微生物如何制葯

A. 細菌是怎麼樣制葯的

也許人你會問：小小的細菌能生產葯？它對人體會有害嗎？人們熟知激素、淋巴因子、神經多肽、調節蛋白、酶、凝血因子等人體活性多肽以及某些疫苗對於疾病的診斷、預防和治療有著重要的價值。但由於材料來源困難、技術難度大、造價高而不能付諸應用，往往使患者望而卻步。但是日益發展的微生基因工程為人類提供了一個生產葯物的強有力的技術手段。

根據目的基因導入內的受體細胞的類型，可將基因工程分為三類：微生物基因工程、植物基因工程和動物基因工程。微生物基因工程是最早出現也是研究最多的新興技術領域。這是將目的基因(異源基因）導入微生物細胞內進行克隆，即無性繁殖。在這個過程中，異源基因會在大腸桿菌中得到表達，產生出相應的蛋白質來。最常用的微生物是大腸桿菌。它是一種寄生在人和動物腸道里的無害細菌，不僅繁殖速度極快，也比較容易接受外來的遺傳物質。因此，科學家們紛紛把它作為理想的受體，把異源有用基因植入其體內，構建能生產對人類有用的物質的基因工程苗，也就是對大腸桿菌進行基因改造，使其成為有用物質的生產工廠。

首先我們來紹一個人生長激素釋放抑制素的「生產」是怎樣進行的。

人生長激素釋放抑制素(somatoation，簡稱SS）是一種多肽激素，它由14個氨基酸組成，在人的腸道以及胰臟中合成。這種激素有廣泛的生理功能，最主要的是參與生長的調節。它能抑制生長激素、胰島素等其他激素的分泌，對胃炎、糖尿病、急性胰腺炎、肢端肥大症等都有治療作用。

胰島素是從胰臟的胰島細胞里分泌出來的，它是治療糖尿病的特效葯。胰島素能調節血液里的糖分的含量，保持血糖平衡。糖尿病患者由於自身不能分泌胰島素，因糖的新陳代謝不正常而在痛苦的煎熬中度日。對這種病人的治療，只能依靠注射胰島素來解決，而胰島素在過去只能依靠從豬和牛的胰臟中提取出來，數量有限，成本很高，是千百萬糖尿病患者可望而不及的貴重葯品。

利用「細菌制葯廠」生產醫用葯物變為現實後，人們利用這種方法生產的葯物接連不斷。

人的生長激素是人體內必不可少的一種激素。缺少它，人就會導致垂體性侏儒症。這種激素只能從外傷致死者的腦下垂體來提取，產量極為有限，全世界極端短缺，售價十分昂貴。為了解決這一難題，科學家們致力於用微生物基因工程技術來製造人的生長激素。

「細菌制葯廠」生產的另一重要產品的鬆弛素。鬆弛素是婦女順產的必備葯品，有了它可以大大減緩婦女在生育時的痛苦，也可以減少剖腹產的比例。人們還發現，在臨床上使用鬆弛素時，孕婦的關節炎也往往隨之消失，但產後，關節炎又會復發。那麼是不是鬆弛素對關節炎也有療效呢！這是個極令人感興趣的問題，但卻因用常規方法生產鬆弛素成本高、產量低，難以用足夠鬆弛素去試驗以最終確定其對關節炎的療效。為了能盡快提供價廉質優數量充分的鬆弛素，美國基因技術公司與澳大利亞一家研究所合作，成功地用細菌產生了這種葯品，它既可滿足產婦的需要，也為探討鬆弛素在醫學上的進一步應用創造了條件。

干擾素是用基因工程技術產出的又一種重要葯物。干擾素是人體或動物的細胞產生的一種蛋白質，它可以使細胞獲得對病毒感染的免疫力，能夠治療由病毒引起的疑難病症。但是干擾素只能從人的血液中提取，每公斤的人血只有0.5微克，其昂貴程度就可想而知了。針對這一現狀，科學家積極尋求用基因工程技術來生產干擾素。1980年，美國基國公司把人體白細胞干擾素基因轉移到大腸桿菌中，使大腸桿菌成功地生產出了干擾素。經過臨床試驗證明，所生產的干擾素具有重要的醫學價值和經濟價值。

