生物檢測病毒的方法有哪些

1. 病毒檢測方法

檢測病毒方法有：特徵代碼法、校驗和法、行為監測法、軟體模擬法， 這些方法依據的原理不同，實現時所需開銷不同，檢測范圍不同，各有所長。
1、特徵代碼法：
特徵代碼法被早期應用於SCAN、CPAV等著名病毒檢測工具中。國外專家認為特徵代碼法是檢測已知病毒的最簡單、開銷最小的方法。

2、校驗和法：
將正常文件的內容，計算其校驗和，將該校驗和寫入文件中或寫入別的文件中保存。在文件使用過程中，定期地或每次使用文件前，檢查文件現在內容算出的校驗和與原來保存的校驗和是否一致，因而可以發現文件是否感染，這種方法叫校驗和法，它既可發現已知病毒又可發現未知病毒。在SCAN和CPAV工具的後期版本中除了病毒特徵代碼法之外，還納入校驗和法，以提高其檢測能力。

3、行為監測法：
利用病毒的特有行為特徵性來監測病毒的方法，稱為行為監測法。通過對病毒多年的觀察、研究，有一些行為是病毒的共同行為，而且比較特殊。在正常程序中，這些行為比較罕見。當程序運行時，監視其行為，如果發現了病毒行為，立即報警。

4、軟體模擬法：
多態性病毒每次感染都變化其病毒密碼，對付這種病毒，特徵代碼法失效。因為多態性病毒代碼實施密碼化，而且每次所用密鑰不同，把染毒的病毒代碼相互比較，也無法找出相同的可能做為特徵的穩定代碼。雖然行為檢測法可以檢測多態性病毒，但是在檢測出病毒後，因為不知病毒的種類，難於做消毒處理。

2. 常用的植物病毒分子檢測診斷技術有哪些

1 RT-PCR技術

RT-PCR是英文Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction的簡寫，中文稱之為反轉錄聚合酶鏈式擴增反應。在反轉錄酶M-MLV或AMV的作用下，以RNA為模板、以20個左右的核苷酸為引物，反轉錄合成cDNA。再以cDNA為模板，兩個3和5端互補寡核苷酸引物，由Taq聚合酶從5→3進行一系列DNA聚合反應，擴增出所需要的目的DNA，可將極微量的靶DNA特異性地擴增上百萬倍，從而大大提高了對DNA分子的分析和檢測能力。

利用PCR技術，可以檢測到單分子核酸或對每10萬個細胞中僅含1個靶核酸分子的樣品。因此，該技術創立至今十年來，迅速地形成為常規的標准程序，為生物科學提供了從微量微生物材料中快速得到大量特定的遺傳物質的實驗手段。PCR在植物病毒的檢測、鑒定和植物病毒的檢疫工作中也將具有重要意義。如果病毒核酸是DNA類型，不需要反轉錄（RT），直接可以進行聚合酶鏈式擴增（PCR）。而大多數植物病毒的核酸類型為RNA，因此，需要先進行反轉錄（RT），再進聚合酶鏈式（PCR）擴增。用1%瓊脂糖和5%聚丙烯醯胺進行電泳，即可檢出擴增片段。

這里以香石竹斑駁病毒為例，介紹RT-PCR檢測香石竹斑駁病毒的實驗技術。

用已知病毒核酸保守序列設計引物，分別提取病、健植物總RNA為模板，進行RT-PCR反應，瓊脂糖或PAGE電泳檢測擴增結果。感病材料會出現特異擴增帶。如香石竹斑駁病毒（Carnation mottle virus，CarMV）。根據該病毒的RNA序列設計引物，P1引物（5′端引物，與CarMV RNA的2516～2538同源）：5′-〔TTA，GTT，TGC，CCC，CGT，TGG，TAA，CC〕-3′。P2引物（3′端互補引物，與CarMV RNA的3100～3124對應）：5′-〔AAG，CGT，CAT，CGT，TGA，ATC，CCA，GAG〕-3′。目標片段大小為608nt。對病健材料進行了RT-PCR，從感病材料中可以擴增出了大約600bp的特異片段，而健康植物無此擴增帶。用此方法可以快速、准確地檢測香石竹斑駁病毒。操作如下：

（1）RNA提取

分別取感病及健康葉片0.2～0.5g，加液氮研成粉末，按1g∶2ml的比例懸浮於RNA抽提緩沖液（20mmol/L Tris-HC1 pH8.0，1mmol/L EDTA，1%SDS，0.2%巰基乙醇）。按1∶1比例加入水飽和苯酸—氯仿—異戊醇（25∶24∶1）混合液，抽提數次，乙醇沉澱總RNA。溶入20～50μl TE緩沖液中，-70℃冰箱保存備用。

