1. 你認為所有的微生物細胞都可以利用血球計數板進行計數嗎為什麼
不能，稍微小點的細菌用血球板計數就不準。
血球計數板在顯微鏡下直接進行測定。它觀察在一定的容積中的微生物的個體數目，然後推算出含菌數，簡便快捷。但是在計數時包括死活細胞均被計算在內，還有微小雜物也被計算在內。這樣得出結果往往偏高，因此適用於對形態個體較大的菌體或孢子進行計數。
2. 細菌計數的含義是什麼
細菌計數 counting of bacteria
指測計酵母、細菌等的細胞數.有總菌計數和活菌計數兩種計數法.後者是測計試樣中的活細菌數.二者都是先把試樣稀釋成適於測計的濃度,再用種種方法進行細胞數的測計.一般認為用細胞計數器測計更為精確.有的方法是把細胞用血球容量計進行離心沉澱,從其刻度的容積進行換算；還有一種方法是比濁法.在測計固氮細菌時,可用凱氏定氮法測定有機氮（或是蛋白態氮）,然後換算成細菌數.進行活菌計數時,先把樣品稀釋,然後將一定量稀釋樣品混入依菌性質製成的溶融狀態的瓊脂培養基中進行平面培養,再根據菌落數進行統計.對已鑒別過的菌種或具有某種特定性質的細菌來說,活菌計數比較簡單,但對土壤微生物區系量的分析就比較復雜了.
3. 血細胞計數板計數原理
一、目的要求
1．了解血細胞計數板的構造和使用方法。
2．學會用血細胞計數板對酵母細胞進行計數。
二、基本原理
利用血細胞計數板在顯微鏡下直接計數，是一種常用的微生物計數方法。此法的優點是直觀、快速。將經過適當稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血細胞計數板載玻片與蓋玻片之間的計數室中，在顯微鏡下進行計數。由於計數室的容積是一定的（0.1或0.4mm2），所以可以根據在顯微鏡下觀察到的微生物數目來換算成單位體積內的微生物總數目。由於此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計數法。適用於稀釋的菌懸液（或孢子懸液），即液體培養基中菌體的計數。
優點：直觀、快速。
血細胞計數板，通常是一塊特製的載玻片，其上由四條槽構成三個平台。中間的平台又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平台上各刻有一個方格網，每個方格網共分九個大方格，中間的大方格即為計數室，微生物的計數就在計數室中進行。
計數室的刻度一般有兩種規格，一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但無論是哪種規格的計數板，每一個大方格中的小方格數都是相同的，即16×25=400小方格。
計數時，常採用樣方法。
每一個大方格邊長為1或2mm，則每一大方格的面積為1或4mm2，蓋上蓋玻片後，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1mm，所以計數室的容積為0.1或0.4mm3。
在計數時，通常數四或五個中方格的總菌數，然後求得每個中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一個大方格中的總菌數，然後再換算成1ml菌液中的總菌數。
下面以一個大方格0.1mm3有25個中方格的計數板為例進行計算：設五個中方格中總菌數為A，菌液稀釋倍數為B，那麼，一個大方格中的總菌數因1ml=1cm3=1000mm3，
同理，如果是16個中方格的計數板，設五個中方格的總菌數為A＇，則
三、器材
釀酒酵母菌懸液，血細胞計數板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細管。
四、操作步驟
1．稀釋
將釀酒酵母菌懸液進行適當稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。
2．鏡檢計數室
在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有污物，則需清洗後才能進行計數。
3．加樣品
將清潔乾燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的細口滴管將稀釋的釀酒酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多），讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自行進入計數室，一般計數室均能充滿菌液。
顯微鏡計數
靜止5分鍾後，將血細胞計數板置於顯微鏡載物台上，先用低倍鏡找到計數室所在位置，然後換成高倍鏡進行計數。在計數前若發現菌液太濃或太稀，需重新調節稀釋度後再計數。一般樣品稀釋度要求每小格內約有5—10個菌體為宜。每個計數室選4或5個中格中的菌體進行計數。
鏡檢計數方法：①方格內細胞的計數順序為左上→右上→右下→左下。②壓在方格線上的細胞只計左線和上線上的細胞數。③酵母細胞若有粘連， 要數出團塊中的每一個細胞。④出芽酵母的芽體體積若超過細胞體積的1/2，則算獨立個體。⑤計數總數不少於300個細胞。
