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生物素化標記的抗體用什麼檢測

發布時間:2022-11-16 17:44:42

⑴ 免疫檢測方法

免疫檢測方法大全2017

免疫學檢測技術的用途非常廣泛,它們可用於有關免疫疾病的診斷、療效評價及發病機制的研究。如對傳染病、免疫增殖性疾病、免疫缺損病、超敏反應、自身免疫病、移植排斥反應腫瘤的免疫學檢測,對診斷、治療均有很大幫助。此外在醫學生物學研究中對抗原性物質或細胞的定性、定量檢查不僅推動了對各種免疫學現象的研究,而且擴大免疫學與醫學生物許多領域的聯系。本章僅介紹常用免疫學檢測方法的原理,簡要過程和實用意義。下面是我為大家帶來的關於免疫學檢測法的知識,歡迎閱讀。

第一節抗原或抗體的檢測

一、檢測的原理

藉助抗原和抗體在體外特異結合後出現的各種現象,對樣品中的抗原或抗體進行定性、定量、定位的檢測。

1.抗原與抗體的親和力(affinity)抗原抗體的結合就像酶與底物的結合,激素與其受體的結合一樣不是化學的反應,而是非共價鍵的可逆的結合。抗原決定簇和抗體分子可變區互補構型,造成兩分子間有較強的親和力。空間構型互補程度不同,抗原和抗體分子之間結合力強弱也不同。互補程度高,則親和力強。此外,反應溫度、酸鹼度和離子濃度對抗原和抗體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重要的影響,抗體與抗原決定簇之間的結合力大小可用親合力來表示。高親合力的抗體與抗原的結合力強,即使抗原濃度很低時也有較多的抗體結合抗原形成免疫復合物。

2.抗原或抗體外檢測原理根據抗原抗體結合形成免疫復合物的性狀與活性特點,對標本中的抗原或抗體進行定性、定位或定量的檢測。定性和定位檢測比較簡單,即用已知的抗體和待檢樣品混合,經過一段時間,若有免疫復合物形成的現象發生,就說明待檢樣品中有相應的抗原存在。若無預期的現象發生,則說明樣品中無相應的抗原存在。同理也可用已知的抗原檢測樣品中是否有相應抗體。

對抗原或抗體進行定量檢測時,以反應中加入抗原和抗體的濃度與形成免疫復物的濃度呈函數關系。

(1)根據免疫復合物產生的多少來推算樣品中抗原(或抗體)的含量:在一定的反應條件下,加入的已知抗體(或抗原)的濃度一定,反應產生的免疫復合物多少與待檢樣品中含有相應抗原(或抗體)量成正比。也就是抗體濃度一定時,免疫復合物越多則樣品中的抗原量也越多。可用實驗性標准曲線推算出樣品中抗原(或抗體)的含量。如免疫單向擴散試驗、免疫比濁試驗和酶聯免疫檢測等都屬於這類方法。

(2)抗原或抗體效價滴定的原理:當抗原抗體復合物形成多少不能反應抗原抗體反應強弱時,就不能以檢測反應強度來對抗原或抗體進行定量。在實際工作中,把濃度低的反應成分(抗原或抗體)的濃度固定,把濃度高的另一種反應成分作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫3隻家兔,比較3隻家兔產生抗體的多少,即滴定3隻兔血清抗體效價,可用雙向瓊脂擴散法來滴定,例如將抗體濃度固定,將抗原作不同的稀釋度,分別將抗原或抗體滴入瓊脂的相應小孔中,觀察免疫兔血清與不同稀釋度的抗原出現明顯沉澱淺的抗原稀釋度(如甲兔的抗體效價為1/2000,而丙免的是1/8000則可比較出後者比前者產生抗體的效價要高)。也就是表示效價的稀釋度越高,樣品中所含待檢成分越多。因人血清(抗原)和抗體(免疫兔血清)相比,濃度高,故應稀釋抗原。

二、抗原或抗體檢測的實用意義

1.抗體檢測的意義檢測抗體可用於評價人和動物免疫功能的指標。抗體用於臨床治療或實驗研究時也需做純度分析和定量測定。臨床上檢測病人的抗病原生物的抗體、抗過敏原的抗體、抗HLA抗原的抗體、血型抗體及各種自身抗體,對有關疾病的診斷有重要意義。

