微生物測定樣品凝膠怎麼辦

A. 生物凝膠色譜法

凝膠色譜法又叫凝膠色譜技術，是六十年代初發展起來的一種快速而又簡單的分離分析技術，由於設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜法主要用於高聚物的相對分子質量分級分析以及相對分子質量分布測試。根據分離的對象是水溶性的化合物還是有機溶劑可溶物，又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。 GFC一般用於分離水溶性的大分子，如多糖類化合物。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。凝膠滲透色譜法主
凝膠色譜法圖示
要用於有 機溶劑中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相對分子質量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機溶劑。凝膠色譜不但可以用於分離測定高聚物的相對分子質量和相對分子質量分布，同時根據所用凝膠填料不同，可分離油溶性和水溶 性物質，分離相對分子質量的范圍從幾百萬到100以下。近年來，凝膠色譜也廣泛用於分離小分子化合物。化學結構不同但相對分子質量相近的物質，不可能通過凝膠色譜法達到完全的分離純化的目的。凝膠色譜主要用於高聚物的相對分子質量分級分析以及相對勿子質量分布測試。目前已經被生物化學、分子生物學、生物工程學、分子免疫學以及醫學等有關領域廣泛採用，不但應用於科學實驗研究，而且已經大規模地用於工業生產。
分子篩效益

一個含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經凝膠色譜柱時，各分子在柱內同時進行著兩種不同的運動：垂直向下的移動和無定向的擴散運動。大分子物質由於直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，即進入凝膠相內，在向下移動的過程中，從一個凝膠內擴散到顆粒間隙後再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的下移速度落後於大分子物質，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的後流出，分子最小的最後流出，這種現象叫分子篩效應。
凝膠色譜系統
具有多孔的凝膠就是分子篩。各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，就會全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻[1]。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。綜上所述，在凝膠色譜中會有三種情況，一是分子很小，能進入分子篩全部的內孔隙；二是分子很大，完全不能進入凝膠的任何內孔隙；三是分子大小適中，能進入凝膠的內孔隙中孔徑大小相應的部分。大、中、小三類分子彼此間較易分開，但每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對於分子大小不同，但同屬於凝膠分離范圍內各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內，而分子較小的可進入較多的凝膠顆粒內，這樣分子較大的在凝膠床內移動距離較短，分子較小的移動距離較長。於是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的後通過凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質分離。另外，凝膠本身具有三維網狀結構，大的分子在通過這種網狀結構上的孔隙時阻力較大，小分子通過時阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小「排隊，凝膠表現分子篩效應。

