生物素標記探針如何顯色

㈠ 免疫組化一抗+生物素化的二抗+DAB顯色，這屬於什麼方法

SP，但其實和ABC基本原理是一樣的，生物素化的二抗孵育之後還需要一步是用HRP（或者其他酶類）標記的鏈霉卵白素復合物孵育使其與生物素結合，然後和DAB反應的是HRP。簡單來說就是：一抗--生物素化二抗結合一抗種屬IgG--帶HRP鏈霉卵白素結合生物素--DAB與HRP反應顯色。

㈡ 熒光二抗標記用HRP、AP、FITC、生物素法各發什麼顏色熒光

這四個不是一碼事，HRP和AP是酶，二抗上掛了酶，要給相應的底物才能顯色，顯色方式可以通過發熒光也可以不發熒光（例如給予ECL底物，其中的H2O2和魯米諾在HRP的作用下，能在黑暗中發出熒光；也可以給予雙氧水和DAB，反應產生棕色不溶於水的物質）；FITC為異硫氰酸熒光素，本身就是黃綠色熒光，二抗結合後可直接在熒光顯微鏡下觀察；生物素一般也是掛在二抗上的，利用卵白素分別連接生物素標記的第二抗體和生物標記的酶，由酶催化底物，生成終產物，這個終產物也是不溶於水的。

㈢ DNA或RNA分子探針要用什麼標記

DNA探針的標記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移法、隨機引物法、PCR標記法等，能用於同位素和非同位素標記。

DNA探針技術又稱分子雜交技術，是利用DNA分子的變性、復性以及鹼基互補配對的高度精確性，對某一特異性DNA序列進行探查的新技術。DNA探針是利用同位素、生物素等標記的特定DNA片斷，該片斷可大至寄生蟲基因組DNA，小至20個鹼基。當DNA探針與待測的非標記單鏈DNA（或RNA）按鹼基順序互補結合時，以氫健將2條單鏈連接而形成標記DNA-DNA（或標記DNA-RNA）的雙鏈雜交分子。將未配對結合的核苷酸溶解後用檢測系統（放射自顯影或酶檢測等）檢測雜交反應結果。由於DNA分子鹼基互補的精確性，單連DNA探針僅與樣品中變性處理的DNA單鏈出現配對雜交，由此決定了探針的特異性；用放射性同位素（如32P）或生物素標記探針，使雜交試驗同時具有高度的敏感性

㈣ 地高辛標記cRNA探針顯色的基本步驟是什麼

顯色：
（1）用緩沖液1沖洗雜交後的載片2×3min。
（2）在緩沖液1中10min，室溫以封閉非特異性結合部位。
（3）拭乾切片周圍的載片，注意保持切片濕潤。加數滴抗地高辛抗血清（工作濃度1：500，以緩沖液1稀釋），孵育2h，室溫。
（4）緩沖液1漂洗3×3min。
（5）浸入緩沖液210min室溫。
（6）浸入底物中孵育10～30min（或更長時間，視需要而定），底物內含顯色BCIP/NBT，室溫。最好用錫箔紙包裹反應盒，使顯色在黑暗中進行。定期取出切片在顯微鏡下檢測反應強度。根據反應強度決定延長或終止反應。反應顏色為紫藍色。
（7）將切片浸入緩沖液3以終止反應。
（8）復染，可用1%伊紅、1%蘇木精、1%亮綠或5%的焦寧（又稱派咯寧丫）（pyronin 丫）10～30s。
（9）流水洗5～10min，直至水無色為止。
（10）在切片未乾前，以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可以用DPX在蓋片四周封固。為去除水份，在封固前可進行梯度酒精脫水，透明，DPX封固，但每步時間僅需幾秒鍾，時間過長易致褪色。

