如何提高微生物原生質體融合率

『壹』 微生物原生質體融合的主要步驟

用PEG或仙台病毒就可以了.

『貳』 微生物通過原生質體融合技術的處理後會怎樣

微生物的細胞融合，需要先將細胞壁溶解後，由原生質體進行融合。在微生物中，通過原生質體融合技術的處理可以培育出新的菌種。一些具有親代雙重有用特性的優良菌株已經培育成功，如生產葯用的鏈黴素新菌種，發酵和糖化性能齊備的酵母新菌種等。

『叄』 用原生質體融合法進行微生物育種有何優點

可以增加基因組結構的多樣性，比單體繁殖更有適應性。

『肆』 簡述原生質體融合技術微生物育種有哪些新思路

基因組重排技術(genome shuffling)技術的概念,基因組重排技術是經典微生物誘變育種技術與原生質體融合技術的有機結合。
首先對微生物菌體進行誘變,篩選出正向突變菌株,然後通過原生質體󰀂遞推式融合 使正向突變的若干個菌株進行原生質體融合,篩選出符合育種要求的融合子,從而在短時間內獲得性狀得到大幅度提高的菌株

『伍』 想做微生物的原生質體融合，革蘭氏陰性，求相關的高IF英文文獻，THX

陰性是好的

『陸』 微生物原生質體融合技術的的路線

當兩個細胞的細胞膜密切接觸，在一定條件下促使細胞膜發生變化，導致細胞互相合並，這就是細胞融合，又稱體細胞雜交。這樣產生的雜種細胞兼有兩個親本的遺傳物質，通過組織培養就能產生雜種個體或雜種細胞群。自然界的受精作用事實上就是雌雄生殖細胞的細胞融合的實例。

原生質融合法，即利用電壓穿孔或溫和化學溶解處理，讓欲改造的細胞及攜帶有外源基因的細胞表面，產生一些暫時性的孔疏現象，然後再讓它們緊密地依偎在一起，相互交換遺傳物質，便達到改造目的。

『柒』 原生質體融合的高pH—高鈣法是怎樣做的

高pH—高鈣法是受動物細胞融合研究的啟發而產生的。用pH9.510.5、大於0.03molL濃度的Casuperscript2+superscript溶液處理原生質體，融合效果較好。高pH能導致質膜表面離子特性的改變，增加了質膜的流動性，有利於原生質體的融合。鈣能穩定原生質體，也起聯系融合的作用。

具體處理方法是：在原生質體沉澱中加入含有0.05molL：CaClsubscript2subscript·2Hsubscript2subscriptO和0.4molL甘露醇，pH調整到10.5，在37攝氏度下保溫0.5h，可使原生質體融合率達到10%左右。

『捌』 原生質體融合的步驟

原生質體融合的程序包括：①標記菌株的篩選；②原生質體的制備和再生（過程見8.1.1）；③原生質體的融合；④融合子遺傳標記的篩選；⑤融合子的鑒定。

8.2.2.1 標記菌株的篩選

進行原生質體融合的親本需要攜帶遺傳標記，以便於融合後重組子的篩選。常用營養缺陷型和抗性作為遺傳標記，也可以採用熱致死、孢子顏色、菌落形態作為遺傳標記。遺傳標記的選擇要根據實際實驗目的來確定。如果原生質體融合的目的是進行遺傳分析，那麼應該採用帶有隱性基因的營養缺陷型或抗性菌株；如果從育種角度進行原生質體融合，由於大多數營養缺陷型菌株都會影響代謝產物的產量，所以在選擇營養缺陷型標記時，應盡量避免採用對正常代謝有影響的缺陷型菌株。