B. 微生物制葯的簡介

本書是一本全面論述微生物葯物研究、開發、生產的技術圖書。詳細介紹了從葯物產生菌的分離、篩選，菌種改良、保藏，到微生物葯物的篩選、生物合成、發酵工藝、費力鑒別各個環節，內容豐富完整，強調生物技術與葯物的結合；理論基礎與技術要點互相補充，既提供了基本的知識系統,又具有較強的可操作性；同時介紹了微生物產生的活性物質的結構和生活活性，其內容豐富、緊跟技術進展，對微生物新葯的研發極具參考價值。本書由具有豐富科研經驗的資深研究人員和開發人員編寫，收集了國內外微生物葯物研究的進展，並結合我國的研究經驗和成果，是一本理論與技術兼備的使用技術專著。可供從事微生物葯物、其他生物技術葯物研究和生產的相關技術和管理人員，以及生物技術相關學科的科技人員、大專院校師生使用和參考。

C. 典型生物葯物的一般製造流程是什麼

一般生物制葯的主要流程如下：1. 上游階段
1.1 目的基因的制備
目的工程的主要目的是使優良性狀相關的基因聚集在同一生物體中,創造出具有高度應用價值的新物種. 為此必須從現有生物群體中,根據需要分離出用於克隆的次類基因,這樣的基因稱之為目的基因. 基因工程中獲得的目的基因主要用於: (1).研究該基因,分析其結構,功能和表達的調空機制 (2).和正常基因比較,找出基因的異常點,探索疾病發生的分子生物學基礎. (3).研究生物種系的進化 (4).建立基因療法,將正常基因引入病人體內,治療遺傳性疾病(5).大量表達某種基因,生產出需要的蛋白和多肽 (6).對某些基因進行改選,改良動植物品種.
不同基因組類型的基因組大小不同,基因組和基因排列也各不相同,因此,分離目的基因應採用不同的途徑和方法
1.1.1 構建cDNA基因文庫分離法
cDNA文庫是以真核細胞中分離純化出所有的mRNA,在以mRNA為模板合成cDNA與適當的載體重組轉入宿主細胞,這樣建立起來的cDNA重組分子集合體稱為cDNA文庫.而cDNA文庫中插入片段的總和可代表某一種生物全部的mRNA序列.
1.1.1.1 cDNA文庫的構建
構建cDNA文庫主要包括以下步驟: (1).細胞總RNA的制備及mRNA的分離 (2).以mRNA為模板,合成cDNA第一條鏈 (3).雙鏈cDNA的合成,而將mRNA—DNA雜交分子轉變為雙鏈cDNA分子 (4). CDNA與載體的連接和噬菌體顆粒的包裝及傳染或質粒的轉化等
1.1.1.2 cDNA克隆的優越性
自20世紀70年代初說創cDNA克隆問世以來,以採用構建和篩選cDNA文庫的方法克隆了許多目的基因的cDN**段.在基因工程操作中,也長以cDNA為探針從基因文庫中分離相應的基因克隆.因此, cDNA克隆常常以基因分離和結構分析的著手點,在分子生物學研究和基因工程應用等方面具有十分重要的意義.
1.1.2 構建基因組文庫分離法
1.1.2.1 基因組文庫的概念
將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段,分別與適合的載體重組後導入宿主細胞,這些重組分子中插入片段的總和可代表該生物全部基因組序列.這種通過重組,克隆方法保存在宿主細胞中的各種DNA重組分子的集合體稱為基因組文庫.
1.1.2.2 基因組文庫的大小
克隆片段的平均大小/bp 基因組的大小/bp
2×10^6(細菌) 2×10^7（真菌） 3×10^9（動物）
LN SJ LN SJ LN SJ
5×10^3 400 1831 4000 18418 600000 2736110
10×10^3 200 919 2000 9208 300000 1381550
20×10^3 100 458 1000 4603 150000 690774
40×10^3 50 278 500 2300 75000 345386
一個理想的基因組文庫因該是在克隆群體中包含完整基因組的所有DNA序列.這就要求在打斷基因組DNA時盡可能做到隨機切割,實際上,無論採用什麼方法的不能達到理論上的切割.應此構建的基因組文庫應包含的克隆子數理論值和經驗值之間相差比較大.幾類基因組文庫的大小見下表: 「2」
1.1.2.3 構建基因組文庫的類型
通過克隆，重組方法構建的基因組文庫主要有：
(1)構建λ噬菌體基因組文庫；（2）構建考斯質粒基因組文庫
(3) 構建YAC基因組文庫
1.1.3 直接分離法
1.1.3.1 限制性核酸內切酶酶切分離法
限制性核酸內切酶酶切分離法適於簡單基因組中分離目的基因。質粒和病毒等DNA分子小的只有幾千鹼基，大的也不超過幾萬鹼基，編碼的基因較少，獲得的目的基因方法比較簡單。
