葯品微生物沙門菌陽性怎麼做

① 微生物檢驗常見問題解答

微生物檢驗常見問題解答

你知道什麼是微生物檢驗嗎?你對微生物檢驗常見問題了解嗎?下面是我為大家帶來的微生物檢驗常見問題解答的知識，歡迎閱讀。

一、方法驗證

1.做過驗證的樣品微生物檢驗方法是否都需要按照新的方法進行重新驗證?

答：對於微生物限度檢查的產品而言，由於培養時間調整，應重新進行驗證。對於無菌檢查的產品而言，如果方法未作實質性調整，可以不必重新驗證。個別產品在各論中收載了新的無菌檢查方法，對這些品種，應對收載方法的適用性進行驗證。

2. 以前做過無菌驗證的品種是否需要重新按照新的標准再驗證?

答：參見問題1。

3. “新增抗生素供試品應選擇低吸附的濾器及濾膜” 比如注射用克林黴素磷酸酯屬於抗生素，是否需要重新選取濾膜再驗證?

答：目前採用的方法如果經驗證表明可行，則可以繼續使用該方法。

4. 微生物方法學驗證時，培養時間是否跟樣品日常檢驗所培養時間一致?

答：應該一致。

5. 微生物限度驗證時，如果一個方法只有金葡回收率達不到要求，該方法時是否可以用來做細菌黴菌的檢測方法?

答：按葯典的規定，一個計數方法通過驗證，是指所有試驗菌的回收率均達到要求。如果採用各種方法以及方法的組合仍無法使金葡回收率達標，則可以採用使金葡回收率最高的方法作為計數方法。

6. 薄膜過濾的沖洗量不能超過1000ml，我公司的喹諾酮類產品原來的方法是每張膜沖洗量為1500和2000ml，請問有沒有合適的方法將沖洗量降至1000，各菌的回收率仍能符合規定?

答：有幾種辦法可以降低沖洗劑的用量：1)降低接觸濾膜的供試品的濃度;2)改進沖洗的方式，如少量多次地沖洗、降低蠕動泵的轉速等;3)添加中和劑，如高價金屬離子。

7. 微生物限度檢查法規定，技術方法驗證時，採用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那麼選擇回收率最接近要求的方法和試驗條件進行供試品檢驗。請問，上述方法是指僅通過一種方法還是一定要通過幾種方法聯用的?

答：應該要把可能採用的所有方法包括方法聯用都進行驗證。

8. 供試品不溶於稀釋劑，同時又有抑菌性，限度檢查時應如何消除抑菌性?

答：採用低速離心的方式，盡可能把供試品去除干凈，取離心後的上層液，進行薄膜過濾。

9. 不溶於水的固體產品，加表面活性劑後，如何操作才能在方法驗證中得到較好的回收率?

答：同問題8。

10. 有些品種2010年葯典與2005年比較檢驗方法變了，是否需要驗證或確認?

答：同問題1。

二、菌種管理

1. 濃菌液的有效期該如何確定?

答：葯典沒有規定。可以通過實驗確定有效期。例如，在不同的時間點測定濃菌液的濃度，從而判斷其有效期。

2. 葯典要求菌液在制備後2小時內使用，若保存在2-8℃的菌懸液可在在24小時內使用，那我們在做驗證或陽性對照是要加一定量的菌就沒有時間進行平板計數了，該如何確保所加菌量准確?

答：葯典對稀釋菌液的使用期限作出規定，並不會影響操作過程中稀釋菌液的加入。即便不規定，也無法在准確知道菌液濃度的情況下加入試驗菌。菌液稀釋的實驗操作和加入菌液的實驗操作應該是在同一次實驗中完成的，要使加入的菌量符合葯典的規定，可以從濃菌液的制備方法、菌液稀釋的方法等方面進行規范，也可以引入濁度比較的方法。

3. 菌懸液能否在倒平板之前確定菌含量?

答：活菌含量是無法確定的。總菌量可以通過比濁的方式確定。

4. 具體從哪些方面進行菌種菌株的特性和純度確認?如何操作?

答：基層的微生物實驗室進行菌種純度確認可以考慮以下一些方面：1)形態學鑒定，包括菌落形態和染色形態;2)生化鑒定，可以考慮使用API鑒定系統。

5. 黑麴黴凍干菌種如何轉種，傳代?

答：與其他菌種一樣，所不同的是使用的培養基應改為改良馬丁瓊脂培養基。

6. 乾粉狀的是否可做第0代使用?

答：只要是菌種保藏機構提供的凍干保藏的菌種，可以確定為第0代。

7. 菌種每次傳代都要做純度、特性等的確認嗎?

答：從外部購入的菌種，在進入本實驗室的菌種保藏體系時，需要進行純度和特性的確認。以後的每次傳代，可以通過顯色培養基做簡單的確認即可。

8. 如採用低溫保存菌種，需購買哪些設備?能夠到省所進行實際操作培訓?

答：低溫冰箱，應能夠提供-70℃的低溫。可以到省所來培訓。

9. 做方法驗證時，工作用菌種能否同時操作，如何防止交叉污染?

答：可以同時操作。避免交叉污染的關鍵是無菌操作技術。

10. 是否等菌懸液的含菌數出結果後再做適用性等檢查?