（2）cDNA合成反應體系組分為

待檢測材料總RNA或健康材料總RNA各0.5/μg，20pmol/L引物P21μl，5×MMLV緩沖液4μl，ddH2O7μl，該混合液於88℃處理10min後冰上迅速冷卻，然後加入10mmol/L dNTPs 1μl，40U/μl Rnasin 0.5μl，100mmol/L DTT 2μl，200U/μl MMLV逆轉錄酶1μl，混合後經42℃處理lh，合成cDNA。

（3）PCR擴增

取上述的cDNA各0.5μg，分別加入10×PCR緩沖液5μl，20pmol/L引物P1和引物P2各1μl，10mmol/LdNTPs 1μl，88℃10min之內加2U/μl Taq DNA聚合酶1μl，加ddH2O至50/μl。然後在液面上加三滴石蠟油，進行如下PCR熱循環：94℃3min，60℃1min，72℃1min，1次循環；94℃40s、60℃1min，72℃1min，35次循環，最後72℃延伸10min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查。攜帶CarMV的樣品會出現600bp的特性擴增帶。如圖1。

圖1 CarMV PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果

3. 迄今為止，我國檢測新冠病毒有哪些方法

1、熒光PCR法。PCR法指的是聚合酶鏈式反應，能將微量的DNA大幅增加。熒光PCR檢測的原理為——隨著PCR的進行，反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。最後通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。
2、聯合探針錨定聚合測序法。這種檢測主要是用專門的儀器檢測測序載片上DNA納米球攜帶的基因序列。這種檢測的靈敏度高，不容易漏診，但結果也容易受多種因素的影響而不準。
3、恆溫擴增晶元法。檢測原理是基於核酸之間的互補結合特性開發的一種檢測方式，能夠用於定性或定量測量存在於生物體內的核酸。
4、病毒抗體檢測。抗體檢測試劑是檢測血清中由病毒進入人體後刺激人體產生的IgM或IgG抗體，IgM抗體出現較早，IgG抗體出現較晚。
5、膠體金法。膠體金法是用膠體金試紙進行檢測，也就是常說的快速檢測試紙。這種試紙經過特殊標記，上面有孔，用於滴入受檢者的血清樣本。
6、磁微粒化學發光法。化學發光法是一種高度敏感的免疫檢測，凡具有抗原性的物質都可以用這種方法測定。

4. 病毒學研究的基本方法有哪些

（一）生物學特性測定：在寄住上的反應——症狀、傳播等；
（二）病毒分離與培養：提純與純化，二元培養法；
（三）光鏡與電鏡觀察：病毒粒子和病毒與相應抗血清的特異性免疫吸附情況；
（四）免疫學技術：以血清學和組織免疫化學方法檢測材料帶毒情況，多克隆抗體，單克隆抗體；
（五）分子生物學技術：核酸分子雜交，PCR等。

5. 病毒鑒定常用方法有哪些

寨卡病毒病的檢測方法包括病毒核酸檢測、IgM抗體檢測、中和抗體檢測和病毒分離等。寨卡病毒與黃病毒屬其他病毒具有較強的血清學交叉反應，目前主要採用病毒核酸檢測。
開展蚊媒寨卡病毒檢測時，對捕獲的伊蚊成蚊或幼蟲進行病毒核酸檢測。
開展寨卡病毒實驗室檢測時，應同時考慮登革病毒和基孔肯亞病毒感染可能。登革病毒和基孔肯亞病毒實驗室檢測應按照相應的技術指南開展。
（一）臨床標本檢測。
1．病原學檢測
病原學檢測主要適用於急性期血液標本，一般認為發病7天內檢測陽性率高。
（1）核酸檢測：採用熒光定量RT-PCR方法，是目前早期診斷寨卡病毒病的主要檢測手段。
（2）病毒分離：將標本接種於蚊源細胞（C6/36）或哺乳動物細胞（BHK21、Vero）進行分離培養，出現病變以後，用檢測核酸的方法鑒定病毒。也可使用乳鼠腦內接種進行病毒分離。
2．血清學檢測
（1）血清特異性IgM抗體：發病3天後可檢出病毒特異性IgM抗體，但發病7天後檢出率高。可採用ELISA、免疫熒光等方法檢測。IgM抗體陽性，提示患者可能新近感染寨卡病毒，但寨卡病毒IgM抗體與登革病毒、黃熱病毒和西尼羅病毒等黃病毒有較強的交叉反應，易於產生假陽性。
（2）中和抗體：採用空斑減少中和試驗方法檢測。患者恢復期血清中和抗體陽轉或滴度較急性期呈4倍及以上升高，且排除登革、乙腦等其他常見黃病毒感染，可以確診。
（二）媒介標本檢測。
1．標本處理
將分類後的伊蚊成蚊或幼蟲，按照採集地點，每10～20隻為一份進行研磨處理。
2．病毒核酸檢測
用RT-PCR的方法進行寨卡病毒核酸檢測
3．病毒分離
病毒核酸陽性的標本進行病毒分離。