2.抗原檢測的意義可做為抗原進行檢測的物質可分為以下四類:

(1)各種微生物及其大分子產物:用於傳染病診斷、微生物的分類及鑒定以及對菌苗、疫苗的研究。

(2)生物體內各種大分子物質:包括各種血清蛋白(如各類免疫球蛋白、補體的各種成分)、可溶性血型物質、多肽類激素、細胞因子及癌胚抗原等均可做為抗原進行檢測。在對這些成分的生物學作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意義。

(3)人和動物細胞的表面分子:包括細胞表面各種分化抗原(如CD抗原)、同種異型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相關抗原和腫瘤相關性情抗原等。檢測這些抗原對各種細胞的分類、分化過程及功能研究、對各種與免疫有關的疾病的診斷及發病機制的研究,均有重要意義。

(4)各種半抗原物質:某些葯物、激素和炎症介質等屬於小分子的半抗原,可以分別將它們偶聯到大分子的載體上,組成人工結合的完全抗原。用其免疫動物,制備出各種半抗原的抗體,應用於各種半抗原物質的檢測,例如對某些病人在服用葯物後進行血中葯物濃度的監測。對運動員進行服用違禁葯品的檢測,都是應用半抗原檢測的方法。

三、抗原或抗體檢測的方法

由於各種檢測方法中所用的抗原性狀不同,出現結果的現象也不同。最廣泛應用方法有下述幾種:

(一)沉澱反應

可溶性抗原與抗體結合,在兩者比例合適時,可形成較大的不溶性免疫復合物。在反應體系中出現不透明的沉澱物,這種抗原抗體反應稱為沉澱反應(precipitation neaction)。

1.環狀沉澱試驗先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小於0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊於上,讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇,形成白色免疫復合物沉澱環,故名為環狀沉澱試驗(ring precipitationtest),此法簡便易行,需用材料較多是其缺點。

2.單向免疫擴散試驗單向免疫擴散試驗(single immunodiffusion)是在凝膠中進行的沉澱反應。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中,傾注於玻片上,製成含有抗體的瓊脂板,在適當位置打孔,將抗原材料加入瓊脂板的小孔內,讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴散,與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復合物。當復合物體積增加到一定程度時停止擴散,出現以小孔為中心的圓形沉澱圈,沉澱圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關。本方法簡便,易於觀察結果,可測定抗原的靈敏度(最低濃度)約為10~20μg/ml,常用於定量測定人或動物血清IgG、IgM、IgA和C3等,其缺點是需1~2天才能看結果

3.免疫比濁法 當抗體濃度高,加入少量可溶性抗原,即可形成一些肉眼看不見的小免疫復合物,它可使通過液體的光束發生散射,隨著加入抗原增多,形成的免疫復合物也增多,光散射現象也相應加強。免疫比濁法(immunonephelomytry)就是在一定的抗體濃度下,加入一定體積的樣品,經過一段時間,用光散射濁度計(nephelometry)測量反應液體的濁度,來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便,可取代單向擴散法定量測定免疫球蛋白的濃度。

4,雙向免疫擴散試驗 雙免疫擴散試驗(double immunodiffusion)是在瓊脂板上按一定距離打數個小孔,在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散,在兩孔間可出現2~3條沉澱線,本法常用於抗原或抗體的定性或定量檢測,或用於兩種抗原材料的抗原相關性分析。

5.對流免疫電泳對流電泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快速的檢測方法,即在電場作用下的雙向免疫擴散。將瓊脂板放入電泳槽內,使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向,於負極側的孔內加入抗原,於正極側的孔內加入抗體,通電後,抗原帶負電荷向正極泳動,抗體分子雖也帶負電荷,但因分子量大,向正極的位移小,而受瓊脂中電滲作用向負極移動,抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復合物的沉澱線。只需1小時左右即可觀察結果。

6.免疫電泳 免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個步驟,即先進行電泳,再進行瓊脂擴散。先將樣品加入瓊脂中電泳,將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然後在適當的位置上沿電泳方向挖一直線形槽,於槽內加入含有針對各種抗原混合抗體液,讓各抗原成分與相應抗體進行雙向免疫擴散,可形成多答卷沉澱線。常用此法進行血清的蛋白種類分析。對於免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義