5．清洗血細胞計數板
使用完畢後，將血細胞計數板在水籠頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完後自行晾乾或用吹風機吹乾。鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉澱物。若不幹凈，則必須重復洗滌至干凈為止。
4. 為什麼可以用菌落進行細菌計數和純培養
在大多數情況下，菌落是由單個微生物細胞固體培養基表面或內部生長繁殖，形成以母細胞為中心的一團肉眼可見的、有一定形態、構造等特徵的子細胞集團。就是說，一個菌落，就是由一個細菌或其他微生物細胞生長繁殖形成的。
在一定范圍的固體培養基上用一定量的菌懸液進行塗布培養，形成多少個菌落，就說明原來用的一定量或體積的菌懸液中，就含有多少個微生物細胞個體。這就是用菌落生長的個數來進行細菌計數的原理。
至於純培養，也是一樣的。純培養是指只在單一種類存在的狀態下所進行的生物培養。一個菌落是由一個細菌細胞生長形成的，細菌生長繁殖具有遺傳穩定性，這個菌落中所有的子細胞都是由一個細菌細胞形成的，當然它們就具有相同的遺傳基因，具有同樣的生理生化特徵，屬於同種細菌。這就是純培養。
5. 測定培養液中微生物的菌體數，為什麼在顯微鏡下要用血細胞計數板直接計數
光電比濁計數法
一、目的要求
1．了解光電比濁計數法的原理。
2．學習、掌握光電比濁計數法的操作方法。
二、基本原理
當光線通過微生物菌懸液時，由於菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定的范圍內，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出(圖15-4)。因此，可用一系列已知菌數的菌懸液測定光密度，作出光密度—菌數標准曲線。然後，以樣品液所測得的光密度，從標准曲線中查出對應的菌數。製作標准曲線時，菌體計數可採用血細胞計數板計數，平板菌落計數或細胞乾重測定等方法。本實驗採用血細胞計數板計數。
光電比濁計數法的優點是簡便、迅速，可以連續測定，適合於自動控制。但是，由於光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形態、培養液成分以及所採用的光波長等因素的影響。因此，對於不同微生物的菌懸液進行光電比濁計數應採用相同的菌株和培養條件製作標准曲線。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物採用多少還需要經過最大吸收波長以及穩定性試驗來確定。另外，對於顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他干擾物質的懸液不適合用此法進行測定。
（三）器材
1．菌種 釀酒酵母培養液
2．儀器或其他用具 721型分光光度計，血細胞計數板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。
（四）操作步驟
1．標准曲線製作
（1）編號 取無菌試管7支，分別用記號筆將試管編號為1、2、3、4、5、6、7。
（2）調整菌液濃度 用血細胞計數板計數培養24小時的釀酒酵母菌懸液，並用無菌生理鹽水分別稀釋調整為每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌數的細胞懸液。再分別裝入已編好號的1至7號無菌試管中。
（3）測OD值 將1至7號不同濃度的菌懸液搖均勻後於560nm波長、1cm比色皿中測定OD值。比色測定時，用無菌生理鹽水作空白對照，並將OD值填入下表
每管菌懸液在測定OD值時均必須先搖勻後再倒入比色皿中測定
(4)以光密度(OD)值為縱坐標，以每毫升細胞數為橫坐標，繪制標准曲線。
2．樣品測定
將待測樣品用無菌生理鹽水適當稀釋，搖均勻後，用560nm波長、lcm比色皿測定光密度。測定時用無菌生理鹽水作空白對照。
各種操作條件必須與製作標准曲線時的相同，否則，測得值所換算的含菌數就不準確。
3．根據所測得的光密度值，從標准曲線查得每毫升的含菌數。
（五）實驗報告
l．結果
每毫升樣品原液菌數=從標准曲線查得每毫升的菌數×稀釋倍數
6. 微生物的計數
有專業地電子計數儀器
也有實驗法
微生物的顯微直接計數法
一、實驗目的
了解血球計數板的構造、計數原理和計數方法，掌握顯微鏡下直接計數的技能。
二、實驗原理
測定微生物細胞數量的方法很多，通常採用的有顯微直接計數法和平板計數法。
顯微計數法適用於各種含單細胞菌體的純培養懸浮液，如有雜菌或雜質，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或黴菌孢子可採用血球計數板，一般細菌則採用彼得羅夫·霍澤（Petrof Hausser）細菌計數板。兩種計數板的原理和部件相同，只是細菌計數板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數板較厚，不能使用油鏡，計數板下部的細菌不易看清。
