分子生物學中Tm值有哪些

1. 名詞解釋：DNA的Tm值

dna的tm值是將DNA加熱變性使DNA的雙螺旋結構，失去一半時的溫度稱為該DNA的熔點或溶解溫度，用Tm表示。

DNA 分子結構中，兩條多脫氧核苷酸鏈圍繞一個共同的中心軸盤繞，構成雙螺旋結構。脫氧核糖-磷酸鏈在螺旋結構的外面，鹼基朝向裡面。兩條多脫氧核苷酸鏈反向互補，通過鹼基間的氫鍵形成的鹼基配對相連，形成相當穩定的組合。

(1)分子生物學中Tm值有哪些擴展閱讀：

變性（熔解）溫度，指變性核酸的紫外吸收增加量達到最大量的一半時的溫度T。Tm值與DNA中的G-C鹼基對含量之間存在正比例關系，可以用一個經驗公式表示：Tm=69.3+0.41(G+C)。

所有DNA功能都取決於其與特定蛋白質的相互作用。這些相互作用可以是非特異性的，也可以是極其特異性的。還有許多可以結合DNA的酶，其中，在DNA轉錄和復制中復制DNA序列的聚合酶特別重要。

在鹼性氨基酸殘基上所發生的化學修飾有甲基化、磷酸化與乙醯化等，這些化學作用可使DNA與組織蛋白之間的作用強度發生變化，進而使DNA與轉錄因子接觸的難易度改變，影響轉錄作用的速率。

