生物活性測定如何進行方法學驗證

㈠ 建立生物樣品分析方法，對定量分析方法進行驗證包括哪些內容

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生物樣品定量分析方法驗證指導原則
1.
范圍
准確測定生物基質（如全血、血清、血漿、尿）中的葯物濃度，對於葯物和制劑研發非常重要。這些數據可被用於支持葯品的安全性和有效性，或根據毒動學、葯動學和生物等效性試驗的結果做出關鍵性決定。因此，必須完整地驗證和記錄應用的生物分析方法，以獲得可靠的結果。
本指導原則提供生物分析方法驗證的要求，也涉及非臨床或臨床試驗樣品實際分析的基本要求，以及何時可以使用部分驗證或交叉驗證，來替代完整驗證。
生物樣品定量分析方法驗證和試驗樣品分析應符合本指導原則的技術要求。應該在相應的生物樣品分析中遵守GLP原則或GCP原則。
2.
生物分析方法驗證
2.1
分析方法的完整驗證
分析方法驗證的主要目的是，證明特定方法對於測定在某種生物基質中分析物濃度的可靠性。此外，方法驗證應採用與試驗樣品相同的抗凝劑。一般應對每個物種和每種基質進行完整驗證。當難於獲得相同的基質時，可以採用適當基質替代，但要說明理由。
一個生物分析方法的主要特徵包括：選擇性、定量下限、響應函數和校正范圍（標准曲線性能）、准確度、精密度、基質效應、分析物在生物基質以及溶液中儲存和處理全過程中的穩定性。
有時可能需要測定多個分析物。這可能涉及兩種不同的葯物，也可能涉及一個母體葯物及其代謝物，或一個葯物的對映體或異構體。在這些情況下，驗證和分析的原則適用於所有涉及的分析物。

㈡ 如何驗證一個新化合物的生物活性

這個問題較難。得通過化合物的結構與組成元素等，推知化合物可能有的活性然後加以驗證。跟蛋白質比較像就推知有催化等。

㈢ 檢測細胞生物學活性有哪些方法

根據每細胞定重量設計用於單細胞、細胞及絲狀體微物測定定體積品通離或濾菌體離經洗滌再離直接稱重求濕重絲狀體微物濾用濾紙吸菌絲間自由水再稱重求濕重論細菌品絲狀菌品放已知重量平皿或燒杯內於一05℃烘乾至恆重取放入乾燥器內冷卻再稱量求微物乾重 要測定固體培養基放線菌或絲狀真菌先加熱至50℃使瓊脂熔化濾菌絲體再用50℃理鹽水洗滌菌絲按述求菌絲體濕重或乾重 除乾重、濕重反映細胞物質重量外通測定細胞蛋白質或DNA含量反映細胞物質量蛋白質細胞主要含量比較穩定其氮蛋白質重要組元素定體積品離細胞洗滌按凱氏定氮測總氮量蛋白質含氮量一陸％細菌蛋白質含量占細菌固形物50％吧0％般陸5％代表些細菌則佔一三％一四％種變化由菌齡培養條件同所產總含氮量與蛋白質總量間關系按列公式計算： 蛋白質總量＝含氮量×陸.二5 核酸DNA微物重要遺傳物質每細菌DNA含量相恆定平均吧.四×`一0^(-5)`NG定體積細菌懸液所含細菌提取DNA求DNA含量再計算定體積細菌懸液所含細菌總