6. 如何利用生物學方法鑒別植物病毒

在植物病毒診斷中所採用的生物學方法是基本的手段，也是取得該病毒有關特性的第一手資料。生物學測定方法有：鑒別寄主或指示植物反應，傳播途徑測定，寄主范圍測定等。

鑒別寄主（診斷寄主）是指病毒或某一株系在一些特定植物上能引起專化性症狀反應，這種專化性或特殊症狀反應與其他病毒在該植物上的侵染反應有差異。這些或這種植物就可作為某一病毒或株系的鑒別寄主或指示植物。如煙草花葉病毒（TMV）在心葉煙（Nicotiana glutinosa）上產生枯斑反應，馬鈴薯X病毒（PVX）摩擦接種到千日紅（Gomphrena globosa）上產生具有紅色邊緣的局部枯斑，黃瓜花葉病毒（CMV）在莧色藜（Chenopodium amnticolor）上表現局部枯斑，大麥黃矮病毒（BYDV）在燕麥（Avena sativa）上表現為紫紅色葉片。鑒別寄主除了對病毒進行生物學鑒定外，還可用於病毒的生物學分離。即利用植物病毒具有局部枯斑和系統症狀的特點，根據症狀的不同來區分單一病毒。如利用枯斑反應進行單斑分離，然後將單斑分離的病毒接種到系統症狀的植物上進行繁殖，就會得到單一病毒的分離物。這一過程可以反復進行，直到確定已排除了其他病毒混雜時，就可大量繁殖和提純，以便進行進一步鑒定。

對一些不能通過汁液摩擦接種的病毒，需要採用蚜蟲、葉蟬、飛虱等介體昆蟲進行傳毒試驗，或通過嫁接的方法將要鑒定或檢測的植物標樣傳播接種到鑒別寄主上進行生物學鑒定。如大麥黃矮病毒（BYDV）只能通過蚜蟲傳毒到指示植物燕麥上進行生物學鑒定，蘋果銹果類病毒（ADFVd）只通過嫁接的途徑來接種到指示植物上進行鑒定。而對那些既不能通過汁液摩擦接種傳播，又不知道其傳播途徑的病毒，則要首先進行其傳播途徑的測定。

生物學鑒定雖然具有較穩定的試驗結果，操作簡單，要求的設備和技術不高，但所需的時間較長，而且試驗結果常受到環境條件的影響，如溫度、光照常影響症狀表現。

7. 高中生物。RT-PCR怎樣檢測病毒含量呢

RT-PCR檢測方法的具體步驟如下：
（一）RNA提取
1、根據標本數量分裝RLT液：從Kit中取出RLT液，用1.5mL離心管分裝，每管500μL（在體系配製區操作）。
2、在生物安全櫃內將采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養物（雞胚尿囊液或細胞培養液）取100μL加入RLT液管中，充分混勻。 3、每管分別加入5μL β-巰基乙醇，混勻後依次加入600μL 70%的乙醇，充分混勻。
4、從Kit中取出帶濾柱的2mL收集管，打開包裝將其做好標記。取步驟（3）中的混合液600μL加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。
5、濾柱仍放回收集管上，將步驟（3）剩餘的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。
6、於濾柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，離心15s。
7、從QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支幹凈的2mL收集管，將離心後的濾柱移到新的收集管上，於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，離心15s。
8、棄收集管中的離心液，再於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，離心2min。
9、將濾柱移到一個干凈的1.5mL eppendorf管上，向濾柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室溫靜置1~3min。
10、12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實驗或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之間加44mL無水乙醇。
（二）反應體系配製
1、實驗設計： 檢測標本RNA
陰性對照：無菌水（標本RNA提取時，跟標本同時提取無菌水。） 陽性對照：已知病毒RNA