7.免疫印跡法免疫印跡法(immunoblotting)又稱為Western印跡法,用於AIDS的血清抗體檢測。第一步,為電泳分離HIV抗原,在電場中根據分子量大小不同病毒抗原各成分散開。第二步,將電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維膜上(電印跡),然後將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕於病人血清中。如果病人血清中含有與一種或幾種抗原相對應的抗體的話,則在該抗原印跡部位形成免疫復合物沉澱。在洗去未沉澱的抗原和抗體後,在膜上加標記的抗人免疫球蛋白的抗體,此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復合物發生反應,最後加入顯色底物(如果抗人Ig是用酶標記的)或做放射自顯影(抗人Ig用125Ⅰ標記)以顯示結果

第一步:經電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離;

第二步:將已分離的抗原經電印跡轉移到硝酸纖維膜上;

第三步:將待檢病人血清加入覆蓋於硝酸纖維膜上;

第四步:加入標記的第二抗體使之覆蓋膜上;

第五步:加入顯色底物(或放射自顯影)顯現第二抗體

(二)凝集反應

細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆粒抗原,當與相應抗體結合,抗原與抗體結合形成凝集團塊,即稱為凝集反應(agglutination)。

1.直接凝集 直接凝集(direct agglutination)是將細菌或紅細胞與相應抗體結合產生的細菌凝集或紅細胞凝集現象。可用於傳染病診斷如肥達氏反應(Widal reaction)診斷傷寒病。或利用血細胞凝集現象檢查血型。

2.間接凝集 間接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳膠顆粒或紅細胞表面,與相應抗體混合出現的凝集現象。如用γ球蛋白包乳膠顆粒檢測類風濕關節炎病人血清中的類風濕因子,用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用於檢測甲狀腺球蛋的抗體。也可以將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標本中的抗原,如細菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆粒,一旦與含有相應抗原的腦脊液混合,便可發生凝集,可進行快速診斷。故凝集反應即可測定抗原,也可測抗體,方法簡便、敏感。

3.抗球蛋白試驗 抗球蛋白試驗(antiglobulin test,coombs test)的原理為間接凝集試驗。例如應用於診斷自身免疫溶血性貧血症時,Rh+紅細胞與抗Rh血清間的反應。因抗Rh抗體是IgG只有兩個結合價,分子較小(不如IgM結合價多,分子大)很難直接引起Rh+紅細胞凝集。如果加入抗IgG的抗體,就可幫助抗Rh的IgG的抗體凝集紅細胞。也就是經抗Ig的作用提高凝集反應的'靈敏度。

(三)補體參與抗原抗體反應

這一類反應主要包括溶血反應(hemolytic assay)、補體介導的細胞毒試驗(complement mediated cytotoxicuty test)及補體結合試驗(complement fixation test)。

1.溶血反應 抗體與紅細胞表面抗原相遇,形成紅細胞-抗體復合物即可使加入反應中的補體活化,導致紅細胞溶解,此方法可用於紅細胞的各種抗原或相應抗體的檢測,此法比凝集反應敏感。溶血反應也是用於抗體分泌細胞即空斑形成細胞(PFC)檢測的原理。

2.補體介導的細胞毒試驗各種有核細胞與針對其表面抗原的抗體相遇,所形成的免疫復合物能活化反應中的補體,引起細胞膜穿孔,在一定時間內,細胞仍能維持一定的形態不破碎,加入水溶性染如伊紅Y(eosin Y)或台盼藍(trypan blue)後,染料即可進入被活化補體穿孔的細胞,不帶相應抗原細胞膜保持完整的活細胞不著色。此方法可用於帶各種抗原的細胞的檢測,如進行細胞MHC抗原的鑒定,和進行淋巴細胞中T細胞總數或其亞類的計數。在一些免疫學實驗中也可用這種方法,根據需要特異地消除帶某種抗原的細胞。

3.補體結合試驗當抗原(可溶性或顆粒性)與相應抗體結合,由於濃度低不出現可見反應時,應用補體結合試驗可檢出此抗原抗體反應,它比凝集反應或沉澱反應靈敏度高。本法包括兩個抗原抗體系統。一為檢測系統由待檢樣品與已知抗原(或抗體)組成;另一為指示系統,由綿羊紅細胞(SRBC)和抗SRBC組成。另加入作為補體的新鮮豚鼠血清。試驗時試管中先加入檢測系統和補體,混合經37℃30分鍾使抗原、抗體、補體形成復合物,再加入指示系統,如出現溶血現象,說明檢測系統中沒有相對應的抗原抗體,補體是游離的指示系統的SRBC和抗體結合而出現溶血,即為反應陰性。如不出現溶血,表明檢測系統中有抗原抗體復合物並結合補體,則指示系統無多餘的補體作用而沒有溶血現象,即為陽性。