血球計數板是一塊特製的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構成3個平台。中間的平台較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數區（圖21-1），計數區的刻度有兩種：一種是計數區分為16個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數區分成25個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數區是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即計數區都由400個小方格組成。
計數區邊長為1mm，則計數區的面積為l mm2，每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片後，計數區的高度為0.1mm，所以每個計數區的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為1/4000mm3。
使用血球計數板計數時，先要測定每個小方格中微生物的數量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數量。
已知：1mm3體積=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3
所以：1mm3體積應含有小方格數為1000mm3/1/4000mm3=4×106個小方格，即系數K=4×106 。
因此：每ml菌懸液中含有細胞數= 每個小格中細胞平均數（N）×系數（K）×菌液稀釋倍數（d）
三、實驗器材
1．活材料：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培養液。
2．器材：顯微鏡、血球計數板、蓋玻片（22mm×22mm）、吸水紙、計數器、滴管、擦鏡紙。
四、實驗方法
1．視待測菌懸液濃度，加無菌水適當稀釋（斜面一般稀釋到10-2），以每小格的菌數可數為度。
2．取潔凈的血球計數板一塊，在計數區上蓋上一塊蓋玻片。
3．將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數板中間平台兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數區，勿使氣泡產生，並用吸水紙吸去溝槽中流出的多餘菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數區上，不要使計數區兩邊平台沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片後，造成計數區深度的升高。然後加蓋蓋玻片（勿使產生氣泡）。4．靜置片刻，將血球計數板置載物台上夾穩，先在低倍鏡下找到計數區後，再轉換高倍鏡觀察並計數。由於生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應減弱光照的強度。
5．計數時若計數區是由16個大方格組成，按對角線方位，數左上、左下、右上、右下的4個大方格（即100小格）的菌數。如果是25個大方格組成的計數區，除數上述四個大方格外，還需數中央l個大方格的菌數（即80個小格）。如菌體位於大方格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。
6．對於出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復計數2—3次（每次數值不應相差過大，否則應重新操作），求出每一個小格中細胞平均數（N），按公式計算出每ml（g）菌懸液所含酵母菌細胞數量。
7．測數完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網格刻度。洗凈後自行晾乾或用吹風機吹乾，放入盒內保存。
可以再參考單細胞微生物顯微計數法
7. 什麼是微生物計數
1] 病毒以外的微生物的計數。樣品中可測到總的(死的和活的)細胞數，稱為總細胞數,樣品中可測到的活的細胞數稱活細胞數。
8. 微生物計數方法有哪些
測定微生物計數的方法有很多,主要有以下幾種：
1.血細胞計數法
將稀釋的菌液樣品滴在血細胞計數板上,在顯微鏡下計算4~5個中格的細菌數,並求出每個小格所含細菌的平均數,再以此為依據,估算總菌數.
①此法的缺點是不能區分死菌和活菌.
②對壓在小方格界線上的細菌,應當取平均值計數.
③此法可用於測定培養液中酵母菌種群數量的變化
2.稀釋塗布平板法
原理：每個活細菌在適宜的培養基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落.培養基表面生長的一個菌落,來源於樣品稀釋液中的一個活菌.