答：沒有必要。可參見問題2。

11. 菌液制備中菌液是否都要驗證儲存期?

答：稀釋菌液可參考葯典規定。如要保存濃菌液，則需要驗證有效期。

12. 菌種CMCC是否可以用ATCC替代，從省所或中檢所購買的菌種是否每次都可以出具規范的COA?

答：中國葯典使用CMCC的菌種，並沒有規定可以使用其他等效的菌種。省所提供的菌種嚴格講屬於標准貯備菌種，無法提供ATCC這樣的COA。CMCC至今也無法提供這類證明。

13. 銅綠假單胞如何保藏?答：可以使用低溫冷凍保存的方法。14. 工作用菌液是否屬於亞培養或傳代一次?

答：工作用菌液應屬於一次傳代。

三、微生物限度

1. 包裝材料的大腸埃希菌檢查?

答：根據包裝材料的不同，大腸埃希菌的檢查方法大致有兩種，一種是將浸提液合並後，取一部分，接種膽鹽乳糖培養基進行檢查;另一種是將浸提液合並後，薄膜過濾，然後按規定的方法檢驗。

2. 抗真菌葯品的微生物限度檢查法

答：這類產品的黴菌和酵母菌計數方法需要進行調整，可以根據產品劑型的不同，選擇薄膜過濾法或培養基稀釋法等方法。

3. 為什麼在日常樣品檢測中還需要做陽性對照(國外不需要)?

答：為了確保每一次檢測對可能存在的微生物都是有效的`。

4. 對於同一個品種，葯典為什麼不規定統一的檢測方法?

答：本版葯典進行過這樣的嘗試，也有某些品種已經收載了統一的檢測方法，如注射用頭孢類抗生素的無菌檢查。之所以沒有大量收載，主要是由於檢測方法還沒有經過必要的復核。將微生物檢驗的統一方法收載在品種的各論項下，始終是努力的方向。

5. 梭菌檢查中需置厭氧條件下培養48小時，是否指在厭氧培養箱中?

答：需要在厭氧培養裝置中進行培養，未必一定是厭氧培養箱。

6. 控制菌檢查方法驗證時，採用多種方法均未檢出控制菌，如何處理?

答：在確保所使用的各種方法都沒有錯誤的情況下，如果仍無法使試驗菌生長，則應該採用薄膜過濾法進行檢查。理由是該方法能夠最大程度地去除產品的抑菌作用。

7.常規的監督抽樣檢品(包括原料)在進行微生物限度檢查時，是否一定要進行活蟎檢查並在原始記錄與報告書中體現?

答：需要進行檢查。可以在原始記錄中體現，報告書上可以不出現，除非當發現有活蟎檢出。

8. 葯包材微生物限度檢查規定了合格質量水平，通常產量下取樣8個，要求8個瓶子均符合規定，如何進行?

答：每個瓶子分別進行實驗。

9. 大腸埃希菌具體操作規程?

答：參見中國葯品檢驗標准操作規程。

10. 動物組織及動物類原葯材的提取物入葯，是否需要檢沙門菌?

答：需要進行沙門菌檢查。

11. 關於中國葯典菌落計數結果的判斷還存在疑義，望能舉例說明。

答：不清楚所指的存在疑義是指哪方面。2010年版對結果報告進行了較大篇幅的修訂，目前的規定應該比05版更為清晰、明確。

12. 需做沙門菌檢驗樣品量的確定?

答：10g(ml)用於樣品計數檢驗和其他控制菌檢查，10g(ml)用於沙門菌檢查，10g(ml)用於沙門菌檢查的陽性對照。需要進行沙門菌檢查的樣品，檢驗用量應為30g(ml)。

13. 日常的實驗室裝備能否達到梭菌無氧的培養要求?

答：完全可以。可以採用厭氧培養盒(罐)。

14. 如果一個產品有兩個規格，是否可以取其中之一做陽性對照?

答：每個規格均需進行陽性對照。

15. 細菌數為100g/g的，樣品稀釋級只做1:10,1:100的倍數就可以了嗎?

答：可以。

16. 培養時間3天，5天，可理解為72小時，120小時嗎?

答：可以。這樣更為嚴謹。

17.中國葯品檢驗標准操作規范“已做驗證試驗的供試品，在檢查時刻不必再做陽性對照”如何理解?

答：該標准操作規范中在無菌檢查法中規定“供試品無菌檢查應進行陽性對照試驗”，表明不論是否進行了方法驗證，在產品的每一次檢驗過程中，還必須進行陽性對照。在控制菌檢查的大腸埃希菌項下，指出“已做驗證試驗的供試品，在該供試品檢查時不必再作陽性對照”。該規定僅適用方法驗證與供試品檢查同時開展的情況。2005年版葯典和2010年版葯典在控制菌檢查中均對陽性對照試驗有明確規定，“進行供試品控制菌檢查時，應做陽性對照試驗。”產品檢驗中應以葯典規定為准。

18. 無菌檢查和微生物限度檢查中，產品中規定的溶解液是否可以換成其他的溶液?

答：可以。

19. 制劑通則中，沒有微生物檢查項目的，是否可不進行微生物項目檢測?