8.2.2.2 原生質體的融合

原生質體融合就是把親株的原生質體在高滲條件下進行混合。在原生質體融合中，誘導融合的方法主要有化學法（PEG促融法）、物理法（包括電融合和激光誘導融合法等）。

僅僅將原生質體等量地混合在一起融合頻率通常是很低的，只有通過加入融合劑例如表面活性劑聚乙二醇（PEG）或特定物理措施例如電擊和激光誘導等，融合頻率才會提高。

（1）PEG促融法：其誘導融合的可能機制是PEG帶有負電荷的醚鍵，與帶負電荷的原生質體相遇後，在Ca²⁺等陽離子作用下形成共同的靜電荷，從而促進異源原生質體的黏著和接合，常用的PEG是相對分子量為4000和6000的兩種。在有鈣離子存在的條件下融合時為鹼性能刺激產生最大的融合頻率，這是因為pH值能夠改變體系的電性狀態，從而影響原生質體的融合。PEG既是融合劑又是滲透壓穩定劑，濃度低於20%會使原生質體破裂而失去穩定性，濃度過高又會引起原生質體收縮而降低融合頻率，因此，融合時PEG的最終濃度常採用30%～40%。由於PEG的加入，原生質體間的黏著強烈地發生，融合就能較長時間有效地進行，所以PEG的處理時間不得太長。此外，PEG在高濃度下有毒，因此也要求融合時間不宜過長。

（2）電融合法：其原理是在短時間強電場的作用下，當原生質體被置於電導率很低的溶液中時，電場通電後，電流即通過原生質體，使原生質體在電場作用下極化而產生偶極子，從而使原生質體緊密接觸排列成串，原生質體成串排列後，立即給予高頻直流脈沖，細胞膜發生可逆性電擊穿，瞬時失去其高電阻和低通透性，然後在數分鍾內恢復原狀。當可逆電擊穿發生在兩個相鄰細胞的接觸區時，即可誘導它們的膜相互融合，從而導致細胞融合。電融合是以空間定向，時間同步的可控方式來實現原生質體的融合，從而改變了PEG融合的隨機過程。該法的優點是融合頻率高，無化學毒性，操作簡便，可在顯微鏡下進行，具有極強的可操控性。

（3）激光融合法：其原理是先讓細胞或原生質體緊密貼在一起，再用高峰值功率密度激光照射接觸處，從而使質膜擊穿或產生微米級的微孔，質膜上產生微孔是一個可逆的過程，質膜恢復的過程中細胞連接微孔的表面曲率很高，使細胞處於高張力狀態，此時細胞由啞鈴形逐漸變為圓球狀，進而細胞發生融合。該法的優點是毒性小，損傷小，具高度選擇性；缺點是操作技術難度大，所需設備昂貴復雜，因此很難被推廣應用。

8.2.2.3 融合子遺傳標記的篩選

原生質體融合後，融合子的選擇方法是使原生質體融合技術得以應用的關鍵。以A和B細胞融合來說，可能會形成AA，AB及BB 三種融合形式。而要篩選出的是AB，即具有A細胞核B細胞的兩個遺傳標記就可以確定其為融合子。因此，就可以通過A和B細胞所分別具有的選擇性遺傳標記，在選擇培養基上挑出融合子。但是，由於原生質體融合後會產生兩種情況，一種是真正的融合，即產生雜合二倍體或單倍重組體；另一種是暫時的融合，形成異核體。兩者均可以在選擇培養基上生長，一般前者較穩定，而後者則是不穩定的，會分離成親本類型，有的甚至可以以異核狀態轉接幾代。因此，要獲得真正的融合子，必須在融合原生質體再生後，進行幾代自然分離、選擇，才能加以確定。融合子的篩選是融合過程的關鍵。下面列舉幾種常見的篩選方法。營養缺陷型標記篩選融合子、抗葯性標記篩選融合子、熒光色素標記篩選融合子、滅活原生質體標記篩選融合子、利用雙親對碳源利用不同而篩選融合子和利用某些特殊生理特徵作為標記篩選融合子等方法篩選。

8.2.2.4 融合子的鑒定

融合子篩選出後，還要對其進行鑒定。常用的鑒定方法有菌體或孢子形態、大小的比較，同工酶電泳譜帶的比較，酶活性的測定，DNA含量的比較，對結構蛋白及非基因直接編碼的次生代謝產物的分析，對染色體穩定性的研究等。劉玲等（2007）採用酯酶同工酶電泳對f1和f2融合子進行鑒定，融合子有不同於親本的新酶帶出現，融合子菌落呈現新的性狀，菌落形態、顏色、菌絲形狀都與親本部分性狀相似，又存在差異，並且菌株生長速度也不同於雙親本，在生理生化性狀上與親本存在明顯的差異，這說明融合子f1、f2是融合雙親性狀的新菌株。