㈤ 核酸探針的標記

常將放射性同位素如32 P連接到某種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）上做為標記物，然後通過切口平移法標記探針。
切口平移法（nick translation）是利用大腸桿菌DNA聚合酶I (E.coli DNA polymerase I) 的多種酶促活性將標記的dNTP摻入到新形成的DNA鏈中去，形成均勻標記的高比活DNA探針。其操作方法如下：
⑴取1?g DNA溶於少量無菌雙蒸水中，加入5?l距離大約10×切口平移緩沖液 (0.5mol/L Tris－HCl，PH7.2；0.1 mol/L MgSO4 ；1mmol/L二硫蘇糖醇；500?g/mL牛血清白蛋白），加入除標記物（如?-32 p-dATP）外的其它三種dNTP（如dCTP，dGTP，dTTP）溶液，20mmol/L溶液各1?l。
⑵加入100?ci（10?l）標記物溶液，加入無菌雙蒸水至終體積為46.5?l，混勻，加入0.5?l稀釋的DNaseI溶液，混勻；加入1?l（約5單位）E.coli DNA polymerase I，混勻。
⑶置14-16℃反應1-2小時。 可將生物素、地高辛連接在dNTP上，然後象放射性標記一樣用酶促聚合法摻入到核酸鏈中制備標記探針。也可讓生物素、地高辛等直接與核酸進行化學反應而連接上核酸鏈。其中，生物素的光化學標記法較為常用。其原理是利用能被可見光激活的生物素衍生物-光敏生物素（photobiotin），光敏生物素與核酸探針混合後，在強的可見光照射下，可與核酸共價相連，形成生物素標記的核酸探針。可適用於單、雙鏈DNA及RNA的標記，探針可在-20℃下保存8-10個月以上。具體操作方法如下：
⑴將雙鏈DNA變性或用NaOH處理形成缺口，單鏈DNA或RNA毋需處理，將核酸樣品溶於水。
⑵暗室下在微量離心管中加入10?g DNA，1mg/ml光敏生物素20?l，加水至50?l，混勻。
⑶冰浴中打開離心管蓋，在300-500瓦燈下照射10分鍾（液面距燈泡10cm）。
⑷加入100?l 0.1mol/L Tris－HCl，pH8.0，加入100?l 2-丁醇抽提兩次，離心，棄上層。
⑸乙醇沉澱核酸探針；用70%乙醇漂洗真空抽干，備用。
除上述標記法外，探針的制備和標記還可通過PCR反應直接完成。

