生物製品反復凍融試驗怎麼做

㈠ 為了保持生物樣品穩定性多採用什麼方法

需要做如下穩定性，每個穩定性試驗均包括三個濃度水平（低、中高），每個水平重復5個樣本。
1 凍融穩定性
從低至高3種不同濃度的質控樣品：LQC、MQC和HQC，經過3次反復凍融（-30℃至25℃）後制備分析。有些公司要求一個凍－融循環必須間隔12hr，即凍12hr後化凍12hr
2。制備後樣本穩定性
從低至高3種不同濃度的質控樣品：LQC、MQC和HQC，按照試驗方法制備5個，將處理後的樣品在模擬進樣環境中中放置24hr後分析測定。
3。室溫放置穩定性（模擬制備樣本環境，目的是為了保證制備過程中樣本穩定）
從低至高3種不同濃度的質控樣品：LQC、MQC和HQC，在室溫下（25℃，模擬制備樣本環境）放置24hr後，按照試驗方法制備分析5個。
4。儲備液穩定性（模擬使用標准儲備液配製血漿樣本的條件，目的是為了保證純品配製及使用過程中穩定）
配製化合物儲備液（標准品溶液），在室溫條件下分別於0hr和6hr進樣。這個只需要一個濃度水平，重復5個樣本
5。長期穩定性（模擬分析樣本儲存條件長期放置，目的是為了保證分析樣本儲存過程的穩定性）
將3個濃度的QC樣品（LQC, MQC,HQC,n=5）在－30度貯存3個月後，與新鮮配製的標准曲線樣品一同進行預處理和測定。從測定結果，可以考察穩定性。
如果你的分析樣本能在2周之內分析完畢，只需做2周的長期穩定性即可。

㈡ mtt的實驗方法

⒈選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由於不同細胞貼壁後面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成數量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。
⒉葯物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是葯物的有效濃度和時間。
⒊ 時間點的設定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，最後得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什麼時候變得平坦了（到了平台期）那個時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑製表現的最明顯）。
⒋培養時間。200ul的培養液對於10的4～5次方的增殖期細胞來說，很難維持68h，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨於靜止，影響結果，我們是在48h換液的。
⒌MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。
⒍理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。
⒎實驗時應設置調零孔，對照孔，加葯孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞碸。對照孔和加葯孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞碸，不同的是對照孔加溶解葯物的介質，而加葯組加入不同濃度的葯物。
⒏避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養液培養細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由於試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小於10%胎牛血清的培養液進行。在呈色後，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。 MTT 溶液的配製方法
通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶於100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃ 避光保存即可。在配製和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。
需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內。
MTT一般最好現用現配，過濾後4℃避光保存兩周內有效，或配製成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那麼多，尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。
MTT有致癌性，用的時候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作台上的照明燈關掉.
配製MTT時用用PBS溶解，也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。
PBS配方：
Nacl 8g
Kcl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
調pH 7.4
定容1L 1、收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。
⒉、5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的葯物，原則上，細胞貼壁後即可加葯，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加葯.一般5-7個梯度，每孔100ul，設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況。
⒊、5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。若葯物與MTT能夠反應，可先離心後棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍後，再加入含MTT的培養液。
5、終止培養，小心吸去孔內培養液。
6、每孔加入150ul二甲基亞碸，置搖床上低速振盪10min，使結晶物臢（Zā）充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
7、同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞碸），對照孔（細胞、相同濃度的葯物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞碸）。 1、收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將①補足的1640（無血清）培養基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養液稀釋 （儲存液100mg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20）；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100ml 1640）。
2、置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h後可跳過步驟4，直接酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）。
4、離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞碸，置搖床上低速振盪10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。 細胞過了30代以後就不要用了，因為狀態不好了；培養板要用好的（最好進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。
接種時最好按照預實驗摸索出的密度接種，因為細胞密度在10000/ml左右時，所測得的OD值的區間即細胞抑制率（或者增值率）的所呈現的線性關系最好，結果最可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯，太密細胞可能都會凋亡，因為細胞長的太快營養會不夠，最後導致死亡。且而細胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關系不佳。故而MTT細胞密度多採用10000/ml，100ul/孔。
細胞密度要根據不同細胞的特點來定。如果你做的葯品對細胞具有刺激作用那麼取小點的細胞濃度，如果你做的葯品對細胞具有抑製作用那麼取大點的細胞濃度，這樣與對照的區別更明顯，數據更好。懸浮細胞每孔的細胞數可達到105，貼壁細胞可為103-104。
其它的聲音
⒈首先細胞的接種密度一定不能過大，一般每孔1000個左右就夠了，我認為寧少勿多。尤其是對於腫瘤細胞。10000/孔是太高了，這樣即使葯物有作用，MTT方法也是表現不出的，最佳點板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會很大。（對於不同的細胞，每孔細胞數要摸索一下，對照組OD在1.4以下為佳，當然通常來說更不要超過2。）
⒉MTT本身就是比較粗的實驗，增殖率10%左右的波動都不算奇怪。特別是新手，20%的波動也是常見的，所以很可能是技術原因引起的，特別是種板技術一定要過關。
⒊我做的是腫瘤細胞的MTT實驗，這種細胞長的很快一開始我是用100000/ML的濃度來接種的，結果細胞長的太滿結果是沒有梯度也沒有線性關系。後來調整濃度，用過40000~80000/ML的濃度都做過MTT實驗，結果發現做的結果比較好點的是60000~70000/ML的濃度組的。用40000/M的濃度的組，由於細胞少，葯物作用的梯度還是有，只是沒有很好的線性關系。還有根據細胞生長速度以及葯物的特性（有時間依賴性和濃度依賴性的葯物）來確定培養時間是48小時還是72小時。
注意細胞懸液一定要混勻，以避免細胞沉澱下來，導致每孔中的細胞數量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會在8%左右。另外，吹散次數過多也會影響細胞活力。所以要熟練些、快些上板。