1.1.3.2 基因分離的物理化學法
這是基因工程在發展初期所用的方法，某些生物的rDNA基因最早都是利用該法分離獲得的，但目前很少採用。次方法主要有：密度梯度離心法、單鏈酶解法和分子雜交法等。1.1.3.3 雙抗體免疫法分離編碼蛋白的基因
雙抗體免疫法分離編碼蛋白的基因適於某一真核細胞的蛋白質已被分離純化，且足以產生抗體。
1.1.3.4 利用酶促反轉錄發直接從特定mRNA分離基因
酶促反轉錄主要用於合成分子質量較大，轉錄產物mRNA易分離目的基因。
目的基因的mRNA為模板 逆轉錄酶 cDNA DNA聚合酶雙鏈 雙鏈cDN**段
與合適載體重組並轉入受體菌 cDNA克隆
1.2 目的基因的分離
通過適當的方法構建上一個完整的基因組DNA文庫或CDNA文庫，意味著包含目的基因在內的所有基因都得以克隆，但並不等於完成了目的基因的分離。因為在基因文庫中，不論是CDNA文庫還是基因組文庫，含目的基因的克隆子都只是數以萬計的克隆子中的一個，其中究竟哪個克隆子含有我們所需要的目的基因序列還不清楚。因此，還需要下一個步驟要進行的就是目的基因的分離，主要方法有：
（1）目的基因的功能克隆 （2）序列克隆法
（3）利用差示分析法分離目的基因克隆 （4）功能結合法篩選目的基因
（5）DNA插入誘變法分離目的基因（6）應用基因定位克隆技術分離篩選目的基因
（7）基因的定位侯選克隆法（8）染色體顯微切割與微克隆法
（9）根據生物大分子內的相互作用分離目的的CDNA克隆
（10）篩選目的基因片段的差別雜交及減法雜交技術
1.3 基因克隆載體
載體是攜帶目的基因的DN**段進入受體細胞進行擴增和表達的工具。常用的載體是經過改造的細菌質粒，噬菌體，黏粒和病毒
1.3.1 質粒克隆載體
質粒是細菌染色體外的雙鏈環狀的能自我復制的小分子DNA，其對細胞本身的生長繁殖不是必需的，但可以賦予細菌一定的類型，如耐熱型等。
與構建克隆載體相關的質粒性質有：
（1） 粒的復（2） 制型（2）質粒的不（3） 相容性
（3）質粒的接合性
（4）質粒作為基因工程載體需要具備的條件：作為基因工程載體的質粒都是經過人工改造過的質粒，具備以下特點：
a, 相對分子質量小3—10kb b, 是鬆弛型復制質粒
c, 是非接合型質粒 c, 質粒上有多個限制酶的單一切點
d, 帶有雙選擇標記
1.3.2 病毒（噬菌體）克隆載體
病毒主要由DNA（或RNA）和外殼蛋白組成，經包裝後成為病毒顆粒。通過感染，病毒顆粒進入宿主細胞，利用宿主細胞的合成系統進行DNA(或RNA)復制的殼蛋白質的合成，實現病毒顆粒的增殖。人們利用這些性質構建了一小列分別適用於不同生物的病毒克隆載體。通過此種方法構建成的基因克隆載體主要有：
（1） 噬菌體克隆載體cosmid克隆技術（黏粒）（2）Μ13噬菌體克隆載體
（2） aMV克隆載體（4）煙草花葉病毒（ TMV）載體克隆
（5）SVCO克隆載體（6）反轉錄病毒克隆載體
（7）腺病毒克隆載體（8）痘苗病毒克隆載體
（9）桿狀病毒表達克隆載體
1.3.3 其他類型的克隆載體
（1）染色體定位整合克隆載體（2）人工染色體克隆載體
（3） 特殊用途克隆載體：如啟動子探針型，（4） 誘導型，（5） 反義表達組織特異表達，（6） 分泌型表達，（7） 雙啟動子，（8） 串族啟動子和含增強子表達克隆載體等等
1.4 目的基因和載體的連接（重組）
目的基因和載體連接前要先用同一種限制酶將目的基因和載體切割成黏性端或平端，也可以用物理方法切割後再用酶補成平端
體外連接是基因工程的重要環節，體外連接要減少載體的自身環化，提高重但子陽性率。主要的連接方法有：黏性末端連接、平端連接、定向插入和同源多聚尾。
1.5 重組體導入受體細胞
外源目的基因與載體在體外連接重組後形成重組的DNA分子。該重組DNA分子必須導入適宜的受體細胞在中才能使外源目的基因得以大量擴增或表達。隨著基因工程的發展，從低等的原核細胞，到簡單的真核細胞，進一步達到結構復雜的高等動，植物細胞都可以作為基因工程的受體細胞。選擇適宜的受體細胞已經成為重組基因高效克隆或表達的基本前提之一
1.5.1 受體細胞的選擇要求
目的基因獲得後,必須在合適的宿主細胞中才能進行表達,才能獲得目的產物.應此,宿主細胞必須滿足:容易獲得較高濃度的細胞;能利用易得廉價的材料;不致病、不產生內毒素;發熱量低,需氧低,適當的發酵溫度和細胞形態;容易進行代謝調控;容易進行DNA重組技術操作技術;產物的產量、產率高,產物容易提取純化.
1.5.2 受體細胞的類型