B. 微生物DNA提取的原理和方法是什麼

細菌染色體DNA的抽提
一、 目的
熟練掌握抽提細菌DNA的一般方法
二、原理
要進行重組DNA 實驗，就離不開外源基因的純化，而外源基因主要來源之一就要直接從生物的染色體DNA上制備，所以制備高質量的染色體DNA樣品經常為基因工程實驗所需要，抽提細菌染色體DNA的方法目前已有許多種，這里所介紹的兩種方法：一適用於枯桿菌染色體的抽提；另一種方法則適用於大腸桿菌染色體的制備。
基因工程實驗所需要的基因組DNA 通常要求分子量盡可能大，以此增加外源基因獲得率，但要獲得大片段的DNA 非易事，細菌基因組DNA通常是個很大的環狀態DNA，而在抽提過程中，不可避免的機械剪切力必將切斷DNA，如果要抽提到大的DNA 分子，就要盡可能地溫和操作，減少剪切力，減少切斷DNA 分子的可能性；分子熱運動也會減少所抽提到的DNA分子量，所以提取過程也要盡可能在低溫下進行。另外細胞內及抽提器皿中污染的核酸酶也會降解制備過程中的DNA，所以制備過程要抑制其核酸酶的活性。
另外製備的細菌染色體DNA 必須是高純度的，以滿足基因工程中各種酶反應的需要，制備的樣品必須沒有蛋白污染，沒有RNA，各種離子濃度應符合要求，這些在染色體制備時都應考慮到。
大腸桿菌染色體DNA 抽提首先收集對數生長期的細胞，然後用離子型表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）破裂細胞，SDS 具有的主要功能是：（1）溶解細胞膜上的脂類和蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜；（2）解聚細胞膜上的脂類和蛋白質，有助於消除染色體DNA上的蛋白質；（3）SDS 能與蛋白質結合成為R1—0—SO3R2—蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉澱下來。但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以後的提取過程中，必須把它除干凈。以免影響下一步RNase的作用。破細胞後RNA經RNase消化除去，蛋白質經苯酚、氯仿:異戊醇抽提除去經灑精沉澱回收DNA。枯草桿菌染色體制備與上類似，但略加修改的方法要適合教學要求。枯草桿菌是格蘭氏陽性菌，所以在SDS 處理前需要使用溶菌酶裂解細胞壁。溶菌酶是一種糖苷水解酶，它能水解菌體細胞壁的主要化學成份肽聚糖中的β—1，4 糖苷鍵，有助於細胞壁破裂，破裂的細胞壁在SDS 的作用下溶菌，同時用蛋白酶K 消化蛋白質，能解離纏繞在染色體DNA上的蛋白質，然後加入一定量的醋酸鉀，使蛋白質變性，通常離心除去，在這期間可加入核糖酸酶消化RNA，最後用乙醇回收DNA。
此二種方法抽提的細菌染色體DNA，無RNA和蛋白質污染，可用於限制性內切酶消化，分子再克隆等。但在下一步實驗前，要測定其DNA的濃度，常用測定DNA 濃度的方法，是溴化乙錠電泳法；當DNA 樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，加入的EB 會增強發射的熒光。而熒光的強度正比於DNA 的含量，如將已知濃度的標准樣品作電泳對照，就可估計出待樣品的濃度。
三、材料
（一）菌株
大腸桿菌C600、枯草桿菌BR151。
（二）儀器
電泳設備、恆溫水浴鍋、低速離心機、恆溫振盪器、紫外檢測儀。
（三）器皿
玻璃離心管（10 毫升）、移液管（10毫升、5毫升）、微量取樣器、燒杯、玻璃棒、試管、三角瓶
（四）試劑
（1）LB 完全肉湯培養液：1%蛋白腖 0.5%酵母粉 0.5%NaCl pH7.5。
（2）BY 培養液：1%蛋白腖 0.5%牛肉膏 0.5%酵母粉 0.5%葡萄糖 0.5%NaClpH7.5
（3）SET 溶液：20%蔗糖；50mmol/L Tris—HCl（pH7.6） 50mmol/L EDTA。
（4）20%SDS
（5）飽和酚
（6）氯仿:異戊醇（24:1 V:V）
（7）預冷無水酒精
（8）TE 溶液
（9）RNase溶液
（10）5mol/L 醋酸鉀
（11）蛋白酶K 20mg/ml
四、實驗步驟
1、取大腸桿菌C600單菌落於5 毫升LB培養液中，37℃振盪培養過液。
2、將上述菌液1%接種量接種於20 毫升LB 培養液中，37℃搖床振盪培養過夜。
3、已培養好的菌液，收集於10毫升的離心管中，在低速離心機上4000r/min離心10分鍾，去上清，留沉澱菌體。
4、用5 毫升的SET 溶液懸浮細胞，加入20% SDS 1毫升，37℃下輕搖過夜，使細胞裂解。
5、加入等體積的飽和酚，上下輕輕搖勻，放置5 分鍾後，在低速離心機上3500r/min離心10 分鍾。
6、取上相，加入1/2 體積的飽和酚，1/2體積的氯仿異:戊醇，上下翻轉均勻，3500r/min離心10 分鍾。
7、取上相，加入等體積的氯仿:異戊醇，如第6步，離心。
8、取上相於一干凈離心管中，另在一個50 毫升的燒杯中加入15毫升預冷無水酒精，把上述的上相液沿著玻棒慢慢倒入酒精中，並溫和地攪拌以使DNA 附著於玻棒上。
9、挑起DNA，再放於干凈的酒精中洗滌，然後把DNA溶於50 毫升TE 中，待測濃度。
（二）枯草桿菌染色體DNA 的抽提
1、在BY 斜面上劃線活化枯草桿菌BR151。
2、挑一環已活化的BR151 菌株於20 毫升的BY培養液中，37℃搖床振盪培養過液。
3、過夜培養物，收集10 毫升於離心管內，在低速離心機上3500r/min離心10 分鍾。
4、沉澱菌體加入0.75 毫升溶菌酶液（8 毫克溶菌酶/1毫升SET），振盪器上懸浮細胞，懸浮液移入1.5 毫升離心管，室溫30 分鍾。
5、在反應液中加入0.15毫升SDS溶液，蛋白酶K 溶液5 微升，37℃水浴10 分鍾後轉入75℃水浴5 分鍾。
6、加入5mol/L 醋酸鉀0.3 毫升，上下翻轉均勻，置於冰上30 分鍾，期間不時搖動。
於台式高速離心機離10000r/min10 分鍾。
7、上清液移入另一離心管，棄沉澱。重復第六步。
8、上清液移入5 毫升的離心管內，緩慢加入2倍體積的無水酒精，DNA呈絮狀沉澱。用一滅菌牙簽，挑起DNA 沉澱，溶於50微升TE中。待檢查濃度。
9、若無絮狀沉，則把其置-20℃冷凍3 小時（或-70℃冷凍30 分鍾），取出離心10 分鍾（10000rPm），去上清，晾乾，加入50ul TE溶解（取20ul 點樣測定）。
（三）染色體DNA 制備樣品濃度測定
1、按實驗一方法制備瓊脂糖凝膠（0.6%）
2、分別取標准濃度的λDNA 0.05ug、0.1ug、0.15ug、0.2ug，加相應的加樣緩沖液混合好，點樣。
3、取2 微升染色體DNA 樣品點樣(冷凍離心獲取的DNA樣品取50 微升點樣)，打開電泳儀電泳，待溴酚蘭進入凝膠2 厘米後，停止電泳，紫外燈下觀察，估計樣品DNA濃度。
五、結果討論與問題
紫外光下觀察DNA 樣品純度，計算出制備的DNA總量和濃度。
1、SDS 在抽提DNA 過程有哪幾個作用？
2、在本實驗中未加入RNase，那麼樣品中應出現什麼情況？