答：可以。主要是二部制劑通則中口服片劑、膠囊劑、丸劑和顆粒劑。

20. 在細菌、黴菌和酵母菌計數中，適用性檢查細菌是培養48小時，黴菌和酵母菌是培養72小時，供試品檢查中細菌是培養3天，黴菌和酵母菌是培養5天，那方法驗證中應參照哪個時間進行培養。

答：應按照供試品檢驗時的條件，即細菌3天，黴菌和酵母菌5天。

21. 測定純化水微生物限度時，每張濾膜過濾量是多少合適?需要先稀釋嗎?過濾完後需不需要沖洗?假如我取10ml純化水通過雙杯體封閉式薄膜過濾器過濾，每張濾膜上的計數是以5ml為單位還是10ml為單位?

答：過濾量應以培養後出現的微生物數不超過100cfu/膜為標准。一般可不稀釋。不需要沖洗。每張濾膜的過濾量為5ml。

22. 2010葯典中關於純化水的微生物限度是：細菌、黴菌及酵母菌總數每1ml不得過100個。這句話的意思是細菌總數每1ml不得過100個，黴菌及酵母菌總數不得過100個，還是細菌+黴菌+酵母菌總數每1ml不得過100個。如果是三者總數的話，那細菌總數限度是多少?黴菌及酵母菌總數限度又是多少?

答：是總數不得過100個。沒有必要考慮各自的限度值。

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② 怎樣快速准確檢測出食品中生長微生物的是否是沙門氏菌

沙門氏菌屬腸道細菌科，包括那些引起食物中毒、導致腸胃炎、傷寒和副傷寒的細菌。能引起食物傳播性疾病，近年來，已經成為最常見的食物中毒原因。腸炎沙門氏菌感染通常源於奶製品、禽產品和肉產品；雞肉和雞蛋尤其是高風險食品。沙門氏菌感染的症狀通常是腸胃出現問題，包括惡心、腹部絞痛、嘔吐和腹瀉，一般最多持續7天。在免疫力低下的人群中，如果不及時服用抗生素類葯品，沙門氏菌感染將導致生命危險。三方圓沙門氏菌測試片（FilmplateTM Salmonella BS205）含有選擇性培養基、沙門氏菌特有辛酯酶的顯色指示劑和高分子吸水凝膠，運用微生物測試片專有技術，做成一次性快速檢驗產品，一步培養15～24h就可確認是否帶有沙門氏菌，非常適合各級檢驗部門和食品企業使用。本產品適用於肉和肉產品、蛋及蛋製品、冷飲等的快速檢測。

操作方法:
1、樣品處理：取樣品25mL（g）放入含有225mL滅菌磷酸緩沖液稀釋液（或生理鹽水）的取樣罐或均質杯內，製成1:10的樣品勻液。
2、接種：將沙門氏菌測試片（BS205）置於平坦實驗檯面，揭開上層膜，用無菌吸管吸取1mL樣品勻液慢慢均勻地滴加到紙片上，然後再將上層膜緩慢蓋下，靜置10s左右，使培養基凝固，每個樣品接種兩片。同時做一片空白陰性對照。
3、培養： 將測試片疊在一起放回原自封袋中並封口。透明面朝上水平置於恆溫培養箱內，堆疊片數不超過12片。培養溫度為36℃±1℃，培養15～24h。

結果判讀:
對測試片進行觀察，呈紫紅色的菌落為沙門氏菌；呈藍色的菌落為其他菌群。出現陽性菌落的樣本，最好用其他更為可靠的方法進行驗證，沒有條件的至少要再取樣重復檢驗一次。