人們通過研究,根據需要獲得了一定的目的產物,而目的基因能否的到有效的表達,關鍵在與受體細胞的選擇.
1.5.2.1 原核生物細胞
由於原核生物作為基因工程受體具有其他生物所沒有的優點,而且人們對其遺傳背景清楚,所以早期開展的基因工程操作,都是以原核生物為受體細胞.目前研究比較多的有:大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈黴菌等.
1.5.2.2 真核生物細胞
由於真核生物的細胞結構、基因組成和基因表達較為復雜,適用於原核生物的轉基因方法大多數難以有效地用於真核生物.近年來經過探索,發現它可以對表達的蛋白質進行翻譯後加工過程,有利於保持天然結構和生物活性.並用這些方法有效的獲得了轉基因真核生物.研究較多的有:酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等等.
1.5.3 重組子的篩選
在重組DNA分子的轉化、轉染和轉導過程中,並非所有的的受體細胞 都能被導入重組DNA分子.一般僅有少數重組DNA分子能進入受體細胞,同時也只有極少數的受體細胞在吸納重組DNA分子之後能良好增殖.因此,如何將被轉化細胞從大量受體菌細胞中初步篩選出來,然後進一步檢測到含有期待重組DNA分子的克隆子將直接關繫到基因克隆和工程操作紅極為重要的環節.
重組子的篩選可以根據載體的類型、受體細胞種類以及外源DNA分子導入受體細胞的手段等採用不同的方法,一般包括以方面:
(1).遺傳直接篩選法; (2),核算分子雜交檢測法; (3)依賴於重組子結構特徵分析的篩選法;
(4)免疫化學檢測法; (5)轉譯篩選法; (6)亞克隆法; (7)插入失活法;
(8)電子顯微鏡作圖檢測法; (9)基因表達產物分析法; (10)DNA序列分析法.
1.6、外源基因的表達
基因工程技術的核心是基因表達技術。迄今為止，已構建了多種基因表達系統，包括原核生物和真核生物基因表達系統，不同的表達系統具有各自的特點。
1.6.1 基因表達的機制（過程）
1.6.1.1 外源基因的起始轉錄
外源基因在宿主細胞中的有效表達是基因工程的核心問題，而外源基因的起始轉錄又是基因表達的關鍵。
1.6.1.2 mRNA的延伸與穩定性
外源基因起始轉錄後，保持mRNA的有效延伸、終止及穩定存在是外源基因有效表達的關鍵。
mRNA的穩定性直接導致決定翻譯產物的多少，對原核細胞來說，最佳的方法是選擇一個RNase缺失受體前。對真核細胞來說則需考慮增加mRNA的正確加工，提高成熟mRNA的穩定性。
1.6.1.3 外源基因mRNA的有效翻譯
翻譯是mRNA指導多肽鏈生成的過程，翻譯的起始是多種因子協同作用的過程，其中包括mRNA,16SrRNA,fMet-tRNA之間的鹼基配對，還有mRNA序列上的終止密碼對正確翻譯的效率有很大影響。
1.6.1.4 表達蛋白在細胞中的穩定性
外源基因的表達產物能否在宿主細胞中穩定積累而不被內源蛋白水解酶所水解是基因有效表達的一個重要因素，因此，為了避免此現象的發生可從以下幾個方面考慮：
（一）構建融合蛋白表達系統; （二）構建分子體蛋白表達系統;
（三）構建包涵體表達系統; （四）選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統.
1.6.1.5 目的基因沉默
基因沉默是導致外源基因不能正常表達的重要因素。它的作用機制主要有三種：位置效應的基因沉默、轉錄水平的基因沉默和轉錄後水平的基因沉默。基因沉默現象主要表現在轉基因動物和植物中。
目的基因沉默是在核酸水平上DNA與DNA,DNA與RNA,RNA與RNA相互作用的結果。由於重復序列或同源系列是基因沉默的普通原因之一，因而在構建表達載體時，應盡可能避免與內源序列具有較高的同源性。此外，可以通過選擇甲幾基化酶活性較弱的受體細胞或以化學物質處理受體細胞抑制甲基化作用。
1.6.2 基因表達的調控元件
通過研究發現主要的基因表達調控元件有：啟動子、增強子、終止子、衰減子、絕緣子和反義子
1.6.3 外源基因表達系統
外源基因表達系統泛指目的基因與表達載體重組後，導入合適的受體細胞，並能在其中有效的表達，產生目的基因產物（目的蛋白）。由此可知，外源基因表達系統由基因表達載體和相應的受體細胞兩部分組成。基因表達系統有原核生物表達系統和真核生物表達系統。目前，利用較多的是原核生物表達系統，因其遺傳背景清楚，繁殖快，表達率高等特點。近年來，真核生物基因表達系統發展很快，因其可以對表達的蛋白質進行翻譯後加工過程，有利於保持天然結構和生物活性等優點。目前主要應用的表達系統有：大腸桿菌基因表達系統、芽孢桿菌表達系統、鏈黴菌表達系統、藍藻表達系統、酵母表達系統、哺乳動物細胞基因表達系統、植物細胞基因表達系統；還有最新研究的兩個新的表達系統[3]：巴斯德畢赤酵母表達系統和動物乳腺生物反應器——全新的生產模式。