2. 分子生物學問答題總結

1．DNA是遺傳物質的兩個重要試驗的主要步驟？
答：（1）Griffith及Avery細菌發生遺傳轉化試驗證明了
DNA是病毒的遺傳物質，其具體步驟為：首先用活S型
肺炎鏈球菌感染小鼠，小鼠死亡，而活R型感染，小鼠不死
接著用滅活的S型和R型感染小鼠，結果都不致死；
但是用滅活的S型和活R型混合感染小鼠，小鼠死亡，解剖
小鼠發現有活的S型致病菌，分離死S型細菌各組分與活
R型混合感染小鼠，發現
只有S型DNA能使R型
細菌發生轉化，獲得致病力，此實驗證明DNA就是遺傳物質。
（2）Hershey用噬菌體感染細菌的試驗證明DNA
是細菌的遺傳物質。其具體步驟為：在含有放射性標記的
35S和32P的氨基酸或核苷酸培養液中培養噬菌體，獲得含
放射性標記的噬菌體，用
這些放射性噬菌體感染無放射性大腸桿菌，經過1-2次傳代
後，子代噬菌體中幾乎
不含帶35S標記的蛋白質，但還有30%的32P標記說明在
傳代過程中發揮作用的是DNA而不是蛋白質。
2、簡述中心法則的主要內容？
(1) DNA序列是遺傳信息的貯存者，通過自主復製得到永存
；(2) DNA通過轉錄生成RNA;
(3) 含遺傳信息的mRNA通過翻譯生成蛋白質來控制生命
現象；(4) 同時某些RNA可以通過逆轉錄將遺傳信息傳到
DNA；(5) 某些RNA自身
還可進行復制使其遺傳信息得以永存。
1、 原核和真核生物在基因組DNA結構上有哪些差異？
原核：（1）基因組較小，環狀雙螺旋DNA與DNA結合
蛋白結合成帶有單拷貝基因的單染色體（2結構簡練幾乎
全部由功能基因和
調控序列組成，幾乎每個基因序列都與其所編碼的蛋白質呈
4）有些原核生物基因組內存在基因重疊現象，但編碼序列
一般不重疊。（5
）基因是連續的，沒有內含子。
真核：（1）線性DNA與組蛋白結合形成染色體形式
一般有多條。（2） 數量龐大含有大量重復序列（3）
基因組中多數為非編碼序列
（4含有割裂基因 （5具有多態性（6轉錄產物為單順
反子 （5）具有端粒結構
2、作為遺傳物質應該具備哪些特性？為什麼說DNA適合
作為遺傳物質？
遺傳物質特性：貯存並表達遺傳信息，能把信息傳遞給
子代，物理和化學性質穩定，具有遺傳變化的能力
DNA特性：各異的鹼基序列儲存大量的遺傳信息，DNA
的復制是其表達和傳遞遺傳信息的基礎，通過磷酸二酯鍵
相連，形成雙螺旋結構，生理狀態下物理、化學性質穩定，
有突變和修復能力，
可穩定遺傳是生物進化的基礎。
3、簡述DNA雙螺旋結構的主要特點
雙鏈反向平行，具有5『-3』極性，圍繞中軸，螺旋盤旋，
磷酸，脫氧核糖為骨架，以磷酸酯鍵相連，位於外側，
鹼基互補配對，以氫鍵相連，位於內側，大溝，小溝交替
出現。
4、簡述真核染色體的組裝過程
DNA鏈盤繞由H2A,H2B，H3,H4組成的組蛋白八聚體核心
形成念珠狀結構的核小體，兩端由H1封阻。核小體之間
以DNA鏈連接，形成10nm纖絲狀結構，螺旋後形成30nm
螺紋管結構，折疊盤繞形成染色體。
5、影響DNA穩定性的因素有哪些
氫鍵，磷酸酯鍵，0.2 M Na+ 生理鹽條件，鹼基堆積力
(范德華力) ，疏水作用力
6、請問哪些條件可促使DNA復性(退火)
降低溫度、pH值和增加鹽濃度可以促進DNA復性(退火)
7、影響Tm的因素有哪些
（1）在 A, T, C, G 隨機分布的情況下 ，決定於GC含量，
GC含量越高，Tm越大
（2）GC%含量相同的情況下， AT形成變性核心，變性
加快，Tm 值小
（3）對於大片段長短對Tm值的影響較小, 與組成和排列
相關
（4）對於小片段，片段愈短， 變性愈快，Tm值愈小
（5）變性液中含有尿素，甲醯胺等可降低Tm
（6）鹽濃度和PH值也會影響Tm
1、簡述原核和真核DNA復制的特點？
（1）原核為單復制起點，真核為多復制起點（2）原核
復制子大而少，真核復制子小而多（3）真核復制起始受許可
因子的控制 （4）
真核復制叉移動的速度快，原核速度慢（5）真核岡崎片段
小，原核大（6）真核復制存在端粒和端粒酶（7）真核原核
DNA聚合酶種類，結構，
作用上有差異（8）真核生物DNA復制的起始需要起始原點
識別復合物（ORC）參與
2、線性DNA如何解決末端復制的問題？
（1）通過將線性復制子轉變為環狀或多聚分子。（2）某種
蛋白質可能會介入，在真正的末端上啟動。（3）DNA可
形成特殊的結構，如在末端形成發夾。使分子沒有游離末端
。（4）末端是可變的，而不是精確確定的。
3、列舉參與DNA復制過程中的主要酶及其功能
解旋酶：解開雙螺旋，推動復制叉向前延伸
SSB：使DNA單鏈保持一種伸展 構象，作為模板；使解開
的單鏈不形成發卡結構；保護DNA單鏈不受Dnase水解
螺旋酶：消除正超堆積，減少能量需求，有利於DNA解鏈
引物酶：合成的引物，減少致死突變。
DNA連接酶：催化雙鏈DNA上的單鏈斷點的5』-與3』-生成
磷酸二酯鍵，封閉DNA雙鏈斷點
DNA聚合酶：聚合作用 ，3』→5』外切酶活性（校對作用）
，5』→3』外切酶活性（切除修復作用）