在敏感的抗原、抗體檢測方法(如酶標方法)出現之前補體結合試驗曾廣泛用於檢測各種細菌、病毒或螺旋體(如梅毒)的抗原或抗體,由於本試驗影響因素多,結果不穩定現已被新檢測方法所代替。

四、用標記抗體或抗原進行的抗原、抗體反應

用熒光素、同位素或酶標記抗體或抗原,用於抗原或抗體檢測是目前廣泛應用的敏感、可靠的方法。上述三種常用的標記物與抗原或抗體化學連接之後不改變後者的免疫特性。本方法可用於定性、定量或定位檢測。

1.免疫熒光技術免疫熒光技術(immunofluorescence techni)是用化學方法使熒光素標記的抗體(或抗原)與組織或細胞中的相應抗原(或抗體)結合,進行定性定位檢查抗原或抗體的方法。

(1)直接熒光法:把熒光抗體加到待檢的細胞懸液,細胞塗片或組織切片上進行染色,經抗原抗體反應後,洗去未結合的熒光抗體,將待檢標本在熒光顯微鏡下觀察,有熒光的部位即有相應抗原存在,此法可用於病毒感染細胞、帶某種特異抗原的細胞(如T細胞和B細胞)或病原菌的檢查,也可用於組織中沉著的免疫復合物的檢查。本法的缺點是檢查多種抗原,就需分別制備相應的多種標記抗體。

(2)間接熒光法:可克服直接法需制備多種熒光抗體的復雜操作。將組織或細胞上的抗原直接與相應抗體(不標記熒光)結合,此為第一抗體,再把能與第一抗體特異結合的熒游標記的抗免疫球蛋白抗體加入,此為熒游標記的第二抗體,觀察結果與直接法相同。間接法比直接法敏感性高,如果用於檢查抗原的第一抗體是人或動物的只需制備一種抗人或動物的免疫球蛋白熒光抗體

免疫熒光技術在傳染病診斷上有廣泛的用途,如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病,檢查抗原或抗體,如查出IgM抗體,可做為近期接觸抗原的標志,所以使用熒游標記抗IgM可診斷近期感染。除微生物學方面的應用外,還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細胞的亞類。使用流式細胞儀(fluorescene-activated cell sorting,FACS),能自動檢測細胞的大小、熒光強度。針對細胞表面不同抗原,可以使用兩種不同的熒光染料,如用異硫氰熒光素(FITC)發黃綠熒光,用羅丹明(TMRITC)發紅色熒光。由於熒光顏色不同標記兩種不同的抗體,對同一細胞進行雙標記染色。對淋巴細胞亞類鑒定起著巨大推動作用。應用間接熒光法也用於自身免疫病的抗核抗體檢查。

2.放射免疫分析法 放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)應用競爭性結合的原理,應作放射性同素標記抗原(或抗體)與相應抗體(或抗原)結合,通過測定抗原抗體結合物的放射活性判斷結果,本方法可進行超微量分析,敏感性高,可用於測定抗原、抗體、抗原抗體復合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。

放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種:

(1)液相法:將待檢標本(例如含胰島素抗原)與定時的同位素標記的胰島素(抗原)和定時的抗胰島素抗體混合,經一定作用時間後,分離收集抗原抗體復合物及游離的抗原,測定這兩部分的放射活性,計算結合率。在反應系統中,待檢標本的胰島素抗原與同位素標記的胰島素競爭奪戰性與胰島素抗體結合。非標記的抗原越多,標記抗原與抗體形成的復合物越少。非標記抗原含量與標記抗原抗體復合物的量呈一定的函數關系。預先用標準的非標記抗原作成標准曲線後,即可查出待檢標本中胰島素的含量

(2)固相法:將抗原或抗體吸附到固相載體表面,然後加待檢標本,最後加標記抗體。測定固相載體的放射活性,常用的固相載體有溴化氰(CNBr)海豹化的紙片或聚苯乙烯小管