2、下游階段
基因工程只要的過程關鍵在於上游階段，因它可以獲得有效的工程菌，但下游純化階段也必不可少。因此為了獲得合格的目的產物，必須建立相應的醫葯生物技術產品的分離純化工藝。
2.1、基因工程菌發酵：
良好的發酵工藝對表達外源蛋白至關重要，直接影響下游純化工藝，形象到產品的質量和生產成本，決定產品在市場上的競爭力。目前，基因工程菌培養常用方法有：補料分批培養、連續培養、透析培養、固定培養。近年來，生物葯品已進入生物技術時代，對基因工程菌的培養設備要求十分嚴格，主要採用新型自動化發酵罐。
2.2、分離純化的基本過程：
分離純化是基因工程葯物生產中極其重要的
一環,這是由於工程菌經過大規模培養後，產生的
有效成分含量低，雜質含量高；另外由於基因工
程葯物是從轉化細胞，而不是從正常細胞生產的，
所以對產品的純度要求也高於傳統產品，主要的
步驟如右表：[4]
2.2.1、建立分離純化工藝根據
主要根據：（1）含目的產物的起始物料特點;
（2）物料中雜志的種類和性質;
（3）目的產物特性;
（4）產品質量的要求.
2.2.2、選擇分離純化方法的依據：
主要依據：
(1) 根據產物表達形式來選擇;
(2) 根據分離單元之間的銜接選擇;
(3) 根據分離純化工藝的要求來選擇.
2.2.3、常用的分離純化方法（見下表）[5]
方法 目的
離心/過濾 去除細胞、細胞碎片、顆粒性雜質(如病毒)
陰離子交換層析 去除雜質蛋白、脂質、DNA和病毒等
陽離子交換層析 去除牛血清蛋白或轉鐵蛋白等
超濾 去除沉澱物及病毒
疏水層析 去除殘余的雜蛋白
凝膠過濾 與多聚體分離
0.22μm微孔濾膜過濾 除菌
3、基因工程葯物：
自20世紀80年代初第一種基因工程產品——人胰島素投放市場以來，以基因工程葯物為主導的基因工程應用已成為全球發展最快的產業之一。隨著生物技術的快速發展，基因工程葯物將擁有越來越廣闊的發展前景。基因工程葯物主要包括細胞因子、抗體、疫苗、激素和寡核苷酸葯物等，它對預防和治療人類的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、各種傳染病、糖尿病、類風濕疾病等有重要作用。
3.1、基因工程激素類葯物
激素是一類由生物體內分泌腺或特異性細胞產生的微量有機物，通過體液或細胞外液運送到特定的作用部位，能引起特殊的生理效應。基因工程的激素類主要指通過基因工程方法合成的蛋白多肽類激素。目前被批准上市的激素類葯物有胰島素、人生長激素、人促卵泡激素等。
3.2、基因工程細胞因子類葯物
細胞因子是由細胞分泌的能夠調節生物有機體生理功能，參與細胞的增殖，分化和凋亡的小分子多肽類物質。目前被批准上市的產品有十多種。主要有：干擾素（IFN）、集落刺激因子（CSF）、白細胞介素（IL）、腫瘤壞死因子（TNF），趨化因子和生長因子（GF）等。它們的生物學功能主要表現為：調節免疫應答、抗病毒、抗腫瘤、調節機體造血功能和促進炎症反應等。
3.3、基因工程疫苗：
直接利用微生物制備疫苗來治療疾病取得了巨大的成就，但由於各種傳染病在世界范圍內廣泛存在，並不斷有新的致病微生物被發現，它們對人類的健康造成巨大威脅。利用基因工程方法制備疫苗對控制傳染病的復發和治療新的傳染病有重要意義。目前研究的基因工程疫苗包括：痢疾菌苗、霍亂菌苗、結核菌苗、流感菌苗、狂犬病疫苗、瘧疾疫苗、口蹄疫疫苗。
3.4 特殊基因工程葯物—防禦素
防禦素是一類在生物界廣泛存在的、富含半胱氨酸,具有微生物和一些惡性細胞抗性的小分子短肽.它的抗性譜十分廣泛,目前以發現它不但對細菌、真菌和被膜病毒(如愛滋病病毒)有廣泛的毒殺效應,對某些惡性腫瘤細胞也有毒殺作用.最近,對一些長期存活的愛滋病感染者的研究發現,他們體內的愛滋病抑制因子就是一類防禦素.這一研究發現給人們戰勝愛滋病帶來希望.
4. 基因工程研究發展前景
基因工程問世以來短短的二十幾年,顯示出了巨大的活力,使傳統的生產方式和產業結構發生了變化.特別是在醫葯行業,利用人工的方法合成了許多有用的葯物及人體器官等,取得了很大的經濟效益.今後,基因工程將重點開展基因組學、基因工程葯物、動植物生物反應器和環保等方面的研究.通過這方面的研究、開發,對人類的生活、生存環境從根本上優化做出巨大的貢獻.因此,我們相信基因工程的前景將是更加燦爛輝煌.