4、請以原核生物為例，說明DNA復制的過程
起始蛋白復合體與DNA鏈復制起始點結合，在解旋酶和單鏈
結合蛋白作用下解旋，啟動復制起始
起始形成的復制引發體在後隨鏈上合成多個RNA引物，DNA
聚合酶以核苷酸為底物延伸前導鏈和後隨鏈。後隨鏈合成的
不連續岡崎片段用
DNA連接酶連接
復制到達復制終止序列，在終止蛋白作用下終止復制。
5、DNA復制過程中如何保證其遺傳信息傳遞的忠實性？
（1）鹼基配對原則（2）DNApol的3』?5』外切酶活性（校正
） （3）DNApol只能從引物的3』 端延伸DNA（切除），
需要RNA引物，而RNA引物最終被降解而避免錯誤（4）
半不連續機制，有利於錯配鹼基的校正（5）修復系統有多種
機制和酶
6、DNA連接酶對於DNA的復制是很重要的，但RNA的
合成一般卻不需要連接酶。解釋這個現象的原因
在DNA復制時，連接酶對於後隨鏈的合成是重要的，因為
它能將岡崎片段的5』端與它前面的另一條鏈的3』端連接起
來。RNA的合成既能以
DNA為模板(RNA聚 合酶活性)，又能以RNA為模板(
RNA復制酶活性)；相應的，先導鏈的合成沿著5』→3』
方向進行，不需要連接酶。
7、解釋在DNA復制過程中，後隨鏈是怎樣合成的
因為DNA聚合酶只能朝著5』→3』的方向合成DNA，
後隨鏈不能象前導鏈那樣總是朝著同一方向合成，滯後鏈是
以大量獨立
片段的形式(岡崎片段)合成的，每個片段都是以5』→3』方向
合成，這些片段最後連在一起形成一連續的多核苷酸鏈。
每個片段都獨立地被引發，聚合和連接
1、列出真核生物mRNA與原核生物mRNA的區別：
原核生物mRNA的半衰期短，多以多順反子形式存在，5′
端無帽子結構，3′端沒有或有較短的polyA尾巴。單在
原核生物起始密碼上游具有
能與核糖體16SrRNA3′端反向互補的序列，稱SD序列
。原核生物mRNA的起始密碼子有AUG、GUG和UUG三種
。轉錄和翻譯在同一區域進行
真核生物mRNA半衰期相對較長，多以單順反子形式存在
，5′端有GTP倒扣形成的帽子結構，3′端有較長的polyA
尾巴。只有AUG一種起始密碼子。轉錄在核內而翻譯在核外
進行。
2、概括說明σ因子對啟動子調節的輔助功能。
σ因子是RNA聚合酶的別構效應物，能增加聚合酶對啟動子
的親和力，同時降低聚合酶對非啟動子區的親和力。由於
同一個聚合酶可以和幾種不同σ因子結合，故可利用選擇不同的σ因子起始不同的基因轉錄。
3、列舉原核生物同真核生物轉錄的差異？
（1） 原核生物轉錄只有一種RNA聚合酶，真核生物轉錄
根據轉錄產物不同而由多種RNA聚合酶。（2） 原核生物的
啟動子具有極高的同源性，而真核生物的啟動子差異較大
（3）原核生物的轉錄
產物是多順反子mRNA，而真核生物的轉錄產物是核不均一
RNA，需轉錄後修飾加工。
4、概括典型原核生物啟動子的結構和功能，並解釋什麼是
保守序列？
啟動子是RNA聚合酶結合和轉錄起始的特殊序列。典型的
原核生物啟動子大約40個核苷酸，並由兩個重要的序列：
－10區，pribnow box，TATA，和－35區TTGACA，是RNA
聚合酶的結合位點。保守序列指所有啟動子的該部位都有
這一序列或十分相似的結構。
5、真核生物啟動子的基本結構包括哪些部分？分別有何功能？
真核生物啟動子包含核心啟動子元件和上游啟動子元件
兩部分。核心啟動子元件即TATA box，其功能是使轉錄
精確的起始。上游啟動子元件包括CAAT box 和GC box，
其功能是控制轉錄起始的頻率。
6、增強子是如何增強轉錄的？
通過影響染色質DNA－蛋白質結構或改變超螺旋密度而
改變模板的整體結構，從而使得RNA聚合酶更容易與模板
DAN結合，起始基因轉錄。
7、添加PolyA尾巴的信號序列是什麼？簡述尾巴結構的
生理意義
基因3′末端轉錄終止位點上游15～30bp處的保守序列
AATAAA
生理意義：保持mRNA的穩定性，防止被降解；與翻譯
起始有關
8、簡述轉錄的常規特點
（1）在依賴DNA的RNA聚合酶作用下進行轉錄（2）
A＝U、C≡G 合成RNA分子
（3） 轉錄合成RNA鏈的方向為5』→3』，模板單鏈DNA的
極性（4）方向為3』→5』， 而非模板單鏈的極性方向與RNA
鏈相同，均為5』→3』。
書寫） （5）基因轉錄方式為不對稱轉錄(一條單鏈DNA 為
模板,RNA聚合酶的結合)
9、RNA酶促合成的基本特徵
(1) 雙鏈DNA分子以單鏈為模板；(2) 不需引物；(3) 底物
是5`-核苷三磷酸（NTP）；
(4) 前一個鹼基的 3`-OH和後一個鹼基的 5`-P反應，形成
磷酸二酯鍵，RNA鏈延伸；
(5) RNA鹼基順序由模板DNA順序決定； (6) RNA合成方向
是從5`→3`，新生RNA與模板DNA鏈呈反向平行；
9、簡述ρ因子依賴性終止子的作用機理
ρ因子結合：最初結合到RNA終止子上游一個伸展的
（約70個核苷酸）單鏈區。
ρ因子移動：結合到RNA上後，發揮ATP酶活性以提供
在RNA上滑動的能量，直到它到達RNA-DNA雜合鏈區域
