生物素和親和素結合後如何分離

① 如何破壞生物素和鏈霉親和素的結合

如何破壞生物素和鏈霉親和素的結合
生物素（biotin，B）廣泛分布於動、植物組織中，常從含量較高的卵黃和肝組織中提取，分子量244．31Da．生物素分子有兩個環狀結構（如圖），其中Ⅰ環為咪唑酮環，是與親和素結合的主要部位；II環為噻吩環，C2上有一戊酸側鏈，其末端羧基是結合抗體和其他生物大分子的惟一結構，經化學修飾後，生物素可成為帶有多種活性基團的衍生物——活化生物素。活化生物素可以在蛋白質交聯劑的介導下，與已知的幾乎所有生物大分子偶聯，包括蛋白質，核酸，多糖，脂類等。
親和素（avidin，AV）亦稱抗生物素蛋白、卵白素，是從卵白蛋白中提取的一種由4個相同亞基組成的鹼性糖蛋白，分子量為68kD，等電點pI=10.5；耐熱並耐受多種蛋白水解酶的作用．尤其是與生物素結合後，穩定性更好。生物素與親和素間的作用是目前已知強度最高的非共價作用，親和常數（K）為1015mol/L，比抗原與抗體間的親和力（K=10.5～11L/mol）至少高1萬倍。並且，二者的結合穩定性好專一性強，不受試劑濃度，PH環境，抑或蛋白變性劑等有機溶劑影響。由於每個親和素能結合4個分子的生物素，這一特點可以用於構建一個多層次信號放大系統。因此，BAS即可用於微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可製成親和介質用於上述各類反應體系中反應物的分離、純化。

② 生物素-親合素系統的原理

生物素（biotin，B）廣泛分布於動、植物組織中，常從含量較高的卵黃和肝組織中提取，分子量244．31Da．生物素分子有兩個環狀結構（如圖），其中Ⅰ環為咪唑酮環，是與親和素結合的主要部位；II環為噻吩環，C2上有一戊酸側鏈，其末端羧基是結合抗體和其他生物大分子的惟一結構，經化學修飾後，生物素可成為帶有多種活性基團的衍生物——活化生物素。活化生物素可以在蛋白質交聯劑的介導下，與已知的幾乎所有生物大分子偶聯，包括蛋白質，核酸，多糖，脂類等。
親和素（avidin，AV）亦稱抗生物素蛋白、卵白素，是從卵白蛋白中提取的一種由4個相同亞基組成的鹼性糖蛋白，分子量為68kD，等電點pI=10.5；耐熱並耐受多種蛋白水解酶的作用．尤其是與生物素結合後，穩定性更好。生物素與親和素間的作用是目前已知強度最高的非共價作用，親和常數（K）為1015mol/L，比抗原與抗體間的親和力（K=10.5～11L/mol）至少高1萬倍。並且，二者的結合穩定性好專一性強，不受試劑濃度，PH環境，抑或蛋白變性劑等有機溶劑影響。由於每個親和素能結合4個分子的生物素，這一特點可以用於構建一個多層次信號放大系統。因此，BAS即可用於微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可製成親和介質用於上述各類反應體系中反應物的分離、純化。
親和素由於帶有一個糖鏈側鏈，導致容易和細胞表面的多糖發生非特異性親和。因此，鏈霉親和素被開發出來。
鏈霉親和素（streptavidin，SA）是由鏈黴菌streptomyces avidinii分泌的一種蛋白質，分子量為65kD。鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成，其中每條肽鏈都能結合一個生物素，並且不帶任何糖基，因此與親和素一樣，一個鏈霉親和素分子也能結合4個生物素分子，二者親和常數（K）亦為1015mol/L。鏈霉親和素的適用范圍比親和素更為廣泛。