D. 在微生物發酵制葯過程中涉及哪些滅菌和消毒技術

發酵過程中採用的滅菌方法、原理和條件
採用強烈的理化因素使任何物體內外部的一切微生物永遠喪失其生長繁殖能力的措施，成為滅菌。滅菌常用的方法有化學試劑滅菌、射線滅菌、乾熱滅菌、濕熱滅菌和過濾除菌等。可根據不同的需求，採用不同的方法，如培養基滅菌一般採用濕熱滅菌，空氣則採用過濾除菌 。

滅菌的徹底程度受滅菌時間與滅菌劑強度的制約。微生物對滅菌劑的抵抗力取決於原始存在的群體密度、菌種或環境賦予菌種的抵抗力。滅菌是獲得純培養的必要條件，也是食品工業和醫葯領域中必需的技術。
方法概述滅菌常用的方法有化學試劑滅菌、射線滅菌、乾熱滅菌、濕熱滅菌和過濾除菌等。可根據不同的需求，採用不同的方法，如培養基滅菌一般採用濕熱滅菌，空氣則採用過濾除菌。

熱滅菌法

熱滅菌法利用高溫使微生物細胞內的一切蛋白質變性，酶活性消失，致使細胞死亡。通常有乾熱、濕熱和間歇加熱滅菌等法。

乾熱滅菌

火焰灼燒法或烘箱內熱空氣滅菌法稱為乾熱滅菌法(dryheatsterilization)。

把金屬器械或洗凈的玻璃器皿放入電熱烘箱內，在150～170℃下維持1～2小時後，可達到徹底滅菌(包括細菌的芽孢)的目的。灼燒(incineration或combustion)是一種最徹底的乾熱滅菌法，應用范圍僅限於接種環、接種針的滅菌或帶病原菌的材料、動物屍體的燒毀等。

濕熱滅菌

以沸水、蒸氣和蒸氣加壓滅菌。

巴氏消毒法：因最早由法國微生物學家巴斯德用於果酒消毒，故名。這是一種專用於牛奶、啤酒、果酒或醬油等不宜進行高溫滅菌的液態風味食品或調料的低溫消毒方法[1]
。

巴氏滅菌法就是濕熱滅菌，此法有兩種方式[1]
，①經典的低溫維持法(lowtemperatureholdingmethod，LTH)：在61.7～62.8℃下處理30分鍾;②較現代的高溫瞬時法(hightemperatureshorttime或flushpoint，HTST)：在71.6℃或略高溫度下處理15分鍾。在上述諸法中，以蒸氣加壓滅菌效果最好，可用常壓蒸氣滅菌，也可在高壓蒸氣鍋中(一般使用1千克/厘米2)滅菌,其蒸氣溫度可達121℃,能將耐熱的芽孢在30分鍾內全部殺死。但對某些易被高壓破壞的物質，如某些糖或有機含氮化合物，宜在0.6千克/厘米2壓力下(110℃)滅菌15～30分鍾。