(可能ρ因子沿RNA移動比聚合酶沿DNA移動的速度快)，
終止：ρ因子發揮解旋酶活性，使雙鏈體結構
10、比較真核生物與原核生物轉錄起始的第一步有什麼不同
細菌中，DNA指導的RNA聚合酶核心酶由四個亞基組成
(兩個α亞基，一個β亞基，一個β』亞基)，核心酶與σ亞基
結合產生全酶。核心酶可以催化NTP的聚合，但只有全酶能
夠引發轉錄的開始。主要的步驟是：具有特異識別能力的。亞
基識別轉錄起，始點
、上游的啟動子特異同源序列，這樣可以使全酶與啟動子序列
結合力增加，形成封閉的二元復合物。關鍵的作用是RNA
聚合酶與DNA的相互
作用。真核生物中，當含TBP的轉錄因子與DNA相互作用時
，其他因子也結合上來，形成起始復合體，這一復合體再與
RNA聚合酶結合，因此
主要是RNA聚合酶與蛋白質之間的作用。
11、 轉錄涉及模板鏈和編碼鏈的分離，解釋在轉錄中單鏈
DNA是怎樣被保護的
轉錄過程中控板與編碼鏈分離時，聚合酶覆蓋了整個轉錄泡—
—從解旋位點到螺旋重新形成位點，因此單鏈的DNA被
保護起來。與復制不同，
轉錄不需要單鏈結合蛋白的參與。
12、 概括說明σ因子對啟動子調節的輔助功能
σ因子(除了RpoN)有識別啟動子序列的結構域。作為游離的
蛋白質；σ因子並不具備與DNA結合的構象。當σ因子與
核心酶結合後構象發生改變，其N末端游離出與DNA結合
的結構域。σ因子的這一調節方式是為了防止游離的σ因子
與啟動子區結合，
而阻礙了依賴於全酶的轉錄啟動。另外，這樣也可防止形成
全酶的σ因子的濃度被稀釋，因為每一個細胞中，大約每三個
核心酶對應於一個σ因子。
13、為什麼只有DNA雙螺旋中的一條鏈能被正常的轉錄?
如果兩條鏈都被轉錄，每個基因就能編碼兩個不同的多肽
14、原核生物的核糖體RNA和DNA相對較穩定並且半衰期
而mRNA卻不穩定很快被降解請解釋這種穩定性的差異
如果轉錄物的壽命很長，就不可能通過控制mRNA的合成
速率來調節基因的活性。另一方面，如果tRNA和rRNA的
壽命長的話，就更合算。
15、啟動子有何作用特點
（1）一個基因可同時擁有一個及以上啟動子 （2）啟動子
位置不定，一般在轉錄起始點上游。 （3）可與增強子共同
控制轉錄起始和強度。 （4）發揮功能時除需RNA聚合酶外
，還需轉錄調控因子與啟動子區各種調控元件相互作用
16、增強子有何作用特點
① 可增強效應十分顯著； ② 增強效應與其位置和取向無關； ③ 大多為重復序列；
④ 一般具有組織或細胞特異性； ⑤ 無基因專一性； ⑥ 許
多增強子還受外部信號的調控
17、如何通過實驗確定啟動子與增強子邊界及關鍵序列元件
邊界序列確定:從一段特定的含有啟動子的DNA片段入手，
從DNA的兩側不斷縮短長度直至短到停止產生活性的某一
位置。
保守序列確定：A: 對已知啟動子序列，可通過缺失或突變確
定哪些鹼基為必需；
B: 還可通過比較不同的啟動子間的同源性，
確定哪些序列為保守序列。
18、回答大腸桿菌RNA聚合酶各亞基生物學功能
β和β』共同組成了酶的催化中心。它們的序列與真核生物
RNA聚合酶的最大亞基相關。
β亞基可能是酶和核苷酸底物結合的部位。
β』亞基是酶與DNA模板結合的主要成分。α亞基的功能
可能是識別其相應的啟動子。原核生物σ因子的功能：幫助
核心酶辨認啟動子；解開DNA的雙螺旋
I型內含子發生改變後，可以產生其他酶的活性嗎?如果可以
，是哪些活性?這意味著I型內含子的催化中心有什麼特點？
可以。這些活性包括：RNA聚合酶、內切核酸酶、磷酸酶、
連接酶的活性將I 型內含子轉變成這些酶的能力表明它能
結合於RNA的糖—磷酸骨架並能催化在它前後的幾個不同
反應。例如，連接是剪切的相反反應
1、列舉核糖體上主要的活性位點，並解釋起功能
(1)mRNA結合位點—30S頭部：防止mRNA鏈內鹼基結合，
促進mRNA與小亞基結合
(2)肽醯－tRNA位點—P位點：結合起始rRNA，增強A位
活性
(3)氨醯基 tRNA 位點—A位點：結合特定氨醯tRNA
(4)脫醯基tRNA和多肽的逐出位點—E位點：E1為脫醯基
tRNA 離開核糖體提供出口；E2對蛋白質合成的准確性起
重要作用；E3為多肽離開核糖體提供出口
其他位點：結合起始，延伸等因子
(5)5s rRNA位點（與tRNA進入有關）;(6)EF—Tu（延伸因子
）位點 ：位於大亞基內，與氨醯基 tRNA的結合有關;(7)
EF—G :轉位因子結合位點,位於大亞基靠近小亞基的界面處
2、簡述蛋白質生物合成的基本過程
1）起始：核糖體小亞基識別起始位點，在起始因子作用下
，與大亞基，氨醯tRNA結合，形成起始復合物 2）延伸：
核糖體在mRNA移動，在延伸因子作用下，通過轉移肽醯
tRNA到氨醯tRNA，即經過進位，肽鍵形成
和轉移，脫落，移位的循環至終止密碼子完成肽鏈延伸
3）終止：在釋放因子作用下，識別終止密碼子，肽鏈從
tRNA上釋放，核糖體離開mRNA
3、什麼是搖擺假說?
在蛋白質生物合成中轉移核糖核酸反密碼子的5′位鹼基
不嚴格的特異性的假說。允許反密碼子的5′位(第一位)