㈥ 基因探針的探針標記

探針是能與特異靶分子反應並帶有供反應後檢測的合適標記物的分子。利用核苷酸鹼基順序互補的原理，用特異的基因探針即識別特異鹼基序列的有標記的一段單鏈DNA（或RNA）分子，與被測定的靶序列互補，以檢測被測靶序列的技術叫核酸探針技術。探針制備就是將目的基因進行標記。特異性探針有三種形式——cDNA、RNA、寡核苷酸。cDNA和寡核苷酸是目前最常採用的探針。RNA探針用途很廣，也容易獲得，但其不穩定性限制了其商業用途。cDNA探針的獲得是，將特定的基因片段裝載到質粒或噬菌體中，經過擴增、酶切、純化等復雜的步驟，才能得到一定長度的cDNA探針。這一過程比較復雜，有相應條件的實驗室才能做到。寡核苷酸探針是在已知基因序列的情況下，由核酸合成儀來完成，可廉價獲得大量的此類探針。質量也相對來說更為穩定。由於cDNA探針長度通常為數百至數千個鹼基，所以有良好的信號放大作用，但其滲透性比較差。寡核苷酸探針一般為十數個至數十個鹼基，滲透性強，但信號放大作用則較差，合成的多相寡核苷酸探針，敏感性可以達到cDNA探針水平。
探針的標記方式有放射性標記和非放射性標記。標記物質有放射性元素（如32P等）和非放射性物質（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸標記同位素，被標記的dNTP本身就帶有磷酸基團，便於標記。特點是比活性高，可達9000Ci/mmol；發射的β射線能量高。用它標記的探針自顯影時間短，靈敏度高。32P的半壽期短，雖使用不方便，但為廢棄物的處理減輕了壓力。非放射性標記法有酶標法和化學物標記法。酶標方法與免疫測定ELISA方法相似，只是被標記的核酸代替了被標記的抗體，事實上被標記的抗體也稱為探針，現有許多商品是生物素、地高辛標記的。血凝素與生物素有非常高的親和性，當血凝素標記上過氧化物酶或鹼性磷酸酶，經雜交反應最終形成探針-生物素-血凝素酶復合物（ABC法），酶催化底物顯色，觀察結果。ABC法底物顯色生成不溶物，以便觀測結果。酶標記法復雜、重復性差，成本高，但便於運輸、保存，靈敏度與放射物標記法相當。 ①缺口平移標記法。利用的是DNA聚合酶I能修復DNA鏈的功能。該法先由DNaseI在DNA雙鏈上隨機切出切口，然後DNA聚合酶I沿缺口水解5´端核苷酸，同時在3´端修復加入被標記核苷酸，切口平行推移。缺口平移法快速、簡便、成本相對較低、比活性相對較高、標記均勻，多用於大分子DNA標記，(>1000bp最好)，但單鏈DNA、RNA不能用該法標記。
②隨機引物法。隨機引物是指含有各種可能排列順序的寡聚核苷酸片斷的混合物，因此它可以與任意核苷酸序列雜交，起到聚合酶反應的引物作用。將待標記的DNA探針片斷變性後與隨機引物一起雜交，然後以此雜交的寡聚核苷酸為引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I大斷段（KlenowFragment）催化下，合成與探針DNA互補的DNA鏈，當在反應體系中含有a-32P-dNTP時，即形成放射性同位素標記的DNA探針。具有上述優點，可代替缺口平移法。此外大小、單雙DNA均可標記，標記均勻，標記率高，但也不能標記環狀DNA。隨機引物法標記探針一般長400~600bp。
③末端標記法（又叫尾標）。利用末端轉移酶可進行「尾標」，尾標適用於寡核苷酸探針標記，寡核苷酸探針多用於核酸「點」突變的檢測，該探針可用核酸合成儀人工合成，克隆出的探針一般較長，特異性好，標記量大，雜交的檢出信號強。 1、4—6微米切片，用防脫片膠（多聚賴氨酸）處理過的玻片貼附
2、56—60℃烤片2—16h
3、新鮮二甲苯脫蠟，10minX2（趁熱脫蠟）
4、100%乙醇5minX2次，不用浸水，直接空氣乾燥
5、加入50μl蛋白酶K工作液（蛋白酶K用蒸餾水稀釋，濃度為25μg/ml），37℃消化10—15min
6、棄去蛋白酶K工作液，0.1MTBS洗滌3minX3次逐級酒精脫水（85%，95%，100%酒精）1minX3次然後空氣乾燥
7、加入20μl探針，加蓋薄膜。（探針用預雜交液稀釋，濃度為5μg/ml）。
8、95℃變性10—12min；立刻置於冰塊上，防止復性。
9、37℃雜交16—20h
10、揭去薄膜，每張切片加入以下雜交後洗滌液：
>用2—3滴2XSSC37℃洗滌3minX2次；
>0.5XSSC37℃洗滌3minX2次；
>0.2XSSC37℃洗滌3minX2次；
11、0.1MPBS/TBS緩沖液洗滌，1minX3次
12、滴加小鼠抗地高辛生物素標記的抗體工作液，37℃孵育45—60min；
13、0.1MPBS浸洗，5minX3次
14、滴加高敏鹼性磷酸酶鏈親和素復合物工作液，37℃孵育45—60min。
15、0.1MPBS浸洗，5minX3次
16、滴加NBT/BCIP顯色6—16h，
17、雙蒸水終止反應（37℃10min—2h），雙蒸水浸洗，5minX2次
18、滴加核固紅，30秒—5min；
19、雙蒸水浸洗，5minX3次
20、脫水、透明、封片

㈦ 蛋白marker為什麼能作為顯色條帶

蛋白marker可分為：一、未預染的Marker即寬分子量蛋白標准、高分子量蛋白標准以及低分子量蛋白標准;二、預染的Marker即單色預染和多色預染。

在western Blot過程中，分子量Marker就像個螺絲釘一樣沒雖然是個小細節，然而就是這樣一個小細節對實驗結果有著不可忽視的作用。這個 Western Blot參照家族的一員的作用主要是用來指示蛋白條帶所對應的分子量大小，只有標准量精確無誤了，實驗結果才有說服力，除此之外，蛋白標准還有表示轉移成功或者蛋白在凝膠上的電泳程度等等的作用，所以選擇正確的蛋白Marker也是western blot實驗成功的必要條件之一。

總體來說，蛋白分子量標准可以分成未染蛋白分子量標准、預染蛋白分子量標准二個級別。以下是關於蛋白分子量標準的小敘：

一. 未染色(pre mixed)蛋白分子量標准

未染色的蛋白分子量標準是最簡單，也是最准確的一種。由於沒有附帶染料分子或者是標記分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精確判斷蛋白大小必須的。現在的marker多數都選用預混和的Marker，方便不同大小的蛋白比較。預混的Marker通常有幾條帶加倍濃度作為指示，因為混合的條帶越多，越不好記，誰知道哪條是那條!數到眼都花了。所以當看到特別濃的那幾條標志帶就記得是哪裡了。不過要記得，小帶通常都不那麼容易看清楚的。在選擇上來說，當然是選擇其中至少有一條條帶和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。如果你的蛋白不幸在兩條跨度較大Marker條帶之間，選別的Marker吧。預混的Marker使用上不如預染Marker(pre-stained)好用，因為電泳過程中完全看不到，要和目標蛋白一起等到最後染色才「開蠱」，無法對實驗起預示參照作用。完全屬於「後知後覺」型的，當然還是比「不知不覺」不做對照的要好。

