如何獲得某生物cDNA

Ⅰ 從RNA抽提到製成cDNA的全過程

一).構建cDNA文庫：
以生物細胞的總 mRNA 為模板，用反轉錄酶合成互補的雙鏈 cDNA ，然後接到載體上，轉入到宿主後建立的基因文庫就是 cDNA 文庫。

1、mRNA的提取及其完整性的確定
1） 總 RNA 的提取
RNA 提取方法：APGC法或NP-40或應用試劑盒提取總RNA
2）mRNA的分離
高等真核生物 mRNA 分子的 3' 端均有 poly(A) 尾，將總RNA通過寡聚（DT）纖維柱分離mRNA或利用磁珠法制備純mRNA。在某些情況下，裂解細胞後用蔗糖梯度來制備mRNA-核糖體復合物作為提取mRNA的替換途徑。
3） mRNA 的純化 ①按照大小對總 mRNA 進行分級，主要用瓊脂糖凝膠電泳和蔗糖密度梯度離心法進行分級；②多聚核糖體的免疫學純化法，這是利用抗體來純化合成目的多肽的方法。
4）mRNA 完整性的確定
確定 mRNA 完整性的方法有三種：
① 直接檢測 mRNA 分子的大小；
② 測定 mRNA 的轉譯能力；
③ 檢測總 mRNA 指導合成 cDNA 第一鏈長分子的能力。

2、 cDNA 的合成和克隆
1） cDNA 第一鏈的合成
用親和層析法得到 mRNA 後，根據 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾結構的原理，用 12~20 個核苷酸長的 oligo （ dT ）與純化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）會與 poly (A) 結合作為反轉錄酶的引物，反轉錄反應的產物是一條 RNA-DNA 的雜交鏈。 oligo （ dT ）結合在 mRNA 的 3' 端，因此合成全長的 cDNA 需要反轉錄酶從 mRNA 分子的一端移動到另一端，有時這種全合成難以達到，尤其是 mRNA 鏈很長時，為此建立了一種隨機引物法合成 cDNA 。隨機引物是一種長度為 6~10 個核苷酸，由 4 種鹼基隨機組成的 DNA 片段。與 oligo （ dT ）僅與 mRNA 3' 端結合不同，它們可以在 mRNA 的不同位點結合。隨機引物法合成的產物也是 RNA-DNA 的雜交體。把 cDNA 克隆到載體中之前，必須把這種雜交體中的 RNA 轉變成 DNA 鏈，即形成雙鏈 DNA 分子。
2）. 雙鏈 cDNA 的合成
合成 cDNA 第二條鏈有兩種方法。一種方法是利用 cDNA 第一鏈的 3' 末端常常出現發夾環的特徵，這種發夾結構是反轉錄酶在第一鏈末端「返折」並且進行復制第一鏈的結果，它為合成 cDNA 第二鏈提供了有用的引物。用這種方法合成的雙鏈 cDNA 在一端有一個發夾環，可以用單鏈特異的 S1 核酸酶切去。但是 S1 核酸酶的處理，常常會「修剪 」 過多的 cDNA 順序，使 cDNA 丟失了 mRNA 5' 端的部分順序。 另一種方法是用大腸桿菌的 RNase H 進行修飾。 RNase H 能識別 RNA-DNA 雜交分子並把其中的 RNA 切割成短的片段，這些 RNA 短片段仍與 cDNA 第一鏈結合，可被新合成的 DNA 所取代。新合成的 DNA 存在切口，用 DNA 連接酶把這些切口連接在一起形成一條完整的 DNA 鏈。 RNase H 法優於 S1 核酸酶法，它能獲得包括 mRNA 5' 端全部或絕大部分的更長順序 cDNA 分子。
3） 將 cDNA 重組到載體上 合成的 cDNA 與載體 DNA 進行連接一般有 3 種方法：
① 藉助於末端轉移酶的 3' -OH 端合成均聚物的能力，雙鏈 cDNA 和線性化載體 DNA 的 3' -OH 端分別加上均聚核苷酸鏈；
② 雙鏈 cDNA 和線性化載體 DNA 分別用 Klenow 片段進行末端補平，然後用 T4 DNA 連接酶進行齊頭連接，形成重組體；
③ 通過粘性末端連接。
4）. 轉化
重組的載體 DNA 分子在一定條件下轉化入大腸桿菌，形成攜帶質粒的菌株。當不同重組的 DNA 含有不同的 cDNA 基因時，整個轉化子含有來自 mRNA 群體的各種 cDNA 基因，這樣的轉 化子群體構成該 mRNA 全部遺傳信息的 cDNA 基因文庫。
5）. 目的 cDNA 克隆的鑒定
用於從 cDNA 文庫中篩選和鑒定目的 cDNA 的方法主要有 3 種：
① 核酸雜交 ② 免疫學雜交檢測 ③ cDNA 同胞選擇