③ 如何實現快速檢測及有效控制沙門氏菌

沙門氏菌(Salmonella)是一種革蘭氏陰性腸桿菌, 也是腸桿菌科中最主要的食源性致病菌。據有關資料統計由沙門氏菌引起的疾病病例在病原菌食源性疾病病例中所佔比例已超過三分之二，2007年發生的「 花生醬事件」以及 2008 年發生的「 西紅柿 事件」等[1]沙門氏菌中毒事件的發生也使得食品中沙門氏菌的檢測受到人們的普遍關注。本文主要是對食品中沙門氏菌的傳統檢測方法以及後續建立的以分子生物學、免疫學、生物感測器和電化學為基礎的快速檢測方法進行了系統的綜述，旨在為該致病菌的檢測方法的研究應用提供一定的參考。
1、 傳統的檢測方法（國標法）
目前, 我國對食品中沙門氏菌的檢測大多採用GB 4789.4-2010《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》對食品樣品進行檢測，這種傳統的培養方法可分為前增菌、增菌、分離培養、生化試驗和血清學鑒定等步驟進行。雖然傳統培養法可靠性高，但是其操作繁瑣且耗時費力，並不能滿足食品快速檢測的要求。
2、分子生物學檢測方法
2.1聚合酶鏈反應技術
PCR技術是一項敏感性高、特異性強且快速准確的微生物檢測技術，也被許多學者用於對食品中沙門氏菌進行檢測和研究。汪琦等[2]就採用傳統培養方法 、BAX(r)方法和PCR 方法 3 種方法對沙門氏菌進行檢測。在常規PCR的基礎上宋東曉[3]建立了檢測食品中沙門氏菌的新的PCR方法——多重PCR。此外其他新的PCR技術也運用於食品中沙門氏菌的檢測，鍾偉軍[4]通過對熒光定量PCR反應體系和反應條件的摸索,建立了檢測沙門氏菌的核酸熒光定量PCR方法，此研究為食品中沙門氏菌快速檢測試劑盒的研製打下了良好的基礎。
2.2核酸探針技術
核酸探針技術是根據核苷酸鹼基互補的原理,在已變異的DNA樣品中加入用同位素等標記的DNA特異片段，在一定條件下兩片段進行雜交從而達到檢測DNA的目的。此技術不僅簡便、快速而且敏感性高、特異性強，已用於食品中沙門氏菌的檢測。Almeida等[5]通過建立一種新穎的肽核酸探針結合熒光原位雜交方法對血液、糞便、水以及嬰兒奶粉樣品中沙門氏菌進行了檢測，准確度高達 100%。
2.3基因晶元技術
基因晶元技術是利用已知核酸序列的探針與靶核苷酸序列雜交，然後通過信號檢測對其進行定性與定量分析，在沙門氏菌等各種致病菌的分析檢測中有很好的應用前景。饒寶等[6]通過建立檢測致病菌的基因晶元檢測方法，設計了通用引物和特異性探針: 沙門氏菌探針、大腸桿菌探針和金黃色葡萄球菌探針,實現了同時檢測並區分沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的目的。祝儒剛等[7]運用多重 PCR 結合基因晶元技術建立了檢測肉及肉製品中的大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和單核細胞增生李斯特菌等5種食源性致病菌的快速檢驗方法。
2.4噬菌體裂解技術
噬菌體有特異性裂解細菌的作用。張碧波等學者利用此技術進行沙門氏菌
快速檢測，結果和其他學者相同，據此得出特異性噬菌體可以檢測出沙門氏菌，此法方便可行。姜琴等[8]利用噬菌體裂解對150份食品樣品進行快速檢測，結果說明腸桿菌科噬菌體組合對培養10h的沙門氏菌敏感性和特異性較高，這對實現沙門氏菌實時、快速而准確的檢測有重要意義。
2.5環介導等溫擴增技術（LAMP）
環介導等溫擴增技術是2000年Notomi等開發的一種新的恆溫核酸擴增方法,此方法的特點是特異性強、靈敏度高且簡單、快速,適合對大規模樣品的快速檢測[9]。李佳桐[10]通過實驗建立了沙門氏菌的LAMP檢測方法,並將此方法與常規PCR進行比較,結果顯示：LAMP方法對沙門氏菌的檢測恆溫65℃下只需要40min,只擴增沙門氏菌,不會擴增其他革蘭氏陰性菌,最低可檢出濃度10cfu/mL,比常規PCR的最低檢出濃度高1個數量級,通過添加熒光染料SYBR Green Ⅰ,能夠快速簡便的觀察檢測出綠色的陽性結果十分明顯的區別於橙色的陰性結果。
3、免疫學方法
3.1酶聯免疫吸附技術
酶聯免疫吸附法簡稱 ELISA， ,此技術敏感性高 ,不需特殊設備 ,結果觀察簡便，早在1977年就有報道將酶聯免疫吸附法用於食品中沙門氏菌的檢測。伍燕華等[11]設計捕獲抗體和檢測抗體，建立快速檢測沙門氏菌雙抗夾心ELISA方法對食品中的沙門氏菌進行檢測。張帥等[12]建立雙抗夾心ELISA體系，檢測模擬污染肉樣中沙門氏菌,其檢測限為800CFU/g，等均並與其他血清型沙門氏菌、單增李斯特菌等菌均無交叉反應,特異性良好。
3.2免疫熒游標記技術
免疫熒游標記技術是根據抗原抗體的特異性反應，將熒光素標記在已知抗原(或抗體)上,與特異抗體(或抗原)結合後產生熒光，可用來定位抗原或抗體、並通過定量分析，確定測定含量。葉明強[13]基於納米免疫磁珠富集,免疫量子點標記,建立了一種食品中沙門氏菌的含量進行快速檢測的方法，研究出了一種新型的免疫熒光食源性致病菌檢測技術。
3.3斑點免疫金滲濾法
免疫膠體金技術是以膠體金作為標記物結合免疫原理的一種應用於抗原抗體的新型技術，該技術運用最廣泛的就是斑點免疫金滲濾法（DIGFA）。孔繁德等及曹春梅等都利用此技術對沙門氏菌的快速檢測進行了研究，曹春梅等[14]是利用斑點免疫金滲濾法對沙門氏菌O9抗原進行了研究，結果表明此法簡單、快速，適合推廣運用；孔繁德等[15]是通過建立直接檢測沙門氏菌的斑點免疫金滲濾法檢測試紙盒對該菌進行了研究。
3.4免疫磁性分離技術
免疫磁珠分離技術是將特定病原體的單抗或多抗與磁珠微球偶聯，並通過抗原抗體反應形成磁珠，在外加磁場作用下磁珠會發生定向移動，從而達到分離目標病原體的作用。食品樣品中致病菌含量很少，常規的方法是很難從中分離出來的，藉助免疫磁性分離技術可以達到快速分離的目的。王海明等[16]應用磁免疫技術建立快速檢測食源性沙門氏菌的方法，結果表明此方法能對食品基質中的目標菌進行快速有效的富集,其檢測限<10cfu/25g,檢測周期約為40小時。胡霏[17]也通過實驗針對鼠傷寒沙門氏菌建立免疫磁分離技術結合熒光層析技術的快速檢測方法。
4、生物感測器技術
生物感測器是利用一些生物活性物質如酶 、多酶體系 、抗體等做為敏感器件，然後配以適當的信號傳導器所構成的分析檢測的工具。我國學者已採用此法對沙門氏菌的抗原、抗體的免疫吸附進行檢測，並已用於快速檢測食品中致病的沙門氏菌，而僅需 1h 完成，達到了快速的檢測目的。寧毅[18]在對碳納米管性質研究的基礎上,結合分子探針構建了碳納米管生物感測器，並將其用於沙門氏菌的檢測，結果顯示所構建的感測器靈敏度高、特異性強、穩定性好。
5、電阻抗技術
電阻抗法是近年發展起來的一項生物學技術，因為具有檢測速度快、靈敏度高、准確性好等優點，目前此法已用於食品中沙門氏菌檢測檢驗並已通過美國公職分析化學協會(AOAC)認可。陳廣全等[19]建立了電阻抗法快速檢測食品中沙門氏菌的方法，並將其與常規培養法進行比較，對食品中的沙門氏菌屬進行檢測,結果表明電阻抗法比傳統培養法更加快速、可靠。
6、總結
綜上所述，沙門氏菌檢驗技術正從傳統的培養方法向分子檢測方法改進，並向儀器化、標准化、自動化方向發展，並且食品安全、致病菌等問題對人類健康以及生活環境都造成了嚴重威脅，加強沙門氏菌檢測勢在必行。目前沙門氏菌快速檢測技術大多具有檢測迅速、靈敏度高、特異性強等特點，此外這些方法還具有各自的優點和局限性，在未來發展過程中需要我們不斷改進和創新，建立更成熟可靠、方便快捷的沙門氏菌快速檢測技術。