C. 檢測微生物前如何去除樣品的抑製作用

微生物檢測樣品的處理方法
1. 化妝品微生物檢測樣品的處理（摘至GB7918） 樣品的採集
1.1應數量的包裝單位。檢驗時，應分別從兩個包裝單位以上的樣品中共取10g或10mL。包裝量小於20g的樣品，采樣時可適當增加樣品包裝數量。
1.2 供檢驗樣品，應嚴格保持原有的包裝狀態。容器不應有破裂，在檢驗前不得打開，防止樣品被污染。
1.3 接到樣品後，應立即登記，編寫檢驗序號，並按檢驗要求盡快檢驗。如不能及時檢驗，樣品應放在室溫陰涼乾燥處，不要冷藏或冷凍。
1.4 若只有一個樣品而同時需做多種分析，如細菌、毒理、化學等，則宜先取出部分樣品做細菌檢驗，再將剩餘樣品做其它分析。
1.5 在檢驗過程中，從打開包裝到全部檢驗操作結束，均須防止微生物的再污染和擴散，所用器皿及材料均應事先滅菌，全部操作應在符合生物安全要求的實驗室中進行。
供檢樣品的制備
2.1 液體樣品
2.1.1 水溶性的液體樣品，可量取10mL加到90mL滅菌生理鹽水中，混勻後，製成1：10檢液。
2.1.2 油性液體樣品，取樣品10g，先加5mL滅菌液體石蠟混勻，再加10mL 滅菌的吐溫80，在40℃～44℃水浴中振盪混合10min，加入滅菌的生理鹽水75mL（在40℃～44℃水浴中預溫），在40℃～44℃水浴中乳化，製成1：10的懸液。
2.2 膏、霜、乳劑半固體狀樣品
5.2.1 親水性的樣品：稱取10g，加到裝有玻璃珠及90mL 滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振盪混勻，靜置15min。用其上清液作為1:10的檢液。
2.2.2 疏水性樣品：稱取10g，放到滅菌的研缽中，加10mL滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加入10mL滅菌吐溫80，研磨待溶解後，加70mL滅菌生理鹽水，在40℃～44℃水浴中充分混合，製成1：10檢液。
2.3 固體樣品

D. 做微生物限度方法驗證的時候，樣品不溶於Ph7.0無菌氯化鈉蛋白腖緩沖液，如何處理樣品可以取上清液

可溶於十四烷酸異丙酯么？取規定量，混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯中，劇烈振搖，使供試品充分溶解，如果需要可適當加熱，淡溫度不得超過44度，趁熱迅速過濾。若仍無法過濾，在上一個步驟中加入不少於100ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。望採納，謝謝。

E. 瓊脂怎麼測定凝膠強度

凝膠強度低於1000的都屬於石花菜瓊脂粉，95度水泡一泡就能融化，凝膠強度高於1000的是江蘺菜瓊脂粉，需要開水煮沸才能完全融化。石花菜的彈性好，凝固點低，江蘺菜的硬度好。石花菜的用量大，江蘺菜的用量小，水粉比例400比1就能做出果凍狀，42度凝固。你比照這些特性進行比例小試。青島瓊脂製造有限公司回答。