放射免疫分析法應用范圍廣泛,包括多種激素(胰島素、生長激素、甲狀腺素等)維生素、葯物、IgE等。

3.酶聯免疫分析法 酶聯免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)是當前應用最廣泛的免疫檢測方法。本法將抗原抗體反應的特異性與酶對底物高效催化作用結合起來,根據酶作用底物後顯色,以顏色變化判斷試驗結果,可經酶標測定儀作定量分析,敏感度可達ng水平。常用於標記的酶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酶(alkaline phosphatase)等。它們與抗體結合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩定性,製成酶標抗體可保存較長時間。目前常用的方法有酶標免疫組化法和酶聯免疫吸附法。前者測定細胞表面抗原或組織內的抗原;後者主要測定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測試儀器,所以較放射免疫分析法更易推廣。

(1)酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是與上述固相RIA相似的原理,將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行政區。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。

(2)夾心法(sandwich assay):將已知的特異抗體包裝在固相載體(塑料板凹孔或紙片上),加入待檢標本,標本中的抗原即可與載體上的抗原結合,洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體,洗去未結合的酶標抗體,加底物顯色,用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度,可定量測定抗原。

間接法(indirecr ELISA)常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體,加入待檢標本(可能含有相應抗體),再加入酶標抗Ig的抗全(即第二抗體),經加底物顯色後,根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。

(3)BAS-ELISA:近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑,組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素(avidin)分子可以結合4個生物素分子(biotin)。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合,而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子,通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統(biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA),它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統,同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。

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⑵ 生物素化羊抗小鼠IgG工作原理

免疫組化檢測小鼠組織抗原表達情況時,採用免疫組化用純化抗體(小鼠)進行抗原抗體反應,純化小鼠抗體通常有多個表位,除去和抗原反應的表位外,還可以有一個表位結合羊抗小鼠IgG,在羊抗小鼠IgG上面連上生物素,可以通過SABC法進行生物素顯色,根據顯色情況來判斷抗原的表達水平,屬於間接檢測法。該方法比較靈敏,但是實驗過程條件太多,容易出現假陽性……