㈣ 生物活性的活性檢測

材料表面在 SBF 中形成磷灰石的能力能夠反應材料在體內的生物活性，具體檢測方法如下：
1.SBF 配置
由於SBF 溶液對於磷灰石過飽和，所以配備方法不恰當會導致溶液中磷灰石沉澱產生。整個配備過程需要確保溶液無色、透明，容器表面無沉澱出現，如果過程中產生沉澱，倒去溶液，洗凈儀器重新配製。准備一個 1000ml 的塑料燒杯。首先於塑料燒杯中裝好 700ml 離子交換蒸餾水、一個適當大小磁子，杯口密封以蒸發皿或塑料薄膜。攪拌並調節水溫至 36.5±1.5C。
按表1所列順序在 36.5C 恆溫下逐個溶解第一到第八個化合物，溶解過程
表1 配置1000 ml SBF 溶液時試劑添加順序、添加量 Order Reagents Amounts Containers Purities（%） Formula weights 1 NaCl 8.035 Weight paper 99.5 58.4430 2 NaHCO3 0.355 Weight paper 99.5 84.0068 3 KCl 0.225 Weight bottle 99.5 74.5515 4 K2HPO4·3H2O 0.231 Weight bottle 99.0 228.2220 5 MgCl2·6H2O 0.311 Weight bottle 98.0 203.3034 6 1.0 M-HCl 39ml Graated cylinder — — 7 CaCl2 0.292 Weight bottle 95.0 110.9848 8 Na2SO4 0.072 Weight bottle 99.0 142.0428 9 Tris 6.118 Weight paper 99.0 121.1356 10 1.0 M-HCl 0-5ml Syringe — — 2.磷灰石形成能力測試
對於密質薄片材料，測出樣品尺寸並計算樣品表面積精確到 2mm 應用如下公式計算出 SBF 用量：
Vs=Sa/10,
Vs（ml）是 SBF 的體積量，Sa（mm）表示樣品的表面積。
對於多孔材料，SBF 的用量應大於上式計算量准備好塑料瓶或燒杯，裝入計算出的 SBF 體積量加熱到 36.5C， 然後按示意圖往裡放置樣品。 筆記：樣品在容器中放置有兩種情況，如圖 1(a)，1(b)。少數情況下，SBF 溶液會生成同 質磷灰石沉積於樣品表面。所以如果樣品放置是圖 A1(b)種情況，表徵實驗應該檢測樣品的 下表面。 四個星期內，分別取出恆溫浸透不同時長的各組樣品，純水輕盈洗凈。然後將樣品放入乾燥 器中常溫乾燥。
圖1 SBF中樣品浸泡示意圖 1.四唑鹽（MTT）比色法：
檢測細胞存活和生長的方法除前面所介紹的方法外，還可用四唑鹽比色法試驗（MTT）。此法的原理是：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物，並沉積在細胞中，而細胞無此功能。二甲基亞碸（DMSO）能溶解細胞中的藍紫色結晶物，用酶聯免疫檢測，以在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反應活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶物形成的量與細胞數成正比。
●0.25%胰蛋白酶消化細胞使其成為單細胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培養基配成1x10^9個/L的但細胞懸液，將細胞接種於96孔培養板中，每孔100ul。
●將培養板置CO2培養箱中，在37℃、5%CO2條件下，培養3-5天。
●培養3-5天後，每孔加入MTT溶液10ul，繼續置培養箱孵育3-6h，終止培養，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培養數小時，將細胞內與細胞周圍的MTT顆粒充分溶解。
●用酶聯免疫檢測儀測定每孔吸光度（OD），選波長490nm。以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。
用此法測細胞活力，為保證結果的准確性，最好在試驗前測定每種細胞的貼比率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，再確定每孔細胞接種數和培養時間，以保證培養終止時不會過滿。另外，實驗時設空白對照，比色時，以空白孔調零。
3.2.2 CCK-8 法
Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用於簡便而准確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。
● 制備細胞懸液：細胞計數
● 接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數，每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做3個重復。
● 37℃培養箱中培養：細胞接種後貼壁大約需要培養2-4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。
●加入10ul CCK8：由於每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑後輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養基，以換液的形式加入。
●培養1-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。
●測定450nm吸光度：建議採用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

㈤ 測定微生物細胞活性的方法都有哪些

根據每個細胞有一定的重量而設計的。它可以用於單細胞、多細胞以及絲狀體微生物生長的測定。將一定體積的樣品通過離心或過濾將菌體分離出來，經洗滌，再離心後直接稱重，求出濕重，如果是絲狀體微生物，過濾後用濾紙吸去菌絲之間的自由水，再稱重求出濕重。不論是細菌樣品還是絲狀菌樣品，可以將它們放在已知重量的平皿或燒杯內，於105℃烘乾至恆重，取出放入乾燥器內冷卻，再稱量，求出微生物乾重。
如果要測定固體培養基上生長的放線菌或絲狀真菌，可先加熱至50℃，使瓊脂熔化，過濾得菌絲體，再用50℃的生理鹽水洗滌菌絲，然後按上述方法求出菌絲體的濕重或乾重。
除了乾重、濕重反映細胞物質重量外，還可以通過測定細胞中蛋白質或DNA的含量反映細胞物質的量。蛋白質是細胞的主要成分，含量也比較穩定，其中氮是蛋白質的重要組成元素。從一定體積的樣品中分離出細胞，洗滌後，按凱氏定氮法測出總氮量。蛋白質含氮量為16％，細菌中蛋白質含量占細菌固形物的50％一80％，一般以65％為代表，有些細菌則只佔13％一14％，這種變化是由菌齡和培養條件不同所產生的。因此總含氮量與蛋白質總量之間的關系可按下列公式計算：
蛋白質總量＝含氮量×6.25
核酸DNA是微生物的重要遺傳物質，每個細菌的DNA含量相當恆定，平均為8.4×`10^(-5)`NG。因此從一定體積的細菌懸液中所含的細菌中提取DNA，求得DNA含量，再計算出這一定體積的細菌懸液所含的細菌總數。