④ 實驗室對沙門菌和志賀菌做血清凝集實驗該怎麼做求具體步驟！

(1).
志賀菌屬的分型鑒定：凡生化反應符合志賀菌屬者均需做血清學鑒定。取1環志賀菌四種多價血清於載玻片一端，再取少許待測菌與之混合，同時在玻片另一端取待測菌與生理鹽水混合對照。結果：對照呈均勻混濁，待檢菌與志賀菌四種多價血清混合後，數分鍾內出現肉眼可見的顆粒狀凝集物即為陽性。繼之用A、B、C、D群最常見的單價血清凝集定種。結果判斷、解釋和報告：①分離培養未見可疑菌落或經鑒定不符合志賀菌屬鑒定依據者可報告「未分離到志賀菌屬細菌」。②經分離鑒定後符合鑒定依據者，可報告「分離出××志賀菌」，若進一步做多種生化反應及因子血清分型後，可報告：「分離出××志賀菌×型」。(2)沙門菌屬的分型鑒定：如果生化反應及形態學檢查疑為沙門菌，可選用沙門菌的多價診斷血清進行玻片凝集。首先選用A～F組多價「O」診斷血清做玻片凝集試驗。在試驗時應以生理鹽水作對照。血清凝集試驗在5～10min內不出現凝集者可確定為陰性。但若生化反應比較典型，應考慮選用Vi凝集試驗。若凝集，則用無菌生理鹽水將菌洗下，製成濃厚的懸液，加熱100℃、30min，再與A～F組多價「O」診斷血清做凝集試驗。若與A～F組多價「O」血清發生凝集，應再與沙門菌單價因子血清分別做玻片凝集試驗，以確定該菌株屬於哪一組。一般先選用本地區檢出率最高菌型的相應血清做玻片凝集反應。若已確定哪一沙門菌種後，再分別先用H因子血清檢查第I相抗原，然後檢查第Ⅱ相抗原，最後確定該菌種屬於哪一型沙門菌。結果判斷、解釋和報告：①分離培養未發現可疑菌落或經鑒定不符合沙門菌屬細菌鑒定依據者，可報告「未分離出沙門菌」。②生化反應符合沙門菌、玻片凝集試驗結果陽性，可初步報告為：「分離到××沙門菌」，或「×群沙門菌」。——源自網路

⑤ 有了沙門氏菌該怎麼辦

沙門氏菌病的病原體。屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌。已發現的近一千種(或菌株)。按其抗原成分，可分為甲、乙、丙、丁、戊等基本菌組。其中與人體疾病有關的主要有甲組的副傷寒甲桿菌，乙組的副傷寒乙桿菌和鼠傷寒桿菌，丙組的副傷寒丙桿菌和豬霍亂桿菌，丁組的傷寒桿菌和腸炎桿菌等。除傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌和副傷寒乙桿菌引起人類的疾病外，大多數僅能目引起家畜、鼠類和禽類等動物的疾病，但有時也可污染人類的食物而引起食物中毒。