鹼基與信使核糖核酸的密碼子3′位(第三位)鹼基通過改變
了的氫鍵配對(如非G-C、A-U 配對)，從而識別一種以上的
密碼子
4、指出E.coli和真核生物翻譯起始的不同
[1]翻譯的起始識別
原核的起始tRNA是fMet-tRNA，存在SD序列和核糖體
結合序列作為翻譯起始位點，真核生物利用eIF4不同結合
位點結合帽子和尾巴結構，識別起點。
[2]翻譯起始：原核生物30s小亞基首先與mRNA模板相結合，再與fMet-tRNA結合，最後與50s大亞基結合。真核中起始tRNA是
Met-tRNA，40s小亞基首先與Met-tRNA(Met上角標）相結合，再與模板mRNA結合，
最後與60s大亞基結合生成起始復合物，且真核生物的起始因子較多。
5、 N-甲醯甲硫氨酸-tRNA的功能是什麼?
作為起始氨醯tRNA，能夠識別AUG和GUG作為起始密碼子，與IF-2結合成復合體進入小亞基的P位點
6、解釋核糖體肽基轉移反應
肽基轉移酶的活性區位於大亞基，臨近肽醯tRNA的氨基酸莖，核糖體P位點和A位點。50S上肽醯轉移酶催化P位的肽（氨）醯-tRNA把肽（
或氨醯基）轉給A位的AA-tRNA，並以肽鍵相連的過程
7、簡述真核細胞中翻譯終止的過程
由於氨醯tRNA上沒有反密碼子能夠與三個終止密碼子互補
配對，因此翻譯終止。終止需要tRNA的協助，此時沒有氨基酸能夠連接到位於P位點的肽醯tRNA上，釋放因子有助於終止的發生，能使tRNA上的氨基酸C端不需要
轉肽基和脫醯基而發生轉位。新生肽直接從P位點離開核糖體。
8、真核與原核核糖體的主要區別是什麼?
真核細胞80S核糖體中核糖體蛋白和rRNA數量和體積比原核細胞70S核糖體的大，真核大小亞基（40S和60S）均比原核細胞的大（30S，50S）。原核細胞的RNA含量比真核高，原核細胞核糖體有E位點便於脫醯tRNA的離開。原核中多以多聚核糖體形式存在，真核大多與細胞骨架和內質網膜結合
10、密碼子具有哪些特性
（1）連續性：肽鏈合成起始後，密碼子按3個一框讀下去不重疊也不跳格，直到終止
(2)簡並性：許多氨基酸對應的密碼子不止一種
(3)兼職性：AUG（Met)和GUG（Val)兩個密碼子除代表特定氨基酸外，還兼作起始密碼子
(4)普遍性：各物種體內體外都適用
(5)密碼子-反密碼子識別的搖擺性：在密碼子與反密碼子的配對中，前兩對嚴格遵守鹼基配對原則，而第三對鹼基有一定的自由度，可以「擺動」。
簡述信號肽作用機制
信號肽便被信號識別顆粒(SRP)識別，SRP與攜帶新生鏈的核糖體結合而停止翻譯
SRP再與內質網上的船塢蛋白(DP)結合翻譯阻滯逆轉，並使正在延伸的肽鏈轉移到內質網腔內，信號肽被切除。
新生肽進入ER腔之後經折疊，修飾（糖基化和羥基化等）後運送到其它的部位。
1、酵母雙雜交系統原理
不同轉錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉錄的功能 ，酵母雙雜交系統利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白-蛋白的相互作用
2、酵母單雜交原理
將已知的順式作用元件構建到最基本啟動子(Pmin)上游，把報告基因連接到Pmin下游。將待測轉錄因子的cDNA與酵母轉錄激活結構域(AD)融合表達載體導入細胞，該基因產物如果能夠與順式作用元件結合，而激活Pmin啟動子使報告基因表達。
3、簡述DNA重組的基本過程？
（1）目的基因的提取：供體生物基因或稱外源基因的提取
（2）限制性酶切：目的基因切成不同大小片段
（3）酶接：連接到另一DNA分子上-克隆載體
（4）轉化：重組DNA分子轉入受體細胞
（5）篩選和鑒定：對吸收了重組DNA的受體細胞進行篩選和鑒定
（6）基因表達：進行培養，檢測外源基因是否表達
4、凝膠電泳的工作原理與應用
原理：1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，呈負離子化狀態；核酸分子在一定的電場強度的電場中，它們會向正電極方向遷移；
2）電泳中使用無反應活性的穩定的支持介質，電泳遷移率（或遷移速度）與分子大小、介質粘度等成反比；
因此，可在同一凝膠中、一定電腸強度下分離出不同分子量大小或相同分子量但構型有差異的核酸分子。
應用：分離、鑒定和純化DNA或RNA片段，分子克隆技術核心技術
5、分子雜交的試驗流程以及分類
樣品及探針制備--樣品電泳分離---轉膜----預雜交-----雜交----洗膜----分析（壓片、顯色、熒光觀察等）
分類： Southern blot ， Northern blot，Western blot，ISH， FISH
