連接生物素化RNAs什麼意思

A. 免疫學中elsa是什麼意思

酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）
基本原理
1971年Engvall和Perlmann發表了酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用於IgG定量測定的文章，使得1966年開始用於抗原定位的酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法。這一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。
方法類型和操作步驟
ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。
（一）雙抗體夾心法
雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。
（2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
（3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
（4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。
（二）雙位點一步法
在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步（圖15-5）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。
（三）間接法測抗體
間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。
（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。
（3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。
（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。
（四）競爭法
競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。
（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 （3）加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。
（五）捕獲法測IgM抗體
血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：
（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。
（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
（4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。
（六）應用親和素和生物素的ELISA
親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。
親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。
ELISA 普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗. 在這種方法中, 通常標准配體是固定的, 通過加入溶液相受體或蛋白質來使之成鍵. 通過加入與受體特異性反應的抗體來定量成鍵的受體, 而且最初抗體的量以加入第二種能顯色的抗體測量. 第二種抗體能識別抗體的末端, 在其末端的鹼性磷酸酯或過氧化物酶等與酶發生反應, 從而使溶液顯色.

B. 用親和素可以檢測生物素的標記效率嗎

用親和素可以檢測生物素的標記效率
BAS-ELISA是在常規ELISA原理的基礎上，結合生物素(B)與親和素(A)間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統。生物素很易與蛋白質(如抗體等)以共價鍵結合。這樣，結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應，既起到了多級放大作用，又由於酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。
BAS用於檢測的基本方法可分為三大類。
第一類是標記親和素連接生物化大分子反應體系，稱BA法，或標記親和素生物素法(LAB)。

第二類以親和素兩端分別連接生物素化大分子反應體系和標記生物素，稱為橋聯親和素-生物素法(BRAB)。
第三類是將親和素與酶標生物素共溫形成親和素-生物素-過氧化物酶復合物，再與生物素化的抗抗體接觸時，將抗原-抗體反應體系與ABC標記體系連成一體，稱為ABC法。這一方法可以將微量抗原的信號放大成千上萬倍，以便於檢測。 親和層析是將具有特殊結構的親和分子製成固相吸附劑放置在層析柱中，當要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質就會被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質由於不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質分開，然後選用適當的洗脫液， 改變結合條件將被結合的蛋白質洗脫下來。

C. 常見的融合蛋白表達標簽有哪些呢

在重組蛋白中，常常將目的蛋白N端或C端與其他特定蛋白、多肽或寡肽標簽進行融合表達，形成既能保留天然蛋白的大部分結構，又能實現增溶，防降解，促進分泌，便於純化的功能；本文簡要介紹生物葯研發生產過程中常見的融合蛋白標簽；

一、純化標簽

His標簽

His標簽是當前最流行的標簽蛋白。His標簽是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當某一個標簽的使用，一是能構成表位利於檢測；二是構成獨特的結構特徵（結合配體）利於純化。其特點可總結為以下幾點：

1.標簽的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD，一般不影響目標蛋白的功能；2.His標簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強的蛋白得到應用，後者在純化包涵體蛋白時特別有用，用高濃度的變性劑溶解後通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復性不受其它蛋白的干擾，或進行金屬螯和親和層析復性； 3.His標簽融合蛋白也被用於蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA相互作用研究；4.His標簽免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫制備抗體；
5.可應用於多種表達系統，純化的條件溫和；
6.可以和其它的親和標簽一起構建雙親和標簽。

純化：組氨酸殘基側鏈與固態的鎳有強烈的吸引力，可用於固定化金屬螯合層析(IMAC)，對重組蛋白進行分離純化。

GST標簽

GST(谷胱甘肽巰基轉移酶) 標簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶，它的天然大小為26KD。將它應用在原核表達的原因大致有兩個，一個是因為它是一個高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一個是它可以在大腸桿菌中大量表達，起到提高表達量的作用。結合的融合蛋白在非變性條件下用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫。在大多數情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，並形成二聚體。GST標簽可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測。標簽有助於保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解並提高其穩定性。在大多數情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