㈢ 具體方法步驟是什麼呢

蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：

（一）材料的預處理及細胞破碎

分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來並保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要採用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：

1. 機械破碎法

這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。

2. 滲透破碎法

這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。

3. 反復凍融法

生物組織經凍結後，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜採用此法。

4. 超聲波法

使用超聲波震盪器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破壞微生物細胞等。

(二) 蛋白質的抽提

通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利於蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。

（三）蛋白質粗製品的獲得

選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：

1. 等電點沉澱法

不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉澱法使它們相互分離。

2. 鹽析法

不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉澱析出。被鹽析沉澱下來的蛋白質仍保持其天然性質，並能再度溶解而不變性。

3. 有機溶劑沉澱法

中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉澱出來，因此可用來沉澱蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由於有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。

（四）樣品的進一步分離純化

用等電點沉澱法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。

㈣ 生物學實驗中病毒怎麼保種和接種

1.應該在細胞狀態最好的時候,進行病毒接種或復甦;

2.接種前頭天,進行細胞傳代,細胞數量應以能讓細胞在第二天內達到覆蓋滿90%的培養瓶為准,並且一定要在細胞傳代後48h內接種病毒;

3.第二天細胞長為單層且狀態較好時,開始接種病毒;

4.先移棄培養瓶中的生長液,用1*PBS輕輕洗細胞面3次,最後用移液管吸干凈培養瓶中殘留的1*PBS.為保持培養瓶中pH環境的穩定,及減少1*PBS對細胞的刺激作用,可再用生長液輕輕洗細胞面1次,移棄液體,並用移液管吸干凈瓶中殘留生長液;

5.接種病毒:

①. 一般種毒量按最後所需加入維持液體積的10%,15%或20%來計算,一般10%即可,若希望病變速度快一些,可以加大種毒量,如15%或20%;

②. 如果用小塑料瓶種毒,一般該培養瓶加8-9ml培養液,加入0.8ml病毒即可,病毒加入後,蓋上瓶塞,輕輕將搖晃瓶子,讓病毒液在細胞面上來回10幾次;

③. 在對照細胞中,加入相同的0.8ml維持液;

6.將種毒瓶和對照瓶一起放入37oC,CO2烘箱培養1h,其中每隔15min,需要將種毒瓶和對照瓶拿出,輕輕搖晃瓶子,保證病毒液或維持液能在細胞面上來回20-30次,使病毒液或維持液能充分接觸細胞;

7.1h後,在晃動瓶子4次後,重新進入無菌間,在培養瓶中加入維持液;

①. 維持液配方一:

MEM 2鸖 3%谷氨醯胺 1%雙抗 NaHCO3(其用量以調節pH至7.0為准,濃度為6%);

②. 維持液配方二:

MEM 3%谷氨醯胺 1%雙抗 NaHCO3(其用量以調節pH至7.0為准,濃度為6%);

③. 一般還是使用有FBS的維持液,因為對細胞有一定的保護作用;

8.將加完維持液的培養瓶放回37oC,CO2烘箱培養,每天觀察,如果有條件,可以每天拍照,直到有90%的細胞出現CPE後,可以進行收毒;

9.收毒可以用反復凍融方法:即將細胞培養瓶放入-20oC冰箱,凍起來後,直接拿出來等起融化後,使勁搖晃瓶子,讓細胞破裂釋放出病毒顆粒,這樣反復4次,即可達到收毒目的;

10.收毒後的病毒液可以用移液管吸入離心管,在1,000-2,000轉下離心10mins,以此除去細胞碎片,將離心後的上清夜轉移,棄底部沉澱,該上清液即可用於病毒濃縮醇化,或病毒滴度測定,或中和試驗等。