③ 如何將兩個生物素標記的顆粒用鏈霉親和素連接起來

抽血檢測，一般用三代酶聯合免疫法 酶聯免疫法，簡稱ELISA。 它的中心就是讓抗體與酶復合物結合，然後通過顯色來檢測。 步驟：ELISA用血清來檢測，首先血液要經過至少半個小時的凝集，然後取血清（這是有些網友不理解為什麼醫院抽完了血對血置之不理的原因，其實是誤會）。將酶復合物用稀釋液稀釋後，加血清及陰性、陽性對照，還有就是質控品（這是嚴格的要求，它的范圍必須在質控范圍內）。經過一個小時的孵育，然後洗板，加底物，半個小時避光反應後加終止液即完成反應部分，然後就是讀數。由數值來判斷結果的陰性或陽性。嚴格的講，如果第一次檢測為陽性的話，無論是哪個實驗室，必須按照CDC的HIV操作規程來進行第二次檢測，第二次的方法必須與第一次的不同，如還是陽性，將送確認實驗室確認。有的醫院很不負責，將初篩陽性的報告發出後就不管了，這是不對的。必須經過確認實驗室確認後才可出陽性診斷。祝大家。PS，第一次檢測為陽性的話，一定要去確認實驗室再做一次，勇敢的去面對，也許結果就不一樣了。 基本原理是：①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。 ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。 具體方法有： （一）雙抗體夾心法 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下： （1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。 （2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。 （3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。 （4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。 根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。 （二）雙位點一步法 在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步（圖15-5）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。 （三）間接法測抗體 間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下： （1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。 （2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。 （3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。 （4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。 本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。 （四）競爭法 競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下： （1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。 （2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 （3）加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。 （五）捕獲法測IgM抗體 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下： （1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。 （2）加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。 （3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。 （4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。 （5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。 （六）應用親和素和生物素的ELISA 親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。 親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。

④ 每個親和素能結合多少個分子生物素

親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。

⑤ 什麼是親和素與生物素的結合常數

親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，由於每個分子由4個亞基組成，因此可以和4個生物素分子親密結合。在免疫機制有起重要作用！
生物素在人體內是不能單獨起作用的，它需要與其他酶、氨基酸脂肪衍生物等結合來綜合調控。生物素結合常數即表示了它與其他有機分子結合能力的大小。

⑥ 生物素親和素系統要注意什麼問題

靈敏度
生物素容易與蛋白質和核酸類等生物大分子結合，形成的生物素衍生物，不僅保持了大分子物質的原有生物活性，而且比恬度高，具多價性。此外，每個親和素分子有四個生物素結合部位，可同時以多價形式結合生物素化的大分子衍生物和標記物。因此，BAS具有多級放大作用，使其在應用時可極大地提高檢測方法的靈敏度。

特異性
親和素與生物素間的結合具有極高的親和力，其反應呈高度專一性。因此，BAS的多層次放大作用在提高靈敏度的同時，並不增加非特異性干擾。而且，BAS結合特性不會因反應試劑的高度稀釋而受影響，使其在實際應用中可最大限度地降低反應試劑的非特異作用。

穩定性
親和素結合生物素的親和常數可為抗原-抗體反應的百萬倍，二者結合形成復合物的解離常數很小，呈不可逆反應性；而且酸、鹼、變性劑、蛋白溶解酶以及有機溶劑均不影響其結合。因此，BAS在實際應用中，產物的穩定性高，從而可降低操作誤差，提高測定的精確度。

普適性
生物素-結合素系統的多功能性還能提供一套統一的研究方法。例如對於某待測分子，已經得到了對於該分子的生物素標記抗原，那麼配合結合親和素的膠體金可以在電鏡下觀測，配合結合熒游標記的親和素可以使用流式細胞儀篩選，配合連接到酶的親和素可以進行ELISA等免疫組化實驗。

⑦ 生物素親和素標記缺點是什麼

靈敏度生物素容易與蛋白質和核酸類等生物大分子結合，形成的生物素衍生物，不僅保持了大分子物質的原有生物活性，而且比恬度高，具多價性。此外，每個親和素分子有四個生物素結合部位，可同時以多價形式結合生物素化的大分子衍生物和標記物。因此，BAS具有多級放大作用，使其在應用時可極大地提高檢測方法的靈敏度。特異性親和素與生物素間的結合具有極高的親和力，其反應呈高度專一性。因此，BAS的多層次放大作用在提高靈敏度的同時，並不增加非特異性干擾。而且，BAS結合特性不會因反應試劑的高度稀釋而受影響，使其在實際應用中可最大限度地降低反應試劑的非特異作用。穩定性親和素結合生物素的親和常數可為抗原-抗體反應的百萬倍，二者結合形成復合物的解離常數很小，呈不可逆反應性；而且酸、鹼、變性劑、蛋白溶解酶以及有機溶劑均不影響其結合。因此，BAS在實際應用中，產物的穩定性高，從而可降低操作誤差，提高測定的精確度。普適性生物素-結合素系統的多功能性還能提供一套統一的研究方法。例如對於某待測分子，已經得到了對於該分子的生物素標記抗原，那麼配合結合親和素的膠體金可以在電鏡下觀測，配合結合熒游標記的親和素可以使用流式細胞儀篩選，配合連接到酶的親和素可以進行ELISA等免疫組化實驗。