『玖』 細菌原生質融合的資料！急求！

一、目的要求
了解原生質體融合技術的原理。
學習並掌握以細菌為材料的原生質體融合技術。

二、基本原理
原核微生物基因重組主要可通過轉化、轉導、接合等途徑，但有些微生物不適於採用這些途徑，從而使育種工作受到一定的限制。1978 年第三屆國際工業微生物遺傳學討論會上，有人提出微生物細胞原生質體融合這一新的基因重組手段。由於它具有許多特殊優點，所以，目前已為國內外微生物育種工作所廣泛研究和應用。
(一) 原生質體融合的優點
(1) 克服種屬間雜交的「不育性」，可以進行遠緣雜交。由於用酶解除去細胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同種屬間的微生物，皆可發生原生質體融合，產生重組子。
(2) 基因重組頻率高，重組類型多。原生質體融合時，由於聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使細胞相互聚集，可以提高基因重組率。原生質體融合後，兩個親株的整套基因組 (包括細胞核、細胞質)相互接觸，發生多位點的交換，從而產生各種各樣的基因組合，獲得多種類型的重組子。
(3) 可將由其他育種方法獲得的優良性狀，經原生質體融合而組合到一個菌株中。
(4) 存在著兩個以上親株同時參與融合，可形成多種性狀的融合子。
(二) 原生質體融合步驟
(1) 選擇親本 選擇兩個具有育種價值並帶有選擇性遺傳標記的菌株作為親本。
(2) 制備原生質體 經溶菌酶除去細胞壁，釋放出原生質體，並置高滲液中維持其穩定。
(3) 促融合 聚乙二醇加入到原生質體以促進融合。聚乙二醇為一種表面活性劑，能強制性的促進原生質體融合。在有Ca2+ 、Mg2+離子存在時，更能促進融合。
(4) 原生質體再生 原生質體已失去細胞壁，雖有生物活性，但在普通培養基上不生長，必須塗布在再生培養基上，使之再生。
(5) 檢出融合子 利用選擇培養基上的遺傳標記，確定是否為融合子。
(6) 融合子篩選 產生的融合子中可能有雜合雙倍體和單倍重組體不同的類型，前者性能不穩定，要選出性能穩定的單倍重組體，反復篩選出生產性能良好的融合子。
(三) 原生質體再生率和融合率計算

三、實驗材料
(一) 菌種
枯草芽孢桿菌T4412 ade- his-、枯草芽孢桿菌TT2 ade-pro-
(二) 培養基(見附錄)
(1) 完全培養基(CM，液體)；
(2) 完全培養基(CM，固體) 液體培養基中加入2.0%瓊脂；
(3) 基本培養基(MM)；
(4) 補充基本培養基(SM) 在基本培養基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的純化瓊脂，75 Pa 滅菌20min；
(5) 再生補充基本培養基(SMR) 在補充基本培養基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％純化瓊脂作上層平板，2.0％純化瓊脂作底層平板、75 Pa 滅菌20 min。
(6) 酪蛋白培養基(測蛋白酶活性用)。
(三) 緩沖液
(1) 0.1mol/L pH 6.0 磷酸緩沖液。
(2) 高滲緩沖液：於上述緩沖液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
(四) 原生質體穩定液(SMM)
0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 順丁烯二酸，調pH 6.5。
(五) 促融合劑
40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液。
(六) 溶菌酶液
酶粉酶活為4000 u/g，用SMM 溶液配製，終濃度為2 mg/mL，過濾除菌備用。
(七)器皿
培養皿、移液管、試管、容量瓶、錐形瓶、燒杯、離心管、吸管、顯微鏡、台式離心機、721 比色計、細菌過濾器