㈤ 設計實驗從牛奶中分離蛋白質

從牛奶中分離酪蛋白和乳糖
一、引言
牛奶中主要的蛋白質是酪蛋白，含量約為35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸鈣-磷酸鈣復合體膠粒存在，
膠粒直徑約為20～800納米，平均為100納米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白會沉澱，加工後可製得乾酪或乾酪素。本實驗利用加酸，當達到酪蛋白等電點PH=4.7時，酪蛋白沉澱。脫脂乳中除去酪蛋白後剩下的液體為乳清，在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白，還有溶解狀態的乳糖，乳中糖類的99.8%以上是乳糖，可通過濃縮、結晶製取乳糖。
二、實驗材料和試劑
脫脂乳或脫脂奶粉。
醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（PH=4.7），95%乙醇，乙醚，碳酸鈣粉末，苯肼試劑。
三、實驗步驟
1. 從牛奶中分離酪蛋白
在燒杯中加入2g脫脂奶粉，再加入40ml40℃，PH=4.7的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液40ml，
用PH精密試紙檢驗液體的PH值。靜置冷卻至室溫，傾去上層清液（留作分離乳糖用），剩下的懸浮液分別裝入兩支離心試管中，用轉速為2000轉/分離心分離3～5分鍾，傾出上層清液，（合並於上一清液中），得酪蛋白粗品。於離心管中加入5ml蒸餾水，用玻棒充分攪拌，洗滌除去其中的水溶性雜質（如乳清蛋白，乳糖以及殘留的緩沖溶液），離心後棄去上層液，再用蒸餾水洗一次。於試管中加入5ml95%乙醇，充分攪拌，離心後棄去乙醇溶液，用乙醇洗滌主要是除去磷脂類物質。最後再用5ml乙醚以同樣方法洗滌，以除去脂肪類物質。將酪蛋白沉澱物涼干，稱重、並計算得率。
2. 從牛奶中分離乳糖
在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g CaCO3粉末，攪拌均勻後加熱至沸。加CaCO3的目的一方面是中和溶液的酸性，防止加熱時乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉澱。過濾除去沉澱，在濾液中加入1～2粒沸石，加熱濃縮至3～5ml，加入10ml 95%乙醇（注意離開火焰）和少量活性炭，攪拌均勻後在水浴上加熱至沸騰，趁熱過濾，濾液必須澄清。加塞放置過夜，乳糖結晶析出，抽濾，用95%乙醇洗滌產品。
3. 乳糖成脎試驗
取自製乳糖溶於少量水中，濃度約為5%，在試管中加入1ml乳糖溶液，1ml苯肼試劑①，搖勻，試管口用棉花塞住，在沸水浴中加熱，並不時振搖，加熱10～15分鍾後，取出放置冷卻，乳糖脎成結晶析出。取少量乳糖脎在顯微鏡下觀察其結晶形態，可證實為乳糖。
①苯阱試劑有毒，小心使用，勿觸及皮膚，如觸及皮膚先用稀醋酸洗，再用水洗。

另外附上：
蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：

（一）材料的預處理及細胞破碎

分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來並保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要採用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：

1. 機械破碎法

這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。

2. 滲透破碎法

這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。

3. 反復凍融法

生物組織經凍結後，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜採用此法。

4. 超聲波法

使用超聲波震盪器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破壞微生物細胞等。

(二) 蛋白質的抽提

通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利於蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。

（三）蛋白質粗製品的獲得

選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：

1. 等電點沉澱法

不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉澱法使它們相互分離。

2. 鹽析法

不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉澱析出。被鹽析沉澱下來的蛋白質仍保持其天然性質，並能再度溶解而不變性。

3. 有機溶劑沉澱法

中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉澱出來，因此可用來沉澱蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由於有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。

（四）樣品的進一步分離純化

用等電點沉澱法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品

㈥ 凍融試驗的試驗內容

美國FDA1998年6月發表的穩定性指導原則草案對此問題提出了一個解決的辦法，即對於易發生物相分離、黏度減小、沉澱或聚集的葯品需通過熱循環實驗來驗證其運輸或使用過程中的穩定性。作為影響因素實驗的一部分，應模擬葯品在運輸與使用過程中可能碰到的溫度條件下循環考察上市包裝的葯品的穩定性。具體方法如下：
1）對於溫度變化范圍在冰點以上的葯品，熱循環實驗應包括三次循環，每次循環應在2~8℃兩天，然後在40℃加速條件下考察兩天。
2）對於可能暴露於冰點以下的葯品，熱循環實驗應包括三次循環，每次循環應在-10~-20℃兩天，然後在40℃加速條件下考察兩天。
3）對於吸入氣霧劑，推薦的熱循環實驗包括一天內進行三到四次六小時的循環，溫度在冰點以下和40℃（75~85%RH）之間，該實驗需持續考察六周。
4）對於冷凍保存的葯品，應考察該葯在微波爐或熱水浴中加速融化時的穩定性，除非說明書中明確禁止如此操作。
如經過驗證，也可採用其他的方法進行考察。