純化：該表達系統表達的GST標簽蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和樹脂進行純化。GST標簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會失去對谷胱甘肽樹脂的結合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強變性劑如：鹽酸胍或尿素等。如果要去除GST融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。

MBP標簽

MBP（麥芽糖結合蛋白）標簽蛋白大小為40kDa，由大腸

桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP標簽可通過免疫分析很方便地檢測。有必要用位點專一的蛋白酶切割標簽。如果蛋白在細菌中表達，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。

純化：融合蛋白可通過交聯澱粉親和層析一步純化。結合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進行洗脫。結合親和力在微摩爾范圍。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效結合，而其他融合蛋白則不受影響。緩沖條件為pH7.0到8.5，鹽濃度可高達1M，但不能使用變性劑。如果要去除MBP融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。

FLAG標簽

FLAG標簽蛋白為8個氨基酸（DYKDDDDK）的融合多肽，同時載體中構建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。

純化：FLAG作為融合表達標簽，其通常不會與目的蛋白相互作用並且通常不會影響目的蛋白的功能、性質；融合FLAG的目的蛋白，可以直接通過FLAG進行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，並且純化效率高。FLAG還作為標簽蛋白，可以被抗FLAG的抗體識別，這樣就方便通過Western Blot、ELISA等方法對含有FLAG的融合蛋白進行檢測、鑒定。.融合在N端的FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。

Avi 標簽

AviTag標簽蛋白是一個15 個氨基酸的短肽，具有一個單生物素化賴氨酸位點，與已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目標蛋白的N端和C端。融合表達後，可被生物素連接酶生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物；

特點：1.無論在體外或者體內，幾乎所有的蛋白都可以在一個獨特的Avi Tag位點輕易且有效地被生物素化；
2.生物素化是通過酶和底物的反應來實現，反應條件相當溫和而且標記的專一性極高； 3.生物素AviTag只有15個氨基酸，對蛋白空間結構的影響非常小。

SUMO標簽

SUMO標簽蛋白是一種小分子泛素樣修飾蛋白（Small ubiquitin-likemodifier），是泛素(ubiquitin)類多肽鏈超家族的重要成員之一。在一級結構上，SUMO與泛素只有18%的同源性，然而兩者的三級結構及其生物學功能卻十分相似。研究發現SUMO可以作為重組蛋白表達的融合標簽和分子伴侶，不但可以進一步提高融合蛋白的表達量，且具有抗蛋白酶水解以及促進靶蛋白正確折疊，提高重組蛋白可溶性等功能。

Halo Tag

HaloTag標簽蛋白是一種脫鹵素酶的遺傳修飾衍生物，可與多種合成的HaloTag配基有效地共價結合。這個分子量為33KDa的單體蛋白能融合在重組蛋白的N端或C 端，並在原核和真核系統中表達。HaloTag配基是小分子化學物，能夠在體外或體內與HaloTag蛋白共價結合。

SNAP Tag

是新一代的蛋白標簽技術，不僅專一性極高而且穩定，最大的優點是適用於多種環境下的蛋白質檢測與純化，如活細胞內、溶液中、或固態相(如SDS-PAGE gels)等。
SNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）獲得。無論體內還是體外，SNAP-Tag都能與底物高特異性地共價結合，使蛋白標記上生物素或熒光基團（如熒光素和若丹明）。SNAP所帶的活性巰基位點接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側鏈苯甲基基團，釋放出了鳥嘌呤。這種新的硫醚鍵共價結合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團所帶的標記物。苯甲基鳥嘌呤在生化條件下穩定，並且沒有其他蛋白會和這類物質作用，所以SNAP標簽反應是高特異的。

純化 ：將純化的或未純化的SNAP-Tag融合蛋白與表面固定了苯甲基鳥嘌呤的基質混合，蛋白即可特異與底物作用，形成共價鍵，融合蛋白間接被固定在了基質表面上，可以達到更方便快捷地研究蛋白功能或純化蛋白的目的。