2、PCR反應體系配製（在體系配製區配反應液） 1）按下表加入試劑： PCR反應體系
對每一個建立的反應確定反應數（n=擬進行的PCR管數，包括陰性，陽性對）。考慮到陰性無模板對照，陽性對照，誤差，制備過量的反應混合物是必要的。具體如下：
（1）如果包括對照，樣品的數量（n）為1到14，那麼N=n+1；
（2）如果包括對照，樣品的數量（n）大於15，那麼N=n+2。
2）將上述反應液混勻，分裝到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分別做好標記。
3）加RNA模板（在核酸提取區）
將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對照管（5μL無菌水），然後分別加標本RNA（每管5μL），最後加入陽性對照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反應
將上述加好模板的反應管混勻，短暫離心後放入PCR儀進行RT-PCR 擴增。
4、RT-PCR產物檢測
1）2.0％瓊脂糖凝膠制備：稱取2.0g Agarose，倒入耐熱玻璃瓶內，再加入電泳液（1×TBE）100mL，輕輕混勻後加熱，使Agarose完全熔化。待Agarose膠溫度降至50～60℃左右，加入核酸染料，輕輕混勻（不要產生氣泡）。待膠溫度降至50℃左右時，將其倒入制膠板，插好電泳梳子。待膠完全凝固（約30～60min）之後，將梳子拔出。
2）將制備好的電泳膠放入電泳槽（帶梳子孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TBE）浸過膠面即可。
3）PCR產物各取10μL，加入2μL上樣緩沖液（6×Loading Buffer），混勻後加入電泳膠孔內（先加Marker（DL－2000）5μL，然後依次加標本PCR產物，再加陰性對照，最後加陽性對照產物）。 4）電泳電壓100V，約30～40min後看結果。 5）將電泳膠放入凝膠成像系統觀察結果並照相。
5、結果判斷。

8. 植物病毒檢測方法

植物病毒病是農業生產上一種重要病害，嚴重影響農作物的產量和質量, 目前還沒有1種治療效果較理想的葯劑，對發病植株做到早期診斷及提前檢測就顯得尤為重要。植物病毒學歷經近百年的發展，植物病毒的檢測方法與手段也在不斷發展與改進。常用的方法有侵染力測定法、血清學方法、電子顯微鏡計數和分子生物學法等。
1.4.1侵染力測定法
侵染力測定法是將病毒樣本接種在植物上，根據侵染力的大小定量。它的靈敏度在所有定量法中是比較高的，而且是其他定量法的基礎。設計一種新的定量法，如果不經過侵染力的驗證，將無法判斷測定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力測定法包括局部枯斑法、澱粉－碘斑法、系統感染率的測定法等。侵染力測定多用粗汁液來接種，為了避免抑制物質的作用和使半葉枯斑數目控制在一定范圍，須用緩沖液稀釋接種物。
局部枯斑法 1929年F.O.Holmes發現TMV在心葉煙（Nicotiana glutinosa）接種葉片上引起局部壞死斑點，在一定的病毒濃度范圍內，所產生的斑點數目與病毒濃度成正比例。這一發現成為病毒侵染性定量測定的基礎（田波，1987）。所有機械傳染的病毒都有可能應用局部斑點法，但實際上只有少數病毒具有可用於定量測定的局部斑寄主。一個待測樣品所形成的斑點數目除取決於接種物中病毒濃度外，還受試驗植物種類、環境條件和接種物中是否含有病毒抑制物質的影響。
澱粉－碘斑法 當所研究的病毒沒有過敏性枯斑寄主時，採用此法。Holmes（1931）發現TMV接種的煙葉上有時形成明顯的黃化斑塊，但不能用於計數。將這種接種葉用95％乙醇加熱到80℃固定，然後用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色時，則侵染點處出現澱粉－碘的藍色反應。當下午採摘葉片，褪色過夜，然後用碘液染色，則侵染點較周圍組織著色淺；當採摘葉片前，植株先在黑暗中放幾個小時，再用碘液染色，則侵染點組織著色深。這是由於病毒侵染既降低光合組織中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物從光合組織中的運出。澱粉－碘染色的強弱受環境條件的影響較大，不如局部枯斑法可靠，但在標准化條件下仍可用於侵染性的定量測定。
侵染性滴度法 當上述方法都不適用時，可採用侵染性滴度法。即把欲測定樣品用緩沖液稀釋，可用十倍稀釋、成倍稀釋、半倍稀釋或更低稀釋。這種方法的缺點是需用大量實驗植物，但可得到較好的結果。此方法可用於介體傳染的病毒。