Ⅱ 如何獲得cDNA

cDNA的獲取方法：
1.用親和層析法得到
mRNA
後，根據
mRNA
分子的
3'
端有
poly
(A)
尾結構的原理，用
12~20
個核苷酸長的
oligo
與純化的
mRNA
混合，
oligo
（
dT
）會與
poly
(A)
結合作為反轉錄酶的引物，隨機引物法合成的產物也是
RNA-DNA
的雜交體。把
cDNA
克隆到載體中之前，必須把這種雜交體中的
RNA
轉變成
DNA
鏈，即形成雙鏈
DNA
分子。
2.利用
cDNA
第一鏈的
3'
末端常常出現發夾環的特徵，這種發夾結構是反轉錄酶在第一鏈末端「返折」並且進行復制第一鏈的結果，用這種方法合成的雙鏈
cDNA
在一端有一個發夾環，可以用單鏈特異的
S1
核酸酶切去。新合成的
DNA
存在切口，用
DNA
連接酶把這些切口連接在一起形成一條完整的
DNA
鏈。
RNase
H
法優於
S1
核酸酶法，它能獲得包括
mRNA
5'
端全部或絕大部分的更長順序
cDNA
分子。
cDNA簡介：
為具有與某mRNA(信使RNA)鏈呈互補的鹼基序列的單鏈DNA即complementary
DNA之縮寫，或此DNA鏈與具有與之互補的鹼基序列的DNA鏈所形成的DNA雙鏈。與RNA鏈互補的單鏈DNA，以其RNA為模板，在適當引物的存在下，由依賴RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)的作用而合成，並且在合成單鏈cDNA後，在用鹼處理除去與其對應的RNA以後，以單鏈cDNA為模板，由依賴DNA的DNA聚合酶或依賴RNA的DNA聚合酶的作用合成雙鏈cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遺傳工程方面廣為應用。在這種情況下，mRNA的cDNA，與原來基因的DNA(基因組DNA，genomic
DNA)不同而無內含子;相反地對應於在原來基因中沒有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，與exon序列、先導序列以及後續序列等一起反映出mRNA結構。

Ⅲ 反轉錄法獲取cdna

因為直接從生物體中提取的基因的編碼區是不連續的有不編碼蛋白質的內含子部分，而反轉錄來的cDNA的編碼區是連續的（成熟mRNA中的序列都是由基因的編碼區的外顯子部分轉錄來的），為了節省目的基因片段的長度，選擇cDNA為目的基因。
怎麼不給懸賞？

Ⅳ 如何根據真核生物蛋白質氨基酸的一級結構獲得其cdna

大致試驗步驟：1、由氨基酸序列即蛋白質免疫反應得體2、再將抗體與胞內核糖體（上的蛋白質）結合3、將核糖體上的蛋白質和mRNA拆分4、由MRNA逆轉錄cDNA

Ⅳ cDNA文庫構建的方法與過程分別是什麼

cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合.經典 cDNA 文庫構建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉錄引物,或者用隨機引物,給所合成的 cDNA 加上適當的連接接頭,連接到適當的載體中獲得文庫.其基本步驟包括：RNA 的提取(例如異硫氰酸胍法,鹽酸胍—有機溶劑法,熱酚法等等,提取方法的選擇主要根據不同的樣品而定),要構建一個高質量的 cDNA 文庫,獲得高質量的 mRNA 是至關重要的,所以處理 mRNA 樣品時必須仔細小心.由於 RNA 酶存在所有的生物中,並且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環境,因此建立一個無 RNA 酶的環境對於制備優質 RNA 很重要.在獲得高質量的 mRNA 後,用反轉錄酶 Oligo(dT) 引導下合成 cDNA 第1鏈, cDNA 第2鏈的合成(用 RNA 酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶 I,同時包括使用 T4 噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 DNA 連接酶進行的修復反應),合成接頭的加入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷,擴增 cDNA 文庫、對建立的 cDNA 文庫進行鑒定.這里強調的是對載體的選擇,常規用的是 λ 噬菌體,這是因為 λ DNA 兩端具有由12個核苷酸的粘性末端,可用來構建柯斯質粒,這種質粒能容納大片段的外源 DNA.