沙門氏菌檢測方法
自19世紀後期，沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原以來，檢測方法學都是建立在採取感染病人的糞便或血液作為臨床病料的基礎上。此後的60年間，用於從食品中分離沙門氏菌的方法實質上與那些用於臨床病料的方法是相同的。但至少有三個因素限制了用於臨床病料的方法應用在食品分析上。第一，通常，沙門氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性質會干擾病原的檢測，例如，某些食品中固有菌群可能處在一個很高的水平，從而影響特定細菌的選擇性分離和鑒定；第三，與臨床病料不同的是，經過加工的食品，由於加熱、乾燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用，其中的沙門氏菌受到了尚不致命的損傷或稱「致傷」。這就形成了一個具有不同生長特性的細菌群。這種現象對那些希望從食物樣品中分離出沙門氏菌的食品分析家來說有很大影響，因為在選擇培養基上直接培養「致傷」的沙門氏菌通常是以細菌死亡和試驗失敗而告終。為克服這些困難，人們建立了一種簡單的微生物增殖步驟，專門針對以食品為傳播載體的病原。雖然這些方法本身證明是可靠的，但卻很費力、耗時，需要4～7天才能完成。因此，在需要及時、快速評價食品中微生物的安全性時，通常不被採用。隨著DNA和抗體技術的發展，近10～15年間發展了無數改進的方法，其中許多可以在48h內檢出沙門氏菌，這些方法通稱為快速檢測。
1、傳統的培養方法
用於沙門氏菌分析的傳統方法是食物樣品分步增菌，以增加病原的可檢出率，這種培養方法總體可分4個不同階段或步驟。第一步(預增菌)，將樣品加到一種高營養、無選擇性的培養基中，溫度37℃，使那些「致傷」的細菌復甦及使所有微生物生長。雖然緩沖腖水被建議常規使用(由於其可保持溶液pH值穩定)，但對培養基的選擇仍存有爭論。第二，是選擇性增菌步驟，它使沙門氏菌生長而使肉湯中同時存在的微生物數量減少，與預增菌培養基相似，對選擇性培養基的選擇，也存在許多不同的觀點。目前應用的主要有如下3種類型：連四硫基鹽肉湯(Tetrathionatebroth)、硒酸鹽胱氨酸肉湯(Selenitecystinebroth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培養基。由於沒有任何一種培養基可以全面地保持所有食品基質或各種沙門氏菌血清型，所以，較適當的做法就是使用兩種培養基平行地進行試驗。第三步是分離步驟，即選擇性培養物在含一種或多種抑制非沙門氏菌生長制劑的瓊脂平板上劃線培養，然後對平板上肉眼可見的特徵性菌落進行確認，並對該菌落分離物進行一系列生化和血清學檢測，以作出鑒定。傳統沙門氏菌檢測法全過程需時至少4～7天，才能得出明確的診斷結果。
2、以抗體為基礎的檢測方法
利用抗原-抗體反應的顯著特異性，來進行細菌的鑒別和血清學定型，已有半個多世紀的歷史。細菌菌體或鞭毛抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來檢測以食品為載體的病原。已經建立的沙門氏菌免疫學檢測方法有許多種，大致可分為以酶標抗體(ELISA)，熒光抗體染色(免疫熒光法)，同位素標記抗體(放射免疫試驗)為基礎的方法及其它多種以抗體為基礎，利用乳膠凝集、免疫感測器、免疫擴散及免疫色譜技術的方法。但常規中最廣泛採用的是以雙位點ELISA技術即夾心ELISA為基礎的方法。此法改進後用有放射活性的同位素替代標記抗體，概括地說，是指以固定在固體基質上的「捕捉」抗體來捕捉目標抗原，經洗滌除去未結合的成分，加入第二種酶標抗體，此者結合在捕捉到的抗原的不同位點上，第二次洗滌後加入酶作用基質，並令其與顏色成分反應，然後用分光光度法即很容易檢測到目標抗原。採用微量滴定板作為固態基質使反應形式標准化，並促成其自動化。
黎兆滾等人首次在國內口岸系統應用微量板ELISA法(Salmonelletest1)對進出口動物產品(魚粉、肉骨粉等)進行沙門氏菌檢測。該法採用預先包被了沙門氏菌(A-E群)單克隆抗體的微量板，加入經增菌處理的樣品，反應後再加入一定的指示劑，作用畢後用酶標儀測定OD值來判定結果。食物樣品經適當的增菌處理，也可用此法進行沙門氏菌檢測。ELISA法檢出沙門氏菌的極限范圍在105～106個細胞/ml，因此，要得出可靠的結果，食物樣品首先必需進行預增菌、選擇性增菌，通常還要在含有D-甘露糖的肉湯(M肉湯)中進行後增菌，以促進鞭毛發育。總的來說，標準的ELISA法樣品的制備，約需要經過40～48h的孵育才能完成。黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonellatest1)樣品制備過程分三步，共耗時24h：①選用營養肉湯進行預增菌(6h)，使「致傷」、冷凍的沙門氏菌復甦。②使用選擇性培養基RV進行增菌(14h)，使沙門氏菌大量繁殖，同時抑制其它雜菌生長。③使用營養肉湯(蛋白腖水)進行後增菌(4h)，使沙門氏菌的數量大大增加。比上述標準的ELISA法樣品制備過程縮短了一半的時間。ELISA方法本身，則僅需要大約2h而已(其中30min是操作時間，90min是孵育時間)。相比之下，黎兆滾等人的方法可在27h內完成，比上述方法縮短了一半的時間，頗值得推廣應用。最新式的沙門氏菌免疫學檢測法，利用經特異性抗體敏化的免疫色譜卡片為基礎。幾滴樣品加到卡片上，結果可以直接用肉眼讀出。免疫色譜卡片極易操作，且由於無需要特殊設備，很適合小型實驗室使用。盡管卡片檢測法與ELISA法一樣需要對樣品進行增菌處理，但它(卡片法)本身通常需時不超過10min，如果採用黎兆滾等人的樣品制備法，則可使操作時間更為縮短。
3、以核酸為基礎的方法
細胞核酸DNA和RNA是唯一一類可以攜帶信息的大分子。由於所有的細胞都含有這種分子，可以利用它作為檢測的標靶。標靶通常是一個特異性核酸序列，它可通過以補體核酸分子作為探針來檢出。與免疫學方法相似，探針也需要加附適當的標記，如放射性同位素、酶或發光的標識物。Fitts等人在食品沙門氏菌檢測中引入了第一代DNA—RNA雜交技術，此法應用的探針含有用放射性同位素標記的傷寒沙門氏菌DNA片段，其敏感性高，經大約48h的增菌步驟後，檢測極限可達108個細菌/ml，但由於要使用放射性同位素，只能在專門的實驗室應用，此方法的優點都被抵消了。為此，以核酸雜交為基礎的第二代技術—比色計目前已發展起來。這種方法依賴於沙門氏菌核糖體RNA(rRNA)—核糖體發育過程中儲存的核酸成分的檢測。核糖體是細胞蛋白質合成器的一部分，每個細菌細胞中存在5000～20000個復制體，而相比之下染色體DNA復制體僅2～10個。這種天然富含rRNA標靶序列的情況使得用無輻射計檢測成為可能，同時又保持了與放射性同位素方法相當或更高的敏感性。其另一優點是由於rRNA為單鏈(而DNA為雙鏈)，雜交前無需經過變性步驟。要得到陽性結果，此法需要105個靶細胞/ml，因此對沙門氏菌檢測來說，需要進行預增菌和選擇性增菌，總共約50h。rRNA探針法比沙門氏菌ELISA法(酶聯免疫檢測法)更耗時，但二者成本相近。食品細菌檢測法的最新進展是在化學擴增體系方面的發展，即聚合酶鏈反應(PCR)，用該體系可對制備好的樣品進行細菌DNA擴增，以便更易於用諸如凝膠電泳法或比色型ELISA法檢測。用於檢測沙門氏菌和其它以食物為載體的病原的PCR方法業已建立，其中一些方法顯示了極好的敏感性。但該法較難自動化，且必需經選擇性增菌以稀釋可能幹擾檢測反應的某些成分。一個完整的以PCR為基礎的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵銷了其高敏感性的優點，但這種方法對那些含沙門氏菌較少或沙門氏菌「致傷」嚴重難以復甦而仍保有沙門氏菌rRNA的樣品尤其有效。