6、簡述DNA足跡試驗的原理與應用 DNA結合蛋白結合在DNA片段上，能保護結合部位不被DNase破壞，DNA分子經酶切作用後遺留下該片段(亦稱「足跡」)，進而可以確定它的序列。在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上，相應於蛋白質結合的部位沒有放射性標記條帶 7、簡述凝膠阻滯試驗的原理 原理：蛋白質與DNA結合後分子質量將增加，在電泳中移動的速率減小，沒有結合蛋白的DNA片段遷移速率大。利用這一原理可分離純化細胞提取物中特定DNA結合蛋白 8、簡述PCR的工作流程，原理與應用 原理：利用DNA復制的半保留復制和DNA變性與復性的特性，用特異性引物對模板DNA進行指數擴增。 流程：首先待擴增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環，PCR就是這種循環的不斷重復。使DNA擴增量呈指數上升。 應用：基因組中特異片段克隆，不對稱PCR，反向PCR，基因的體外誘變，RT-PCR，免疫PCR，基因組的比較研究 9、基因克隆的主要載體有哪些？ 質粒載體，噬菌體載體， BAC，克隆載體，表達載體，YAC，粘粒等 10、作為表達載體應具備哪些特點？ （1）能自主復制；（2）具有一個以上的遺傳標記，便於重組體的篩選和鑒定；（3）有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點； （4）分子量小，以容納較大的外源DNA。 11、作為DNA重組應用較多的限制性內切酶II，其有哪些特點？ （1）識別位點嚴格專一；（2）識別序列的鹼基數一般為4，6，8個bp；（3）識別位點經常是一種迴文序列的DNA；（4）僅需 Mg2+ 作催化反應輔助因子，能識別雙鏈DNA特殊序列，並可特異切割DNA，產生特異片段；（5）種類繁多，應用廣泛 12、簡述基因組文庫的構建方法 ①用適當的限制性內切酶消化基因組DNA，以得到約20kb的片段；②用限制性內切酶切割載體DNA，使其形成與外源DNA相匹配的粘性未端；③用適當的方法除去l噬菌體裂解生長非必需的內部片段；④l噬菌體載體臂與外源DNA片段連接；⑤利用體外包裝系統進行噬菌體的組裝；⑥重組噬菌體侵染E. coli，每一克隆中含有外源DNA的一種片段，全部克隆構成一個基因文庫。 13、簡述cDNA文庫的構建方法 ①mRNA的提取和純化。②合成cDNA第一鏈。③將mRNA-cDNA雜交分子轉變為雙鏈cDNA分子。④將雙鏈cDNA重組到噬菌體載體或質粒載體上。⑤將重組子體外包裝成具有感染力的噬菌體顆粒導入到大腸桿菌寄主細胞中增殖 14、怎樣篩選目的基因？ （1）核酸雜交（2）PCR篩選（文庫，菌落）（3）免疫篩選【解釋】 15、基因組文庫與cDNA文庫有哪些差異？ （1）cDNA文庫 包含著細胞全部mRNA信息，基因組文庫 包含有生物全部的基因。 （2）cDNA文庫具有組織細胞特異性，基因組文庫無。 （3）cDNA文庫顯然比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細胞特異表達的基因。 （4）基因組文庫所含的是帶有內含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經過剪接、去除了內含子的cDNA 1、乳糖操縱子阻遏蛋白的負性調控機制 沒有乳糖時，1ac操縱子處於阻遏狀態。I 基因在自身的啟動子PI 控制下，產生阻遏蛋白R。R以四聚體形式與操縱子o結合，阻礙RNA聚合酶與啟動子P的結合。 當有乳糖存在時，乳糖與R結合，使R四聚體解聚成單體，失去與o的親和力，與o解離，基因轉錄開放。 2、乳糖操縱子CAP的正性調控機制 cAMP含量與葡萄糖的分解代謝有關，當細菌利用葡萄糖供給能量時，cAMP含量降低；無葡萄糖時，cAMP含量升高。 cAMP與CRP結合變為CAP，並以二聚體的方式與特定的DNA序列結合。 1ac操縱子的強誘導既需要有乳糖的存在，又需要沒有葡萄糖可供利用，通過CAP的正調控作用，細菌才能充分利用乳糖。 3、乳糖操縱子結構特點 大腸桿菌乳糖操縱子包括：結構基因：Z、Y和A,調控元件：啟動子(P)、操縱區(O)和cAMP-CRP結合位點;調節基因：lacI 4、解釋細菌對葡萄糖和乳糖的利用機制 1）．當葡萄糖存在，乳糖存在時：盡管乳糖作為誘導劑和阻遏蛋白結合，使阻遏蛋白與操縱序列O解離。但由於cAMP濃度較低，cAMP和CRP結合受阻，基因處於關閉狀態。2）．當葡萄糖和乳糖都不存在時：CRP可以發揮正調控作用，但由於沒有誘導劑，阻遏蛋白的負調控作用使基因仍處於關閉狀態。3）．當葡萄糖存在，乳糖不存在時：此時無誘導劑存在，阻遏蛋白與DNA結合。而且由於葡萄糖的存在，CRP也不能發揮正調控作用，基因處於關閉狀態。 4）．當葡萄糖不存在，乳糖存在時：此時CRP可以發揮正調控作用，阻遏蛋白由於誘導劑的存在而失去負調控作用，基因被打開，啟動轉錄。 5、色氨酸操縱子的阻遏蛋白的負調節機制 細菌通常需要自己經過許多步驟合成色氨酸，但是一旦環境能夠提供色氨酸時，細菌就會充分利用外界的色氨酸。合成色氨酸所需酶類的基因E、D、C、B、A，受其上游調控蛋白R基因的調控。R並沒有與O結合的活性，只有當環境能提供足夠濃度的色氨酸時，R與色氨酸結合後而活化，能夠與O結合，阻遏結構基因的轉錄，使基因開 ---關。