⑧ 求助生物素-親和素標記技術的優缺點

BAS在實際應用中所具有的巨大優越性，主要表現在以下幾個方面。

靈敏度
生物素容易與蛋白質和核酸類等生物大分子結合，形成的生物素衍生物，不僅保持了大分子物質的原有生物活性，而且比恬度高，具多價性。此外，每個親和素分子有四個生物素結合部位，可同時以多價形式結合生物素化的大分子衍生物和標記物。因此，BAS具有多級放大作用，使其在應用時可極大地提高檢測方法的靈敏度。

特異性
親和素與生物素間的結合具有極高的親和力，其反應呈高度專一性。因此，BAS的多層次放大作用在提高靈敏度的同時，並不增加非特異性干擾。而且，BAS結合特性不會因反應試劑的高度稀釋而受影響，使其在實際應用中可最大限度地降低反應試劑的非特異作用。

穩定性
親和素結合生物素的親和常數可為抗原-抗體反應的百萬倍，二者結合形成復合物的解離常數很小，呈不可逆反應性；而且酸、鹼、變性劑、蛋白溶解酶以及有機溶劑均不影響其結合。因此，BAS在實際應用中，產物的穩定性高，從而可降低操作誤差，提高測定的精確度。

普適性
生物素-親和素系統的多功能性還能提供一套統一的研究方法。例如對於某待測分子，已經得到了對於該分子的生物素標記抗原，那麼配合結合親和素的膠體金可以在電鏡下觀測，配合結合熒游標記的親和素可以使用流式細胞儀篩選，配合連接到酶的親和素可以進行ELISA等免疫組化實驗。

其他
BAS可依據具體實驗方法要求製成多種通用性試劑（如生物素化第二抗體等）適用於不同的反應體系，而且都可高度稀釋，用量很少，實驗成本低；尤其是BAS與成本高昂的抗原特異性第一抗體偶聯使用，可使後者的用量大幅度減少，節約實驗費用．此外，由於生物素與親和素的結合具高速、高效的特性，盡管BAS的反應層次較多，但所需的溫育時間不長，實驗往往只需數小時即可完成

⑨ 有誰用生物素和親和素的

生物素（biotin，B）廣泛分布於動、植物組織中，常從含量較高的卵黃和肝組織中提取，分子量244．31Da．生物素分子有兩個環狀結構（如圖），其中Ⅰ環為咪唑酮環，是與親和素結合的主要部位；II環為噻吩環，C2上有一戊酸側鏈，其末端羧基是結合抗體和其他生物大分子的惟一結構，經化學修飾後，生物素可成為帶有多種活性基團的衍生物——活化生物素。活化生物素可以在蛋白質交聯劑的介導下，與已知的幾乎所有生物大分子偶聯，包括蛋白質，核酸，多糖，脂類等。
親和素（avidin，AV）亦稱抗生物素蛋白、卵白素，是從卵白蛋白中提取的一種由4個相同亞基組成的鹼性糖蛋白，分子量為68kD，等電點pI=10.5；耐熱並耐受多種蛋白水解酶的作用．尤其是與生物素結合後，穩定性更好。生物素與親和素間的作用是目前已知強度最高的非共價作用，親和常數（K）為1015mol/L，比抗原與抗體間的親和力（K=10.5～11L/mol）至少高1萬倍。並且，二者的結合穩定性好專一性強，不受試劑濃度，PH環境，抑或蛋白變性劑等有機溶劑影響。由於每個親和素能結合4個分子的生物素，這一特點可以用於構建一個多層次信號放大系統。因此，BAS即可用於微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可製成親和介質用於上述各類反應體系中反應物的分離、純化。