⑶ 酶聯免疫法的檢測方法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法,操作步驟如下:
一、將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結合的抗體及雜質。
二、加受檢標本:使之與固相抗體接觸反應一段時間,讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合,形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
三、加酶標抗體:使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
四、加底物:夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物,即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。
在臨床檢驗中,此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體,一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應,作一步法檢測。
在一步法測定中,當標本中受檢抗原的含量很高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,而不再形成夾心復合物。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象,此時反應後顯色的吸光值(位於抗原過剩帶上)與標准曲線(位於抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同,如按常法測讀,所得結果將低於實際的含量,這種現象被稱為鉤狀效應(hook effect),因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時,反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時,應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇,例如HBsAg的a決定簇,也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型,顯然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性,這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子(RF)的干擾。RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF,它可充當抗原成份,同時與固相抗體和酶標抗體結合,表現出假陽性反應。採用F(ab')或Fab片段作酶結合物的試劑,由於去除了Fc段,從而可消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類試劑的一項考核指標(參見6.2)。
雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能形成兩位點夾心。
雙抗原夾心法測抗體
反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物,以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋,可直接用於測定,因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備,應根據抗原結構的不同,尋找合適的標記方法。 在雙抗體夾心法測定抗原時,如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體,則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作,縮短了反應時間,如應用高親和力的單克隆抗體,測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中,應注意鉤狀效應(hookeffect),類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,而不再形成夾心復合物,所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。 間接法是檢測抗體最常用的方法,其原理為利用酶標記的抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下:
⑴將特異性抗原與固相載體連接,形成固相抗原:洗滌除去未結合的抗原及雜質。
⑵加稀釋的受檢血清:其中的特異抗體與抗原結合,形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後,固相載體上只留下特異性抗體。其他抗體及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合,在洗滌過程中被洗去。
⑶加酶標抗抗體:與固相復合物中的抗體結合,從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後,固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體,可用酶標羊抗人IgG抗體。
⑷加底物顯色:顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果,但應盡可能予以純化,以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質,例如以E.Coli為工程酶的重組抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能與受過E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質,例如來自人血漿或人體組織的抗原,如不將其中的Ig去除,試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白,也會因競爭吸附而影響包被效果。
間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強,非特異IgG可直接吸附到固相載體上,有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中,抗原包被後一般用無關蛋白質(例如牛血清蛋白)再包被一次,以封閉(blocking)固相上的空餘間隙。另外,在檢測過程中標本須先行稀釋(1:40~1:200),以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。 競爭法可用於測定抗原,也可用於測定抗體。以測定抗原為例,受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合,因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下:
⑴將特異抗體與固相載體連接,形成固相抗體。洗滌。
⑵待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液,使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原,則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原,則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合,競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會,使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原,保溫後,酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。
⑶加底物顯色:參考管中由於結合的酶標抗原最多,故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差,代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡,表示標本中抗原含量越多。一般情況,是通過方波伏安法,檢測培養體系的峰電流,通過峰電流與抗原抗體的線性關系來最終確定體系的最終檢測目標的濃度。
當抗原材料中的干擾物質不易除去,或不易得到足夠的純化抗原時,可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多,結合在固相上的酶標抗體愈少,因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純度的,可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質,直接包被不易成功,可採用捕獲包被法,即先包被與固相抗原相應的抗體,然後加入抗原,形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質,然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式,可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合,抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合,洗滌後再加入酶標抗體,與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在,後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法,先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上,在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下:
⑴將抗人IgM抗體連接在固相載體上,形成固相抗人IgM。洗滌。
⑵加入稀釋的血清標本:保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
⑶加入特異性抗原試劑:它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
⑷加入針對特異性的酶標抗體:使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
⑸加底物顯色:如有顏色顯示,則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在,是為陽性反應。 親和素是一種糖蛋白,可由蛋清中提取。分子量60kD,每個分子由4個亞基組成,可以和4個生物素分子親密結合。維生素H,分子量244.31,存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物,生物素-羥基琥珀亞胺酯(biotin-hydroxysuccinimide,BNHS)可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合,雖不屬免疫反應,但特異性強,親和力大,兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置,可以連接更多的生物素化的分子,形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來,就可大提高ELISA的敏感度。
親和素-生物素系統在ELISA中的應用有多種形式,可用於間接包被,亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素,原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合,通過親和素-生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量,而且使其結合點充分暴露。另外,在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代,然後連接親和素-酶結合物,以放大反應信號。 在臨床檢驗中一般採用商品試劑盒進行測定。ELISA中有三個必要的試劑:免疫吸附劑、結合物和酶的底物等。完整的ELISA試劑盒包含以下各組分:
⑴已包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑);⑵酶標記的抗原或抗體(結合物);
⑶酶的底物;
⑷陰性對照品和陽性對照品(定性測定中),參考標准品和控制血清(定量測定中);
⑸酶聯物(結合物)及標本的稀釋液;
⑹洗滌液;
⑺酶反應終止液。

⑷ 用親和素可以檢測生物素的標記效率嗎

用親和素可以檢測生物素的標記效率
BAS-ELISA是在常規ELISA原理的基礎上,結合生物素(B)與親和素(A)間的高度放大作用,而建立的一種檢測系統。生物素很易與蛋白質(如抗體等)以共價鍵結合。這樣,結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應,既起到了多級放大作用,又由於酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色,達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。
BAS用於檢測的基本方法可分為三大類。
第一類是標記親和素連接生物化大分子反應體系,稱BA法,或標記親和素生物素法(LAB)。

第二類以親和素兩端分別連接生物素化大分子反應體系和標記生物素,稱為橋聯親和素-生物素法(BRAB)。
第三類是將親和素與酶標生物素共溫形成親和素-生物素-過氧化物酶復合物,再與生物素化的抗抗體接觸時,將抗原-抗體反應體系與ABC標記體系連成一體,稱為ABC法。這一方法可以將微量抗原的信號放大成千上萬倍,以便於檢測。 親和層析是將具有特殊結構的親和分子製成固相吸附劑放置在層析柱中,當要被分離的蛋白混合液通過層析柱時,與吸附劑具有親和能力的蛋白質就會被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質由於不被吸附,直接流出,從而與被分離的蛋白質分開,然後選用適當的洗脫液, 改變結合條件將被結合的蛋白質洗脫下來。