① 寬分子量蛋白標准

如果從實驗室總體考慮的，就選范圍盡量寬，條帶分布比較均勻的，這樣你的蛋白無論在哪個區間都容易判斷，避免正好落在一段空白區的危險。不過條帶越多，每次上樣量也就越費。拿到Marker後，如果買的是大包裝，就應該考慮分裝。多次反復凍融對於蛋白的危險，不用多說吧。另外要記得，寬譜的Marker不一定每條都能看到的，特別是Mini Cell。如果側重大蛋白，那小的可能就已經跑掉了，不是質量不好哦。

② 高分子量蛋白標准

通常在檢測大分子量蛋白經常使用到高分子量蛋白標准，

③ 低分子量蛋白標准

在一般的蛋白電泳當中，更常用的是低蛋白標準分子量，除了有指示蛋白大小的作用以外，有時還可以用作粗略的定量。實驗室用在一般蛋白電泳的低分子量蛋白標准中。

在低分子量蛋白標准這里還包括可特別小的蛋白標准，比如30kD以下蛋白或者多肽的分離辨別。其中GE的從2kD到16kD之間有6條帶的蛋白標准挺不錯，另外提醒一句，特別小的蛋白Marker條帶如果要顯色好，上樣一定要上足夠的量哦。

二.預染蛋白分子量標准

預染蛋白分子量是一些純化好的蛋白混合物，通過與染料共價耦聯，在電泳過程中或者轉膜時可以直接觀察到。預染蛋白分子量的出現方便了我們的實驗，這種蛋白分子量標准可以幫助我們在電泳時、電泳後，以及轉膜後監測電泳情況和估計遷移率——比如，已知垂直電泳最佳分辨區域大約在膠的2/3處，如果使用預染Marker就可以預測目標蛋白進入最佳分辨區時停止電泳以得到最佳分辨效果;如果觀察到Marker電泳異常也可以及時終止電泳;另外在Western Blot轉膜以後可以直接觀察蛋白轉膜是否完全，還可以在膜上標記蛋白分子量，所以吸引了許多實驗室人員購買預染蛋白標准。值得注意的是預染蛋白Marker與染料共價耦聯，所以在不同的緩沖條件下電泳時遷移特性可能會發生某些變化，可能導致一些偏差，所以不太適合精確定位蛋白——不過多數情況下Marker的條帶未必能和我們的目標蛋白完全一樣，我們得到的也不過是一種相對Marker指示的參考大小，最後都需要Western來定性，所以如果不是要區分大小相近的條帶，預染Marker還是很好用的，而且也可以和未染色的蛋白標准一起使用。

預染蛋白標准可以分為兩種：單色預染和多色預染，其實區別就在於幫助在實驗過程中辨認某個條帶的大小——Marker條帶越多參考價值越大，可就越難辨認區分，如果用不同的顏色來區別就比較好辨認啦。如果沉悶的電泳實驗中跑出五顏六色的彩虹Marker，此時心情想必會愉快一些!單色的Marker通常是利用其中某些條帶加倍濃度來提示其大小的。還有一點特別要注意，由於轉膜是一個將膠里的Marker濃縮在潔白的膜上，所以需要的上樣量相對少一些，如果想要在電泳過程中看到美麗的「彩虹」，或者單色的Marker往往需要比說明書里多加一些Marker的。

三、Western專用的蛋白分子量標准

①生物素標記蛋白標准

未染色的Marker在做Western時，需要在印跡前先用麗春紅或者是SYPRO熒光蛋白染色液等不幹擾Western Blot的染色方法顯色，在膠上做標記最後才能「拼」在最後的結果中，如果是預染的Marker就要在轉膜後標記膜，或者剪膜，最後在「拼上」。要是想直接將Marker結果顯示在最後結果上，不用手工作圖或者拼接，那就要Western專用的Marker了。比如生物素標記的蛋白標准。這種方法主要是配合化學發光法：在蛋白分子量上標記生物素，通過帶有抗生物素的抗體或者偶聯鏈親黴素的抗體，在化學發光檢測到目的蛋白帶時就可以同時看到相應的分子量標准一起發光顯影了。不同於普通蛋白分子量標準的便宜、預染蛋白分子量的方便，這一方法的優點是與Marker和目的蛋白對應性好，同時在同張片上顯示，不用拼接，利於分析。缺點是如果樣品中帶有生物素背景，那個抗生物素抗體有可能影響結果，而且反應體系太過復雜也會干擾實驗結果。