煮沸消毒法：採用在100℃下煮沸數分鍾的方法，一般用於飲用水的消毒[1] 。

間歇滅菌

間歇滅菌連續3天,每天進行一次蒸氣滅菌的方法。此法適用於不能耐 100℃以上溫度的物質和一些糖類或蛋白質類物質。一般是在正常大氣壓下用蒸氣滅菌
1小時。滅菌溫度不超過100℃,不致造成糖類等物質的破壞，而可將間歇培養期間萌發的孢子殺死，從而達到徹底滅菌的目的。

輻射滅菌

輻射滅菌在一定條件下利用射線進行滅菌的方法。較常用的有紫外線，其他還有電離輻射(射線加快中子等)。波長在25000～80000納米之間的激光也有強烈的殺菌能力,以波長26500納米最有效。輻射滅菌法僅限於某一定材料，因所需設備復雜，難於廣泛使用。

滲透壓滅菌

滲透壓滅菌利用高滲透壓溶液進行滅菌的方法。在高濃度的食鹽或糖溶液中細胞因脫水而發生質壁分離，不能進行正常的新陳代謝，結果導致微生物的死亡。

化學試劑滅菌

大多數化學葯劑在低濃度下起抑菌作用,高濃度下起殺菌作用。常用5%石炭酸、70%乙醇和乙二醇等。化學滅菌劑必須有揮發性，以便清除滅菌後材料上殘余的葯物。

化學滅菌常用的試劑有表面消毒劑、抗代謝葯物(磺胺類等)、抗生素、生物葯物素抗生素是一類有微生物或其他生物生命活動過程中的合成的次生代謝產物或人工衍生物，他們在很低濃度時就能抑制或感染它種生物(包括病原菌，病毒，癌細胞等)的生命活動，因而可用作優良的化學治療劑。

E. 簡述微生物發酵制葯的基本流程

保藏菌種→活化→搖瓶培養→一級種子→二級種子→發酵→提取→精製→成品。

F. 簡述微生物在制葯，食品行業中的作用

微生物來源的葯物通稱為生物葯物，是微生物在其生命活動過程中產生的，能以極低濃度抑制或影響其他生物機能的低分子量代謝物。包括抗生素和具有其他葯理作用的微生物次級代謝產物，以及以微生物次級代謝為先導化合物、通過生物或化學方法製得的衍生物。20世紀40年代青黴素問世，開創了微生物葯物的新時代。抗生素在世界范圍內廣泛使用，使人類許多傳染性疾病得到控制；隨著微生物制葯的發展，它們在腫瘤化療、器官移植以及高膽固醇血症治療等方面也發揮重要作用，成為不可缺少的葯物。

我們日常食用的很多食品都是通過微生物的作用生產的。如食醋是用糧食等澱粉質為原料，經微生物制曲、糖化、酒精發酵、醋酸發酵等階段釀制而成；酒類：包括果酒、啤酒、白酒及其他酒均是利用釀酒酵母，在厭氧條件下進行發酵，將葡萄糖轉化為酒精生產的；啤酒是以優質大麥芽為主要原料，大米、酒花等為輔料，經過制麥、糖化、啤酒酵母發酵等工序釀制而成的一種含有二氧化碳、低酒精度和多種營養成分的飲料酒；醬油：微生物在生長過程中會產生大量的蛋白酶，將培養基中的蛋白質水解成小分子的肽和氨基酸，然後淋洗、調製成醬油產品。發酵乳製品是用良好的原料乳經過殺菌作用接種特定的微生物進行發酵作用，產生具有特殊風味的食品；酸奶：牛奶在厭氧條件下，由乳酸菌發酵，將乳糖分解，並進一步發酵產生乳酸和其他有機酸，以及一些芳香物質和維生素等；同時蛋白質也部分水解。麵包：現在的麵包均是利用活性乾酵母（麵包酵母）經活化後，與麵粉混合發酵，再加入各種添加劑，經烤制生產的。麵粉發酵後澱粉結構發生改變，變得易於消化、營養易於吸收。像這類食品還有很多，可見微生物在食品生產中發揮了非常大的作用。