3. Tm值的影響Tm值的因素

Tm值的影響因素如下：

（1）G—C的含量：在一定條件下Tm高低由DNA分子中的G-C含量所決定。G-C含量高時，Tm值比較高，反之則低。這是因為G-C之間的氫鍵較A-T多，解鏈時需要較多的能量之故。

Tm值和G-C的含量可用二一個經驗公式表示：

（G—C）%=（Tm-69.3）×2.44

在一定條件下（pH7.0，0.165MNaCl中）Tm值與（GC）%含量呈正比關系。因此，通過測定Tm值，可以推算出DNA分子中的鹼基百分組成。

（2）DNA所處的溶液條件：DNA溶液中離子強度低時，Tm較低，而且熔解溫度范圍較寬；離子強度較高時，Tm較高，熔解溫度范圍較窄。因此，在表示某一來源DNA的Tm值時，必須指出其測定條件。

4. 核酸中影響Tm值的因素有哪些

DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結構降解一半時的溫度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比關系。
核酸Tm值（解鏈溫度）計算
A variety of factors affect the efficiency of hybridization between two strands of DNA. These include the nature of the hybridizing molecules (DNA or RNA), their lengths, the hybridization environment (salt concentrations and denaturants), probe concentrations, and their sequences.
For membrane bound targets and moderately long DNA probes, Howley et al1 determined that the melting temperature (Tm) at which 50% of a probe is annealed to its complementary strand is defined by:
Tm = 81.5 + 16.6logM + 41(%G + %C) - 500/L - 0.62F
where
M = molar concentration of monovalent cations
%XG or C = the respective fraction of G and C nucleotides in the probe
L = length of the annealed proct
F = molar concentration of formamide
For example, a short oligonucleotide probe with the sequence AGGTCATTG in a 75 mM solution without formamide has a predicted Tm = 81.5 + 16.6log(0.075) + 41(0.33+0.11) - 500/9 - 0.62(0)
= 24.1°C
This equation is inappropriate for probes less than about 50 nucleotides. Modifications of this equation include,
Tm of RNA = 79.8+18.5logM+58.4(%G+%C)+11.8(%G+%C)2-820/L-0.35F
Tm of an RNA-DNA hybrid = 79.8+18.5logM+58.4(%G+%C)+11.8(%G+%C)2-820/L-0.50F
The larger numbers reflect the increased stability of hybrids formed with RNA.
For oligonucleotides, Wallace, et al2 determined that
Td=2(A+T)+4(C+G), where Td = temperature (in °C) at which 50% of the oligonucleotides are annealed to their membrane-bound complementary sequences. The number of each particular nucleotide in the probe is inserted into the equation in place of the letters. The equation is useful for short (14-20 mers) in 0.9 M NaCl.
ex: for sequence AGGTCATTG, the Td = 2(2+3)+4(1+3) = 26°C
When the target and probe are free in solution, add 7-8°C to Td.
Melting temperature in solution is determined by plotting O.D versus temperature. The mid point on the S-shaped curve is the melting temperature.
Other estimates of melting points have been determined for DNA3 or RNA4 based on nearest neighbor analysis (reviewed by Genosys5). Breslauer, et al3 showed that melting behavior of a DNA plex is predictable from its primary sequence.
Here,
Tm = 1000(DH)/[A+DS)+Rln(Ct/4)]-273.15+16.6log(Na+)].
where
DH = the sum of nearest neighbor enthalpy changes moving one base at a time through the sequence
A = correction for initiation of pairing (= -10.8)
DS = the sum of nearest neighbor entropy changes
R = 1.987 cal deg-1 mol-1)
Ct is the molar concentration of strands.
For self-complementary strands, the term "Ct/4" is replaced by Ct.
The values for DH and DS are shown in the table.
Nearest Neighbor DH DNA (kcal/mol) DH RNA (kcal/mol) DS DNA (cal/mol); DNA DS RNA (cal/mol)
AA or TT - 9.1 - 6.6 -24.0 -18.4
AT - 8.6 - 5.7 -23.9 -15.5
TA - 6.0 - 8.1 -16.9 -22.6
CA or TG - 5.8 -10.5 -12.9 -27.8
GT or AC - 6.5 -10.2 -17.3 -26.2
CT or AG - 7.8 - 7.6 -20.8 -19.2
GA or TC - 5.6 -13.3 -13.5 -35.5
CG -11.9 - 8.0 -27.8 -19.4
GC -11.1 -14.2 -26.7 -34.9
GG -11.0 -12.2 -26.6 -29.7
As an example, a 1 µM solution of the probe mentioned above (AGGTCATTG) in a 150 mM solution has a predicted Tm of:
Tm = 1000(-7.8-11.0-6.5-5.6-5.8-8.6-9.1-5.8) / [-10.8+(-20.8-26.6-17.3—13.5-12.9-23.9-24.0-12.9) + 1.987ln[(1E-06)/4]] - 273.15 + 16.6log(0.15)
= [-60900 / (-10.8-151.9-30.2)] - 273.15 - 13.7
= (-60900/-192.9) - 286.9
= 29°C
The applicability of these equations to laboratory situations varies as additional components in the hybridization environment are altered. It is best to consider these predictions guidelines, since they may vary for particular sequences from empirically derived determinations.
Background Problems
Moderate background on filter hybridizations is common. They often can be reced by washing in up to 7% SDS.