①這一方法常用來統計樣品中活菌的數目
②統計的菌落數往往比活菌的實際數目低,原因是當兩個活多個細胞連在一起時,平板上觀察到的只是一個菌落.因此統計結果一般用菌落數而不是用活菌數來表示.
③土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細菌、酵母、芽孢與孢子等的數量均可用此法測定.但不適於測定樣品中絲狀體微生物,例如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍細菌等的營養體等.
④此法若不培養成菌落,可通過將一定量的菌液均勻地塗布在玻片上的一定面積上,經固定染色後在顯微鏡下計數,這樣又稱塗片計數法.染色可用台盼藍,台盼藍能使死細胞染成藍色,可分別計數死細胞和活細胞.
3.濾膜法
濾膜法是當樣品中菌數很低時,可將一定體積的湖水、海水或飲用水燈樣品通過膜過濾器.然後將濾膜乾燥、染色,並經處理使膜透明,再在顯微鏡下計算膜上（或一定面積上）的細菌數.
此法也可以通過培養觀察形成的菌落數來推算樣品中的菌數.例如測定飲用水中大腸桿菌的數目：將已知體積的水過濾後,將濾膜放在伊紅美藍培養基上培養.在該培養基上大腸桿菌的菌落呈現黑色,可根據培養基上黑色菌落的數目,計算出水樣中大腸桿菌的數目.
此法也是統計樣品中活菌的數目.
4.比濁法
原理是在一定范圍內,菌是懸液中細胞濃度與混濁度成正比,即與光密度成正比,菌越多,光密度越大.因此可藉助與分光光度計,在一定波長下,測定菌懸液的光密度,以光密度表示菌量.實驗測量時一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內,否則不準確.
5.顯微鏡直接計數法
在課本生物選修1生物技術實踐P22中「除了上述活菌計數法外,顯微鏡直接計數也是測定微生物數量的常用方法.」這里說的顯微鏡直接計數,我認為應該是在稀釋塗布的基礎上不培養成菌落而通過染色的方法在顯微鏡下直接計數.再如濾膜法也一樣,可以有兩種情況.
另外,微生物計數法發展迅速,多種多樣的快速、簡易、自動化的儀器和裝置等方法可以用來統計微生物的數目.
9. 食品微生物檢測中出現一些半透明的菌落也要計數嗎為什麼會出現這樣的情況，正常嗎
微生物導致食品腐敗變質、微生物毒素(致病菌、寄生蟲)及傳染病流行(肝炎病毒)引起的食源性疾病是我國食品安全的頭號問題。在我國的食品衛生管理中，微生物指標分為菌落總數(細菌總數)、大腸菌群、黴菌、酵母菌與致病菌。它們造成食源性疾病，可表現為輕度不適應慢性疾病甚至有生命危險。致病菌是食品安全的殺手，在我國的食品衛生標准中規定為「不得檢出」。 菌落總數的測定是食品衛生檢驗的一個重要指標。菌落總數測定是用來判定食品被細菌污染的程度及衛生質量，它反映食品在生產過程中是否符合衛生要求，以便對被檢樣品做出適當的衛生學評價。菌落總數的多少在一定程度上標志著食品衛生質量的優劣。 菌落主要作為判定食品被污染程度的標志，也可以應用這一方法觀察細菌對食品被污染程序的標志，也可以應用這一方法觀察細菌在食品繁殖的動態，以便對被檢樣品進行衛生學評價時提供依據。 菌落總數嚴重超標，說明其產品的衛生狀況達不到基本的衛生要求，將會破壞食品的營養成分，加速食品的腐敗變質，使食品失去食用價值。消費者食用微生物超標嚴重的食品，很容易患痢疾等腸道疾病，可能引起嘔吐、腹瀉等症狀，危害人體健康安全。
10. 平板菌落計數的原理是什麼它適用於哪些微生物的計數
原理：
將待測樣品經適當稀釋之後，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液塗布到平板上，經過培養，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞；統計菌落數，根據其稀釋倍數和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數。
適用於：
通常用來測定樣品中所含細菌、孢子、酵母菌等單細胞微生物的數量。