F. 微生物的測定怎麼取樣和培養基的制定和最後的觀察

問題不夠清楚哦，你要測定什麼，微生物限度，還是已知菌的檢測？
我只能舉例說明哦，是關於葯品的。不明白的你可以Hi我，或追問。
我根據你的問題按步驟來回答。
一、取樣
1、供試品應隨機抽樣。一般抽樣量（2個以上最小包裝單位）為檢驗量的3倍量。
2、對異常的供試品應針對性的抽樣。抽樣時，凡發現有異常或可疑的樣品，應選取有疑問的樣品，但機械損傷、明顯破裂的包裝不得作為樣品。凡能從葯品、瓶口（外蓋內側及瓶口周圍）、外觀看出長蟎、發霉、蟲蛀及變質的葯品，可直接判為不合格，無需在抽樣檢驗。不能以外觀有上述情況而檢查內容物合格，來判斷該葯品合格。
3、供試品收檢後應及時檢驗，若有困難，應存放在該品種規定的儲存條件下（一般為陰涼乾燥處），勿冷藏或冷凍，以防供試品內污染菌因保存條件不妥引起致死、損傷或繁殖。
4、供試品在檢驗之前，應保持原包裝狀態，嚴禁開啟，包裝已開啟的樣品不得作為供試品。
5、供試品的取樣必須在凈化條件下無菌操作，嚴防再污染。（原料葯、裝量大的葯）
6、有劑型檢驗量均需取自2個以上包裝單位（中葯蜜丸、膜劑，除需取自2個以上包裝外，還應取4丸、片以上樣品）。
7、固體及半固體（粘稠性供試品）制劑檢驗量為10克。
8、液體制劑檢驗量為10毫升。
9、膜劑除另有規定外，中葯膜劑檢驗量為30～50cm2 ，化學膜劑及生化葯膜劑檢驗量為 100cm2 。
10、貴重的或微量包裝的供試品檢驗量可以酌減，除另有規定外，口服固體制劑不低於3克，液體制劑採用原液者不得少於6毫升，採用供試液者不得少於3毫升，外用葯品不得少於5克。
二、培養基的制定
1、一般如果是微生物限度的話，有兩種培養基：檢測細菌用營養瓊脂培養基，檢測黴菌及酵母菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養基。
2、另外，如果還有致病菌要求的話，通常革蘭氏陰性腸道菌用伊紅美藍瓊脂培養基（EMB瓊脂），沙門氏菌用沙門氏志賀氏菌屬瓊脂（SS 瓊脂），霍亂弧菌用硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養基（TCBS瓊脂），等等……
3、最後的觀察：通常是計數，如樓上所說的數個數。然後就是菌落形態的觀察，主要有大小、顏色、厚度、邊緣狀態等等。
不過看到你對樓上的追問，我在想，你是不是想問對未知微生物的鑒定，譬如泥土裡的微生物種類、空氣中的微生物種類等？
那是微生物的分離和鑒定，不叫檢測吧。
那樣的話一般是用營養瓊脂培養基和馬丁氏瓊脂培養基。

G. 微生物實驗中不易溶於水的固體樣品怎麼處理

如果本身就是不容性物質，而你還是要用這種物質，在液體里，那隻有直接配製進去，不溶就不溶，微生物可以經過自身的代謝功能，也是可以利用這些沉澱的。比如碳酸鈣，不溶於水，但在乳酸菌發酵過程的培養液中加入它，微生物生產的乳酸可以與與之反應。從而加以利用。
不過，培養是，帶沉澱時的培養液，攪拌返混條件要夠。

H. 為什麼有些產品檢測微生物時要進行融化標准依據是什麼

進行微生物檢測，必須讓樣品的組分完全釋放出來。微生物樣品有些是凝膠狀，微生物會過藏在膠體內，如果不能融化，細菌培養是得不得正確結果的。

I. 微生物限度檢測，不溶於水的樣品如何處理可以取上清液做嗎

非水溶性供試品
方法1 取供試品5g（或5ml )，加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團後，慢慢加人45 ℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1 : 20的供試液。
方法2 取供試品10g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯（製法見附錄XII A無菌檢查法中供試品的無菌檢查項下）和無菌玻璃珠的適宜容器中．必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然後加入45 ℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液100ml，振搖5～10分鍾，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為l : 10的供試液。