Ⅵ pcr技術dna模板如何獲得

有兩種方法：

第一種從cDNA 文庫(cDNA library )獲得，如廈大韓家淮實驗建立的免費cDNA 文庫；

第二種從mRNA逆轉錄獲得，在這種情況下，mRNA的cDNA，與原來的基因組DNA相同而且無內含子；相反地，對應於在原來基因中沒有的而在mRNA存在的3'末端的poly A序列等的核苷序列上，與外顯子序列、先導序列以及後續序列等一起反映出mRNA結構。

真核生物的mRNA或其他RNA的cDNA，在遺傳工程方面廣為應用。

(6)如何獲得某生物cDNA擴展閱讀：

cDNA 文庫(cDNA library ): 是指某生物某一發育時期所轉錄的mRNA 全部經反轉錄形成的cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。 cDNA 文庫與基因組文庫的最主要的區別是，基因組文庫含有而cDNA 文庫不含非轉錄的基因組序列(重復序列等)。

與基因組文庫- 一樣，cDNA 文庫也是指一群含重組DNA 的細菌或噬菌體克隆。每個克隆只含一種mRNA 的信息，足夠數目克隆的總和包含了細胞的全部mRNA 信息。cDNA 文庫便於克隆和大量擴增，可以從中篩選到所需目的基因，並用於表達。

不論是由細胞總DNA 建立的基因組文庫，還是由mRNA 逆轉錄而成的cDNA 建立的cDNA 文庫，都是混合物，還要對文庫進行篩選，直到獲得目的基因。

以mRNA為模板，經反轉錄酶催化，在體外反轉錄成cDNA，與適當的載體（常用噬菌體或質粒載體）連接後轉化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，並能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。

cDNA文庫特異地反映某種組織或細胞中，在特定發育階段表達的蛋白質的編碼基因，因此cDNA文庫具有組織或細胞特異性。

Ⅶ 如何根據真核蛋白的氨基酸序列獲得其cDNA

真核生物基因組DNA十分龐大,其復雜程度是蛋白質和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重復序列，採用電泳分離和雜交的方法，都難以直接分離到目的基因，其中還含有內含子等無用的序列。這是從染色體DNA為出發材料直接克隆目的基因的一個主要困難.
高等生物一般具有105種左右不同的基因,但在一定時間階段的單個細胞或個體中,都盡有15%左右的基因得以表達,產生約15000種不同的mRNA分子。cDNA文庫是通過RNA反轉錄得來的，由mRNA出發的cDNA克隆,其復雜程度要比直接從基因組克隆簡單得多.

Ⅷ CDNA如何克隆

一般用mRNA反轉錄地方法得到cDNA
或者從文庫里直接得到cDNA

之後用PCR就可以擴增 克隆

cDNA克隆是以mRNA為原材料，經體外反轉錄合成互補的DNA(cDNA)，再與載體DNA分子連接引入寄主細胞。每一cDNA反映一種mRNA的結構，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特點是：

①有些生物，如RNA病毒沒有DNA，只能用cDNA克隆；

②cDNA克隆易篩選，因為cDNA庫中不包含非結構基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一個mRNA的信息；

③cDNA能在細菌中表達。cDNA僅代表某一發育階段表達出來的遺傳信息，只有基因文庫才包含一個生物的完整遺傳信息。

1.方法：

(1)DNA片段的制備：常用以下方法獲得DNA片段：①用限制性核酸內切酶將高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超聲波)取得DNA隨機片段；③在已知蛋白質的氨基酸順序情況下，用人工方法合成對應的基因片段；④從mRNA反轉錄產生cDNA。

(2)載體DNA的選擇：

①質粒：質粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環狀，大小為1-200千鹼基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是「緊密型」；二是「松馳型」。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用於構建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。

②噬菌體DNA：常用的λ噬菌體的DNA是雙鏈，長約49kb，約含50個基因，其中50%的基因對噬菌體的生長和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體DNA兩端。中間是非必需區，進行改造後組建一系列具有不同特點的載體分子。λ載體系統最適用於構建真核生物基因文庫和cDNA庫。