5. 分子生物學高人請幫忙。請教有關PCR的Tm值問題

首先告訴你，Tm值沒什麼用的，你要注意的是退火溫度，比如這是我做16S rDNA的程序，
1）95度 10min（這個一般用94-95度，使DNA完全分開，這步一般固定）
2）95度 30秒（94度、95度都可以，這步幾乎也是固定的）
3）退火溫度 30-60秒（退火溫度你設計引物時會有告訴你的，要是是大片段，將程序建議的退火溫度減去5度，小片度就可以按照它給的溫度，注意，退火溫度是PCR的關鍵，所以一般需要摸索條件的）
4）72度 延伸時間（這步固定，延伸時間與你P的片段大小和你的Taq酶有關，一般是1-2kb/min，也就是說你做1kb大小的片段就用30-60秒，依次類推）
步驟2-4循環30次
5）72度 5-10min
6）15度 10min（此步可有可無）
希望可以幫到你！！
Tm值在你設計引物的時候才會有用，引物的Tm值一般控制在55-60度, 盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度. 如果引物中的G+C含量相對偏低,則可以使引物長度稍長,而保證一定的退火溫度.不知道你懂了沒？ 當然，我引物Tm值差5度的也有，照樣P的很好，呵呵。

6. 在下列幾種不同鹼基組成比例的DNA分子中，哪些DNA分子Tm值最高 A:A+T=15% B:G

Tm值就是DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結構降解一半時的溫度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比關系。A的GC為百分之八十五，E為百分之二十，所以C選項的GC值最高，因此選C

7. 生物化學的「Tm」表示的是什麼

熔解溫度（melting temperature,Tm）是指吸光值增加到最大值的一半時的溫度稱為DNA的解鏈溫度或熔點。

DNA的變性從開始解鏈到完全解鏈，是在一個相當小的溫度內完成，在這一范圍內，紫外光吸收值達到最大值的50%時的解鏈溫度，由於這一現象和結晶的融解過程類似，又稱融解溫度。

熔解和凝固：

物質從固態變成液態叫做熔解，從液態變成固態叫做凝固。

晶體有一定的熔解溫度——熔點。晶體在熔解過程中，當溫度升高到熔點時，晶體才開始熔解，在熔解過程中溫度保持不變，到全部熔解後，溫度才繼續上升，其逆過程是液體溫度降低到熔點時才開始凝固，凝固過程中，溫度也保持不變，到全部凝固後，溫度才繼續下降。

非晶體沒有一定的熔點，溫度升高時，非晶體先是由硬變軟，再逐漸變成黏稠狀液體，最後逐漸變成液體，整個過程中溫度不斷升高，冷卻時情況正好相反。

實驗表明，大多數物質在熔解時體積膨脹，凝固時體積縮小，其熔點即凝固點隨壓強的增大而升高；少數物質如水、灰鑄鐵、銻、鉍等熔解時體積縮小，凝同時體積膨脹，其熔點即凝固點隨壓強的增加而降低，不過壓強對熔點的影響並不顯著，如每增加1 atm，冰的熔點才降低0.0075℃。