⑸ 酶聯免疫吸附測定的方法類型和操作步驟

ELISA可用於測定抗原,也可用於測定抗體。該法適於測定細胞培養上清、血清、血漿及組織液中的樣本,干擾小可以測到每毫升納克水平的細胞因子(或受體)的水平。在這種測定方法中有3種必要的試劑:①固相的抗原或抗體,②酶標記的抗原或抗體,③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件,可設計出各種不同類型的檢測方法。 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法,操作步驟如下:
(1)將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結合的抗體及雜質。
(2)用脫脂奶粉或BSA進行封閉。洗滌除去多餘的脫脂奶粉或BSA。
(3)加受檢標本:使之與固相抗體接觸反應一段時間,讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合,形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
(4)加酶標抗體:使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
(5)加底物:夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物,即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。 在雙抗體夾心法測定抗原時,如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體,則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步(圖15-5)。這種雙位點一步不但簡化了操作,縮短了反應時間,如應用高親和力的單克隆抗體,測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中,應注意鉤狀效應(hookeffect),類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,而不再形成夾心復合物,所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。 間接法是檢測抗體最常用的方法,其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下:
(1)將特異性抗原與固相載體連接,形成固相抗原:洗滌除去未結合的抗原及雜質。
(2)加稀釋的受檢血清:其中的特異抗體與抗原結合,形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後,固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合,在洗滌過程中被洗去。
(3)加酶標抗抗體:與固相復合物中的抗體結合,從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後,固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體,可用酶標羊抗人IgG抗體。
(4)加底物顯色:顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
本法只要更換不同的固相抗原,可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。 競爭法可用於測定抗原,也可用於測定抗體。以測定抗原為例,受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合,因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下:
(1)將特異抗體與固相載體連接,形成固相抗體。洗滌。
(2)待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液,使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原,則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原,則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合,競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會,使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原,保溫後,酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 (3)加底物顯色:參考管中由於結合的酶標抗原最多,故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差,代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡,表示標本中抗原含量越多。 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在,後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法,先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上,在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下:
(1)將抗人IgM抗體連接在固相載體上,形成固相抗人IgM。洗滌。
(2)加入稀釋的血清標本:保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
(3)加入特異性抗原試劑:它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
(4)加入針對特異性的酶標抗體:使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
(5)加底物顯色:如有顏色顯示,則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在,是為陽性反應。 親和素是一種糖蛋白,可由蛋清中提取。分子量60kD,每個分子由4個亞基組成,可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素(strepavidin)。生物素(biotin)又稱維生素H,分子量244.31,存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物,生物素-羥基琥珀亞胺酯(biotin-hydroxysuccinimide,BNHS)可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合,雖不屬免疫反應,但特異性強,親和力大,兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置,可以連接更多的生物素化的分子,形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來,就可大提高ELISA的敏感度。
親和素-生物素系統在ELISA中的應用有多種形式,可用於間接包被,亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素,原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合,通過親和素-生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量,而且使其結合點充分暴露。另外,在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代,然後連接親和素-酶結合物,以放大反應信號。
ELISA 普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗. 在這種方法中, 通常標准配體是固定的, 通過加入溶液相受體或蛋白質來使之成鍵. 通過加入與受體特異性反應的抗體來定量成鍵的受體, 而且最初抗體的量以加入第二種能顯色的抗體測量. 第二種抗體能識別抗體的末端, 在其末端的鹼性磷酸酯或過氧化物酶等與酶發生反應, 從而使溶液顯色.