M13噬菌體是一種獨特的載體系統，它只能侵襲具有F基因的大腸桿菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌內是雙鏈環狀分子，象質粒一樣自主制復，制備方法同質粒。寄主菌可分泌含單鏈DNA的M13噬菌體，又能方便地制備單鏈DNA，用於DNA順序分析、定點突變和核酸雜交。

③拷斯(Cos)質粒：是一類帶有噬菌體DNA粘性末端順序的質粒DNA分子。是噬菌體－質粒混合物。此類載體分子容量大，可攜帶45kb的外源DNA片段。也能象一般質粒一樣攜帶小片段DNA，直接轉化寄主菌。這類載體常被用來構建高等生物基因文庫。

(3)DNA片段與載體連接：DNA分子與載體分子連接是克隆過程中的重要環節之一，方法有：①粘性末端連接，DNA片段兩端的互補鹼基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內切酶消化DNA可產生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復原樣，有些限制性內切酶雖然識別不同順序，卻能產生相同末端。②平頭末端連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端連接。④人工接頭分子連接，在平頭DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性內切酶識別位點的寡核苷酸片段，經限制性內切酶作用後就會產生粘性末端。

連接反應需注意載體DNA與DNA片段的比率。以λ或Cos質粒為載體時，形成線性多連體DNA分子，載體與DNA片段的比率高些為佳。以質粒為載體時，形成環狀分子，比率常為1∶1。

(4)引入寄主細胞：常用兩種方法：①轉化或轉染，方法是將重組質粒DNA或噬菌體DNA(M13)與氯化鈣處理過的宿主細胞混合置於冰上，待DNA被吸收後鋪在平板培養基上，再根據實驗設計使用選擇性培養基篩選重組子，通常重組分子的轉化效率比非重組DNA低，原因是連接效率不高，有許多DNA分子無轉化能力，而且重組後的DNA分子比原載體DNA分子大，轉化困難。②轉導，病毒類侵染宿主菌的過程稱為轉導，一般轉導的效率比轉化高。

Ⅸ 如何進行目的基因和目的的cDNA的篩選

篩選一般用主要採用雜交技術(如Northen雜交、Southen雜交)，採用的是單鏈核酸間互補配對的原理，或者使用鳥槍法導入，看性狀能否表達。
不知道據你要做什麼
(一)從細胞核中直接分離
簡單的原核生物目的基因可從細胞核中直接分離得到，但人類的基因分布在23對染色體上，較難從直接法中得到。
直接分離基因最常用的方法是「鳥槍法」，又叫「散彈射擊法」。這種方法有如用獵槍發射的散彈打鳥，無論哪一顆彈粒擊中目標，都能把鳥打下來。鳥槍法的具體做法是:用限制酶(即限制性內切酶)將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然後通過運載體分別轉入不同的受體細胞，讓供體細胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分別在受體細胞中大量復制(在遺傳學中叫做擴增)，從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法吧帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲，抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。
用「鳥槍法」獲取目的基因的優點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性。
(二)染色體DNA的限制性內切酶酶解
II型限制性內切酶可專一性地識別並切割特定的DNA順序，產生不同類型的DNA末端。若載體DNA與插入的DNA片段用同一種內切酶消化，或靶DNA與載體DNA末端具有互補的粘性末端，可以直接進行連接。
(三)人工體外合成
簡短的目的基因可在了解DNA一級結構或多肽鏈一級結構氨基酸編碼的核苷酸序列的基礎上人工合成。
(四)用逆轉錄酶制備cDNA
大多數的目的基因是由mRNA合成cDNA(反轉錄DNA)得到。從RNA入手，先從細胞提取總RNA，然後根據大多數真核mRNA含有多聚腺嘌呤(polyadenylic
acid
,polyA)尾的特點，用寡聚dT纖維素柱將mRNA分離出，以mRNA為模板，在多聚A尾上結合12-18個dT的寡聚dT片段，作為合適的起始引物，在逆轉錄酶作用下合成第一條
圖10-39
目的

Ⅹ 從某一生物X基因克隆得cDNA,鑒定基因功能,寫出實驗方案

實驗目的：從某一生物X基因克隆得cDNA
實驗方法：1.抽取該生物的total RNA
2.用total RNA反轉錄得到total cDNA
3.設計引物，以total cDNA為模板，將目標基因PCR擴增出來
4.測序鑒定PCR產物