⑥ 葯品領域的微生物檢測及標准

中國葯典微生物限度檢查法，為《中國葯典》附錄收載的關於葯品微生物檢查的法定方法。葯品的不同劑型的微生物檢測標准不同，具體如下：

1、制劑通則品種

制劑通則、品種項下要求無菌的制劑及標示無菌的制劑應符合無菌檢查法規定。

2、口服給葯制劑

細菌數每1g不得過l000cfu。每lml不得過100cfu。

黴菌和酵母菌數每lg或lml不得過100cfu。

大腸埃希菌每1g或lml不得檢出。

3、耳、鼻及呼吸道吸入給葯制劑

細菌數每1g、lml或l0cm²，不得過100cfu。

黴菌和酵母菌數每1g、lml或l0cm²，不得過10cfu。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每1g、lml或l0cm²不得檢出。

大腸埃希菌鼻及呼吸道給葯的制劑，每1g、lml或l0cm²，不得檢出。

4、陰道、尿道給葯制劑

細菌數每1g、lml或l0cm²，不得過100cfu。

黴菌數和酵母菌數每1g、lml或l0cm²應小於10cfu。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌每1g、lml或l0cm²，不得檢出。

5、直腸給葯制劑

細菌數每1g不得過l000cfu。每lml不得過100cfu。

黴菌和酵母菌數每1g或lml不得過100cfu。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每lg或lml不得檢出。

6、其他局部給葯制劑

細菌數每1g、lml或l0cm²不得過100cfu。

黴菌和酵母菌數每1g、lml或l0cm²不得過100cfu。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每1g、lml或l0cm²不得檢出。

7、含動物組織

含動物組織（包括提取物）的口服給葯制劑每10g或10ml還不得檢出沙門菌。

8、兼用途徑制劑

應符合各給葯途徑的標准。

(6)葯品微生物沙門菌陽性怎麼做擴展閱讀

微生物限度檢查法的注意事項：

1、當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所採用的方法適合於該產品的控制菌檢查。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，檢查方法應重新驗證。

2、檢查項目應當包括細菌數、黴菌數、酵母菌數及控制菌檢查。

3、微生物限度檢查應在環境潔凈度10000 級下的局部潔凈度100 級的單向流空氣區域內進行。

4、檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染。單向流空氣區域、工作檯面及環境應定期按《醫葯工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標准進行潔凈度驗證。