⑹ 可用於elisa的抗體有哪些類型

⑺ 哪位大俠用生物素標記的多肽做過間接法Elisa嗎

抽血檢測,一般用三代酶聯合免疫法 酶聯免疫法,簡稱ELISA。 它的中心就是讓抗體與酶復合物結合,然後通過顯色來檢測。 步驟:ELISA用血清來檢測,首先血液要經過至少半個小時的凝集,然後取血清(這是有些網友不理解為什麼醫院抽完了血對血置之不理的原因,其實是誤會)。將酶復合物用稀釋液稀釋後,加血清及陰性、陽性對照,還有就是質控品(這是嚴格的要求,它的范圍必須在質控范圍內)。經過一個小時的孵育,然後洗板,加底物,半個小時避光反應後加終止液即完成反應部分,然後就是讀數。由數值來判斷結果的陰性或陽性。嚴格的講,如果第一次檢測為陽性的話,無論是哪個實驗室,必須按照CDC的HIV操作規程來進行第二次檢測,第二次的方法必須與第一次的不同,如還是陽性,將送確認實驗室確認。有的醫院很不負責,將初篩陽性的報告發出後就不管了,這是不對的。必須經過確認實驗室確認後才可出陽性診斷。祝大家。PS,第一次檢測為陽性的話,一定要去確認實驗室再做一次,勇敢的去面對,也許結果就不一樣了。 基本原理是:①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面,並保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體,這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測定時,把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開,最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後,底物被酶催化變為有色產物,產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高,故可極大地地放大反應效果,從而使測定方法達到很高的敏感度。 ELISA可用於測定抗原,也可用於測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑:①固相的抗原或抗體,②酶標記的抗原或抗體,③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件,可設計出各種不同類型的檢測方法。 具體方法有: (一)雙抗體夾心法 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法,操作步驟如下: (1)將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結合的抗體及雜質。 (2)加受檢標本:使之與固相抗體接觸反應一段時間,讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合,形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。 (3)加酶標抗體:使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。 (4)加底物:夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。 根據同樣原理,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物,即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。 (二)雙位點一步法 在雙抗體夾心法測定抗原時,如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體,則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步(圖15-5)。這種雙位點一步不但簡化了操作,縮短了反應時間,如應用高親和力的單克隆抗體,測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法測定中,應注意鉤狀效應(hookeffect),類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,而不再形成夾心復合物,所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。 (三)間接法測抗體 間接法是檢測抗體最常用的方法,其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下: (1)將特異性抗原與固相載體連接,形成固相抗原:洗滌除去未結合的抗原及雜質。 (2)加稀釋的受檢血清:其中的特異抗體與抗原結合,形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後,固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合,在洗滌過程中被洗去。 (3)加酶標抗抗體:與固相復合物中的抗體結合,從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後,固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體,可用酶標羊抗人IgG抗體。 (4)加底物顯色:顏色深度代表標本中受檢抗體的量。 本法只要更換不同的固相抗原,可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。 (四)競爭法 競爭法可用於測定抗原,也可用於測定抗體。以測定抗原為例,受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合,因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下: (1)將特異抗體與固相載體連接,形成固相抗體。洗滌。 (2)待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液,使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原,則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原,則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合,競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會,使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原,保溫後,酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 (3)加底物顯色:參考管中由於結合的酶標抗原最多,故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差,代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡,表示標本中抗原含量越多。 (五)捕獲法測IgM抗體 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在,後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法,先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上,在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下: (1)將抗人IgM抗體連接在固相載體上,形成固相抗人IgM。洗滌。 (2)加入稀釋的血清標本:保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。 (3)加入特異性抗原試劑:它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。 (4)加入針對特異性的酶標抗體:使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。 (5)加底物顯色:如有顏色顯示,則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在,是為陽性反應。 (六)應用親和素和生物素的ELISA 親和素是一種糖蛋白,可由蛋清中提取。分子量60kD,每個分子由4個亞基組成,可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素(strepavidin)。生物素(biotin)又稱維生素H,分子量244.31,存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物,生物素-羥基琥珀亞胺酯(biotin-hydroxysuccinimide,BNHS)可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合,雖不屬免疫反應,但特異性強,親和力大,兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置,可以連接更多的生物素化的分子,形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來,就可大提高ELISA的敏感度。 親和素-生物素系統在ELISA中的應用有多種形式,可用於間接包被,亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素,原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合,通過親和素-生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量,而且使其結合點充分暴露。另外,在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代,然後連接親和素-酶結合物,以放大反應信號。

⑻ elisa中生物素化抗體的作用

是為了放大信號,使顯色更加靈敏。如果直接用HPR結合的檢測抗體,信號會相對弱一些。

⑼ 生物素化抗體

在做western blot或免疫組化時我們常使用一抗二抗來放大、顯示抗原,用酶或熒游標記二抗。生物素化的抗體,是在抗體上連接生物素(biotin),生物素能和親和素(avitin)特異性高親和性結合,親和力是抗原抗體結合的一萬倍,而且一個avitin可以結合四個biotin,這樣又起到級聯放大的作用。所以能更加靈敏的顯示微量抗原。這種方法也叫親和免疫組化。

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