法所得的數字高得多，因前者包括所有的活細胞與死細胞。而後者只能反映出活細胞數。
測定微生物生長量，在理論研究和實際應用中都十分重要。當我們要對細菌在不同培養基中或不同條件下的生長情況進行評價或解釋時，就必須用量的術語來表示生長。例如，可以通過細菌生長的快慢來判斷某一條件是否適合。生長快的條件，最終的細胞總收獲量可能沒有另一些條件下的收獲量大。在另一些條件下，生長速率雖然較低，但它卻可在一段較長的時間內不斷增加。這種情況可用釁6-5表示。這是同一種菌在兩種不同的培養基上生長情況的比較。這種菌在兩種培養里都能生長。假如在A時測量生長，可以斷定在培養基Ⅱ里生長快；若在B時測量，則在兩種培養基上都生長得很好；可是在C時測量，卻在培養基Ⅰ里生長好些。據此，我們就可以根據需要進行選擇了。如果培養目的是要機體生長得早而快，就選用培養基Ⅱ；如果是要得到大量的細胞，就應選用培養基Ⅰ。因此，只有具備了有關生長的定量方面的知識，才能在實際應用中作用正確的選擇，以利科研和生產。
三、連續培養（詳細講解，讓學生理解並掌握）
將微生物置於一定容積的培養基中，經過培養生長，最後一次收獲，此稱分批培養(batch culture)。通過對細菌純培養的生長曲線的分析可知，在分批培養中，培養基一次加入，不予補充，不再更換。隨著微生物的活躍生長，培養基中營養物質逐漸消耗，有害代謝產物不斷積累，細菌的對數生長期不可長時間維持。如果在培養器中不斷補充新鮮營養物質，並及時不斷地以同樣速度排出培養物(包括菌體及代謝產物)，理論上講，對數生長期就可無限延長。只要培養液的流支量能使分裂繁殖增加的新菌數相當於流出的老菌數，就可保證培養器中總菌量基本不變。50年代出現的連續培養(continuous cultivation)技術就是據此原理而設計的，這種方法就叫連續培養法。連續培養方法的出現，不僅可隨時為微生物的研究工作提供一定生理狀態的實驗材料，而且可提高發酵工業的生產效益和自動化水平。此法已成為當前發酵工業的發展方向。
最簡單的連續發酵裝置包括：培養室、無菌培養基容器以及可自動調節流速(培養基流入，培養物流出)的控制系統，必要時還裝有通氣、攪拌設備。連續培養裝置的一個主要參數是稀釋率(D)，它的定義為：D=FV=流動速率容積。控制連續培養的方法主要有兩種：
9. 如何控制微生物實驗室的質量
一、質量控制相關定義
質量控制：滿足質量要求的操作技術和活動。
質量保證：為了滿足實驗室質量要求 ，制定相應的計劃，實施證明（記錄）所進行的一系列的系統活動。
外部質量控制：通過互相校準和/或檢驗對實驗室的操作和結果所進行的控制。
內部質量控制：實驗室內部採取的以對比分析、跟蹤以及相關方法，對實驗室工作的連續性控制計劃。
質量手冊：是描述質量系統元素的文件或文件的集合。
二、實驗室要求
按國家實驗室認可的概念，是指一個能夠承擔法律責任的實體。這里所指的是實驗室（微檢室）內建立的質量管理的保證體系。人員、房屋、設備滿足檢測工作需要。
1、人員要求
實驗室人員的分類：管理人員、技術人員、技術支持人員等。相應崗位的人員，應具備相應的技術能力，相應的技術能力證明（證書及證件）。微生物檢驗室因有相應技術能力的人負責室內的技術工作，並設立質量監督員。
2、房屋條件要求
房屋要求：具有適宜、足夠寬敞、通風有良好的照明。
房屋內牆面及地等應採用易於清潔的材料，保持房間清潔。
房間的設置，以其開展的工作內容加以分用，設立專用房間。
房間的大小還應根據從事實驗人員的進入數量上加以考慮。
3、環境設施要求
專用房間的溫濕度控制與記錄（樣品存放室）。
特殊環境的微生物指標控制與記錄（無菌室等）。
專用工作室的標准操作規程和定期的檢測校準程序（潔凈室等）。
特殊環境中的專用設施質量控制應符合有關要求（凈化工作台）。
三、設備控制和程序
微生物檢驗常用需監控的設備和儀器：
1）培養箱（生化培養箱或CO2培養箱等）、乾燥箱、高壓滅菌鍋、凈化工作台、pH計、 冰箱，（低溫冰箱或冷櫃）溫度計、紫外燈、顯微鏡、離心機、天平。
2）小計量容器。
3）微生物測定儀器、微生物檢定儀器、空氣采樣器、酶標儀專用等。
1、高壓滅菌鍋的溫度控制
高壓滅菌鍋；生物指示菌法（常用）、化學變色紙片及高壓滅菌鍋溫度計等方法進行檢測。
生物指示菌法是一種高壓滅菌鍋的效果顯示法。
高壓滅菌鍋由專人按作業指導書操作，並做好每一次的作業記錄。
高壓滅菌鍋使用時，內置物品不能太多，單位體積內的內容物（每瓶內的培養基）不能太多。同時應注意內容物不同耐受溫度。總的暴露時間最好不要超過45min。
高壓滅菌鍋日常工作記錄應包含以下信息：高壓滅菌的材料、開始時間、壓力/溫度、取出時間、高壓滅菌膠帶的顏色變化（日常常用無菌培養代替）。
高壓滅菌鍋溫度波動范圍：110，115和121±2℃。
高壓滅菌鍋校準周期一般在半年。
10. 怎樣做好微生物檢驗質量控制
怎樣做好微生物檢驗質量控制
微生物學檢驗室內質量控制包括：①對細菌檢驗人員的要求；②操作手冊；③儀器設備的功能監測；④培養基的質量控制；⑤試劑、染色液及抗血清的質量控制；⑥標本檢驗的質量控制；⑦標准菌株的來源和保存及室內質量的全面控制七個方面。
質量控制：滿足質量要求的操作技術和活動。
質量保證：為了滿足實驗室質量要求
，制定相應的計劃，實施證明（記錄）所進行的一系列的系統活動。
外部質量控制：通過互相校準和/或檢驗對實驗室的操作和結果所進行的控制。
內部質量控制：實驗室內部採取的以對比分析、跟蹤以及相關方法，對實驗室工作的連續性控制計劃。