5、除另有規定外，本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為30℃～35℃；黴菌、酵母菌培養溫度為23℃～28℃。

6、檢驗結果以1g、1ml、10g、10ml、10c㎡ 為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。

⑦ 中國葯典中葯物微生物檢測在哪部

你好，微生物檢測方法在中國葯典2010年版二部附錄XI J，具體方法為附錄XI J微生物限度檢查法
微生物限度檢査法系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔
料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數、黴菌數、
酵母菌數及控制菌檢查。
微生物限度檢查應在環境潔凈度10 000級下的局部潔
凈度100級的單向流空氣區域內進行。檢驗全過程必須嚴格
遵守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品
中微生物的檢出。單向流空氣區域、工作檯面及環境應定期
按《醫葯工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方
法》的現行國家標准進行潔凈度驗證。
供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活
劑，應證明其有效性及對微生物無毒性。
除另有規定外，本檢査法中細菌及控制菌培養溫度為
30〜35°C;黴菌、酵母菌培養溫度為23〜28°C
檢驗結果以lg,lml、10g、10ml或10cm
2為單位報告，特
殊品種可以最小包裝單位報告。
檢驗量
檢驗量即一次試驗所用的供試品量(g、ml或cm
2
)。
除另有規定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml;膜劑
為100cm
2
»貴重葯品、微量包裝葯品的檢驗量可以酌減。要
求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應增加20g或20ml(其中
10g或10ml用於陽性對照試驗）。
檢驗時，應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑
還不得少於4片。
一般應隨機抽取不少於檢驗用量（兩個以上最小包裝單
位）的3倍量供試品。
供試液的制備
根據供試品的理化特性與生物學特性，採取適宜的方法
制備供試液。供試液制備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不
應超過451C。供試液從制備至加人檢驗用培養基，不得超過
1小時。
除另有規定外，常用的供試液制備方法如下。
1. 液體供試品
取供試品10ml ，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至
100ml，混勻，作為1 ： 10的供試液。油劑可加人適量的無菌
聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混
合的供試品原液作為供試液。
2. 固體、半固體或黏稠性供試品
取供試品10g ，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至
100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1 ： 10的供試
液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80，並置水浴中適當加溫
使供試品分散均勻。
3. 需用特殊方法制備供試液的供試品
(1) 非水溶性供試品
方法1取供試品5g(或5ml)，加至含溶化的（溫度不超
過45'C)5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無
菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團後，慢慢加人45"的
pH7. 0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供
試品充分乳化，作為1 ： 20的供試液。
方法2 取供試品10g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙
酯（製法見附錄H H無菌檢査法中供試品的無菌檢查項下）
和無菌玻璃珠的適宜容器中，必要時可增加十四烷酸異丙酯
的用量，充分振搖，使供試品溶解。然後加人45\：的pH7.0
無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液100ml,振搖5〜：L0分鍾，萃取，靜
置使油水明顯分層，取其水層作為1 •• 10的供試液。
(2) 膜劑供試品.
取供試品100cm
2
，剪碎，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩
沖液lOOmK必要時可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為1 ： 10的
供試液(3) 腸溶及結腸溶制劑供試品
取供試品10g,加pH6. 8無菌磷酸鹽緩沖液（用於腸溶制
劑）或pH7. 6無菌磷酸鹽緩沖液（用於結腸溶制劑）至100ml，
置45t:水浴中，振搖，使溶解，作為1 :
10的供試液。
(4) 氣霧劑、噴II劑供試品
取規定量供試品，置冰凍室冷凍約1小時，取出，迅速消
毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鑽一小孔，放至室
溫，並輕輕轉動容器,使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器
吸出全部葯液，加至適量的PH7. 0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液
(若含非水溶性成分，加適量的無菌聚山梨酯80)中，混勻，取
相當於10g或10ml的供試品，再稀釋成1 ： 10的供試液。
(5) 貼劑供試品
取規定量供試品，去掉貼劑的保護層，放置在無菌玻璃或
塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗
布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然後將其置
於適宜體積並含有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的
稀釋劑中，用力振盪至少30分鍾，製成供試液。貼劑也可采
用其他適宜的方法制備成供試液。
(6) 具抑菌活性的供試品
當供試品有抑菌活性時，採用下列方法進行處理，以消除
供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。
① 培養基稀釋法取規定量的供試液，至較大量的培養
基中，使單位體積內的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測
定細菌、黴菌及酵母菌的菌數時，取同稀釋級的供試液2ml,每
lml供試液可等量分注多個平皿，傾注瓊脂培養基,混勻，凝固，
培養，計數。每lml供試液所注的平皿中生長的菌落數之和即
為lml的菌落數，計算每lml供試液的平均菌落數，按平皿法
計數規則報告菌數;控制菌檢查時，可加大增菌培養基的用量。
② 離心沉澱法取一定量的供試液，500轉/分鍾離心3
分鍾，取全部上清液混合。用於細菌檢査。
③ 薄膜過濾法見細菌、黴菌及酵母菌計數項下的"薄
膜過濾法"。
④ 中和法凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試
品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或
滅活劑可加在所用的稀釋液或培養基中。