②特殊標記蛋白標准

在經過修飾的蛋白標准中，除了生物素標記以外，近些年由於下游蛋白操作的豐富化與復雜化，也出現帶有「尾巴」的蛋白標准。比如His-Tag，如果每個Marker條帶都有His –tag，那二抗添加His-Taq抗體很容易將Marker條帶顯示在Western結果上。很方便，問題就是有可能有潛在的干擾，比如樣品中正好有類似Histag的結構。不過這可以通過對照檢測的。

㈧ 生物素標記的DNA探針用什麼方法檢測

生物素標記的DNA探針用什麼方法檢測
以病原微生物DNA或RNA的特異性片段為模板,人工合成的帶有放射性或生物素標記的單鏈DNA片段,可用來快速檢測病原體.
怎麼檢測：
將一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或熒光染料等標記後製成的探針.可與固定在硝酸纖維素膜的DNA或RNA進行互補結合,經放射自顯影或其他檢測手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在.
以細菌為例,目前分子雜交技術用於細菌的分類和菌種鑒定比之G+C百分比值要准確的多,是細菌分類學的一個發展方向.加之分子雜交技術的高敏感性,分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景.細菌的基因組大小約5×106bp,約含3000個基因.（各種細菌之間絕大部分DNA是相同的,要獲得某細菌特異的核酸探針,通常要採取建立細菌基因組DNA文庫的辦法,即將細菌DNA切成小片段後分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫.然後用多種其它菌種的DNA作探針來篩選,產生雜交信號的克隆被剔除,最後剩下的不與任何其它細菌雜交的克隆則可能含有該細菌特異性DNA片段.將此重組質粒標記後作探針進一步鑒定,亦可經DNA序列分析鑒定其基因來源和功能.）括弧里比較重要!

㈨ 如何用光敏生物素標記質粒

如何用光敏生物素標記質粒
常將放射性同位素如32 P連接到某種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）上做為標記物，然後通過切口平移法標記探針。
切口平移法（nick translation）是利用大腸桿菌DNA聚合酶I (E.coli DNA polymerase I) 的多種酶促活性將標記的dNTP摻入到新形成的DNA鏈中去，形成均勻標記的高比活DNA探針。其操作方法如下：
⑴取1?g DNA溶於少量無菌雙蒸水中，加入5?l距離大約10×切口平移緩沖液 (0.5mol/L Tris－HCl，PH7.2；0.1 mol/L MgSO4 ；1mmol/L二硫蘇糖醇；500?g/mL牛血清白蛋白），加入除標記物（如?-32 p-dATP）外的其它三種dNTP（如dCTP，dGTP，dTTP）溶液，20mmol/L溶液各1?l。
⑵加入100?ci（10?l）標記物溶液，加入無菌雙蒸水至終體積為46.5?l，混勻，加入0.5?l稀釋的DNaseI溶液，混勻；加入1?l（約5單位）E.coli DNA polymerase I，混勻。

㈩ 50分急求 如何用光敏生物素標記質粒

生物素化質粒ds-DNA：將含質粒pBR332的大腸桿菌在含氨苄青黴素的LB培養基中擴增，取純培養物用MagicTM DNA純化系統，按Promega公司所附操作說明書提取質粒ds-DNA。取純化的不含單鏈DNA的大腸桿菌質粒ds-DNA直接與長臂光敏生物素混合，用游標記燈進行光照標記，以制備生物素化質粒ds-DNA。可參考以下步驟：在一滅菌EP管中加待標記DNA 5ug／10uL，在暗室中加入5ug／uL光敏生物素，充分混勻，置冰浴中。

在特製光源下10cm處照射20min。加入100mmol／LTris-HCl，pH9．0(含0．1mmol／LEDTA)10uL，混勻。再加入等體積仲丁醇，混勻。離心lmin(10 000r／rain)，吸去上層仲丁醇，棄去。再加入仲丁醇25uL，重復提取游離的光敏生物素。吸去上層無色仲丁醇後，加入5uL3mol／L醋酸鈉，充分混勻，加入冷無水酒精100gL充分混勻，沉澱標記的DNA，置-20℃過夜(或-70℃l5min)，15 000r／min離心20min，沉澱物再用70％乙醇洗1次，離心，抽干，溶於0．1mmol／LEDTA或TK中，測定探針濃度，分裝，保存於-20℃。