二、報告標簽

c-Myc標簽

C-Myc標簽蛋白，是一個含11個氨基酸的小標簽，標簽序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，這11個氨基酸作為抗原表位表達在不同的蛋白質框架中仍可識別其相應抗體。C-Myc tag已成功應用在 Western-blot雜交技術、免疫沉澱和流式細胞計量術中, 可用於檢測重組蛋白質在靶細胞中的表達。

HA標簽

HA標簽蛋白，標簽序列YPYDVPDYA，源於流感病毒的紅細胞凝集素表面抗原決定簇，9個氨基酸，對外源靶蛋白的空間結構影響小, 容易構建成標簽蛋白融合到N端或者C端。

常用Anti－HA抗體檢測和ELISA檢測。

熒光素酶

來源於生物體內的熒光素，常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia熒光素酶。這些熒光素酶作為「報告蛋白」被用於分子生物學研究中，這種技術被稱為報告基因檢測法或螢光素酶檢測法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白標簽不同，使用熒光素酶構建的報告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用於研究啟動子、miRNA 3'UTR克隆的功能與調控，因為它們對目的基因的調控可以是漸變的，而不是簡單的開和關兩種狀態。
優點：靈敏度高，檢測幅度寬；不是哺乳動物細胞內源性基因；重復性好；與HTS兼容等。螢火蟲和海腎熒光素酶已經被廣泛應用於協同報告並進行均一化研究。由於它們都是快速，容易和高靈敏的監測方法。而且螢火蟲和海腎熒光素酶是理想的雙基因報告系統，因為它們來源於不同的生物進化方向，蛋白結構和底物差異都很大，在實驗中不會產生相互影響。

熒游標簽蛋白

包括eGFP/eCFP/eYFP/eCherry,具有不同的激發波長發射波長，均由野生型熒光蛋白通過氨基酸突變和密碼子優化而來。就eGFP而言，相對於GFP，其熒光強度更強、熒光性質更穩定。同時載體中構建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。mCherry是從DsRed演化來的性能最好的一個單體紅色熒光蛋白，可以和GFP系列熒光蛋白共用，實現多色標記體內、外實驗表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白時，熒光蛋白活性和被融合的目標蛋白功能相互沒有明顯影響。這些熒游標簽蛋白，其融合表達目的蛋白後具有以下優點：
1.不用破碎組織細胞和不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細胞中發出綠色熒光，實時顯示目的基因的表達情況，而且熒光性質穩定，被譽為活細胞探針。
2.其自發熒光，不需用目的基因的抗體或原位雜交技術就可推知目的基因在細胞中的定位等情況。
3.同時細胞內的其它產物不會干擾標簽蛋白檢測，從而使其檢測更顯得快速、簡便、靈敏度高而且重現性。
4.其低消耗、高靈敏度檢測，十分適用於高通量的葯物篩選。因此現eGFP 表達標簽被廣泛地應用於基團表達調控、轉基因功能研究、蛋白在細胞中的功能定位、遷移變化及葯物篩選等方面。
5.mCherry紅色熒光蛋白在標記病毒顆粒，研究病毒和宿主細胞之間更有得天獨厚的優勢。如用mRFP或mCherry標記HIV病毒顆粒，研究HIV和宿主細胞問的相互作用以及HIV侵染宿主細胞的過程．用mRFP標記慢病毒顆粒，研究慢病毒在小鼠體內的復制過程等。

D. 生物素化抗體

在做western blot或免疫組化時我們常使用一抗二抗來放大、顯示抗原，用酶或熒游標記二抗。生物素化的抗體，是在抗體上連接生物素（biotin），生物素能和親和素（avitin）特異性高親和性結合，親和力是抗原抗體結合的一萬倍，而且一個avitin可以結合四個biotin，這樣又起到級聯放大的作用。所以能更加靈敏的顯示微量抗原。這種方法也叫親和免疫組化。

E. 什麼是生物素化的DNA

就是用生物素標記的DNA，可用來作探針

F. repeat-associated small RNAs是什麼意思,

研究發現，部分small RNA來源於高重復區域或轉座子區，它們會與不同的Argonaute蛋白結合並且參與一些重要的生物學過程，例如DNA甲基化和轉座子的調控。這些small RNA被稱作重復序列相關的small RNA (repeat-associated small RNAs)。