G. 微生物制葯的概述

微生物制葯技術是工業微生物技術的最主要組成部分。微生物葯物的利用是從人們熟知的抗生素開始的，抗生素一般定義為：是一種在低濃度下有選擇地抑制或影響其他生物機能的微生物產物及其衍生物。有人曾建議將動植物來源的具有同樣生理活性的這類物質如魚素、蒜素、黃連素等也歸於抗生素的范疇，但多數學者認為傳統概念的抗生素仍應只限於微生物的次級代謝產物。
近年來，由於基礎生命科學的發展和各種新的生物技術的應用，由微生物產生的除抗感染、抗腫瘤以外的其他生物活性物質的報道日益增多，如特異性的酶抑制劑、免疫調節劑、受體拮抗劑和抗氧化劑等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活動的范圍。但這些物質均為微生物次級代謝產物，其在生物合成機制、篩選研究程序及生產工藝等方面都有共同的特點，但把它們通稱為抗生素顯然是不恰當的，於是不少學者認為，把微生物產生的這些具有生理活性（或稱葯理活性）的次級代謝產物統稱為微生物葯物。於此微生物葯物應包括：具有抗微生物感染和抗腫瘤的作用的傳統的抗生素以及特異性酶抑制劑、免疫調節劑、受體拮抗劑、抗氧化劑等。

H. 請問生物制葯技術包括哪些方法

生物技術制葯概念：
採用現代生物技術,藉助某些微生物、植物、動物生產醫葯品，叫作生物技術制葯。
生物技術：基因工程、細胞工程、酶工程、發酵工程、生化工程、蛋白質工程、抗體工程等。
現代生物技術包括:
⑴重組DNA技術
⑵細胞和原生質體融合技術
⑶酶和細胞的固定化技術
⑷植物脫毒和快速繁殖技術
⑸動物和植物細胞的大量培養技術
⑹動物胚胎工程技術
⑺現代微生物發酵技術
⑻現代生物反應工程和分離工程技術
⑼蛋白質工程技術
⑽海洋生物技術
生物制葯新試劑新技術：
細胞移植用於:骨髓移植治療白血病、免疫缺陷、再障性貧血等。
基因治療有:致死性遺傳疾病、癌症、愛滋病、心臟病等。
生物試劑開發單克隆抗體：用於診斷和治療，熒光抗體法、DNA探針、PCR等檢測技術的建立
新型生物反應器有:氣升式生物反應器、流化床式生物反應器、固定床式生物反應器、袋式或膜式生物反應器、中空纖維生物反應器等。
我國生物制葯
已上市的基因工程葯物和疫苗——-
1995年 白細胞介素-2
1996年 α1b-干擾素α2a-干擾素 α2b-干擾素
1997年 粒細胞集落因子 紅細胞生成素
1992年 乙型肝炎疫苗
醫葯生物技術發展展望：
21世紀是醫葯生物技術快速發展的時期, 生物制葯、化學葯物、中葯形成三足鼎立,有效的為人類健康服務。1.利用新發現的人類基因開發新型葯物。 2.新型疫苗的研製艾滋病疫苗和基因型癌疫苗等。
3.基因工程活性肽的生產基因葯物:淋巴因子、生長因子、 激素和酶
4.其它醫葯業將得到不斷改造和發展,早期診斷技術 轉基因葯材

I. 在微生物發酵制葯工藝中，如何確定最適發酵條件

1、如果是得到微生物細胞：盡量延長對數生長期以獲得最大量細胞。因此培養基的碳氮比低，即氮源多；補充新鮮培養基；回調pH值，維持最佳pH；適時降溫；較高的通氣量，維持高氧耗。等等。

2、如果是得到微生物代謝產物如抗生素：盡量延長穩定期。培養基前期碳氮比低，後期碳氮比高。補充新鮮培養基，碳氮比低；回調pH值，維持最佳pH；適時降溫；較高的通氣量，維持高氧耗。等等
微生物發酵分為 細胞培養和 細菌發酵
細胞培養來說 最適宜的條件無非是PH DO 溫度 攪拌速度 通氣量大小以及通氣方式 通氣氣泡大小等一些硬體措施，除此之外要重視培養基的營養成分和細胞所需要的營養成分是否匹配，培養過程中要定時取樣觀察細胞狀態，看細胞處於生長的什麼時期，分析細胞分裂周期，研究分裂周期內什麼時候所需要的營養成分多，需要哪種營養成分，比如谷氨醯胺的補加時間和補加量以及補加方式都是需要小試實驗才能確定的，同時也要重視細胞種類以及細胞特點進行合理的工藝優化
細菌發酵來講也是同樣的 但不管是細胞也好 細菌也好 首先還是要保證不污染其他微生物，才能保證工藝的摸索以及生產的順利進行

J. 微生物制葯的介紹

微生物在其生命活動過程中產生的，能以極低濃度抑制或影響其他生物機能的低分子量代謝物。微生物制葯利用微生物技術，通過高度工程化的新型綜合技術，以利用微生物反應過程為基礎，依賴於微生物機體在反應器內的生長繁殖及代謝過程來合成一定產物，通過分離純化技術進行提取精製，並最終制劑成型來實現葯物產品的生產。