A. 高通量測序中如何判斷土壤微生物數量的多少
在陸地生態系統中，在土壤中生活有數量龐大的微生物種群，包括原核微生物如細菌、藍細菌、放線菌及超顯微結構微生物, 以及真核生物如真菌、藻類( 藍藻除外) 、地衣等。它們與植物和動物有著明確的分工，主要扮演「分解者」的角色，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學反應，擔負著地球C、N、P、S 等物質循環的「調節器」[1 ]、土壤養分植物有效性的「轉化器」和污染環境的「凈化器」等多方面生態功能[2 ]。土壤微生物是氣候和土壤環境條件變化的敏感指標，土壤微生物群落結構和多樣性及其變化在一定程度上反映了土壤的質量。土壤微生物多樣性一般包括微生物分類群的多樣性、遺傳(基因) 多樣性、生態特徵多樣性和功能多樣性[3 ]。由於土壤微生物的復雜性、土壤本身的多變性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人們對土壤微生物多樣性的研究與動、植物相比遠遠落後。隨著多聚酶鏈反應(PCR)、核酸測序等現代生物學分子生物學技術的迅速發展, 人們對土壤微生物多樣性有了更多的了解；高通量測序技術的發展則為研究土壤宏基因組提供了大量數據，為直接探究土壤中的微生物群落結構提供了客觀而全面的信息。
一、對土壤微生物進行研究的方法
1、微生物平板培養法
傳統的土壤生態系統中微生物群落多樣性及結構分析大多是將微生物進行分離培養，然後通過一般的生物化學性狀，或者特定的表現型來分析，局限於從固體培養基上分離微生物。
這種方法只限於極少量（0.1%-1%）可以培養的微生物類群，無法對絕大多數微生物的分類地位和系統發育關系的深入研究。
2、分子生物學技術結合測序的方法
在過去的20多年裡，分子生物學技術，尤其16SrDNA技術已經廣泛應用於鑒定未知菌的研究中。20世紀80年代以來, 逐步建立起了以分子系統發育分析為基礎的現代微生物分子生態學的研究方法, 如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、熒光原位雜交技術(FISH)、基因晶元(Microarry) 、磷脂脂肪酸圖譜分析( Phospholipid fatty acid, PLFA) 、穩定同位素探針( Stable Isotope Probing, SIP) 、PCR-DGGE/TGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 等, 使得研究者能夠在分子水平上對土壤微生物多樣性進行研究。
其中運用比較廣泛並被普遍認可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在於，檢測的DNA片段長度范圍以200bp ～900bp為佳，超出此范圍的片段難以檢測[4]，PCR 擴增所需G/C 鹼基對含量至少達40 % ，通常只能檢測到環境中優勢菌群的存在，只有占整個群落細菌數量約1％或以上的類群能夠通過DGGE檢測到[5]。TGGE 儀器所允許的溫度范圍為15 ℃～80 ℃，較大片段DNA 的Tm 值因為接近80 ℃而使檢測難度提高；若電泳條件不適宜，不能完全保證將有序列差異的DNA片段分開，從而出現序列不同的DNA 遷移在同一位置的現象。
3、高通量測序方法
近年來，16S rRNA/DNA為基礎的分子生物學技術已成為普遍接受的方法[6,7 ]。研究表明，400～600鹼基的序列，足以對環境中微生物的多樣性和種群分類進行初步的估計[8]，因此454高通量測序的方法因其讀長（400~500bp）長和准確性高的特點大量用於微生物多樣性的研究。
有了微生物16S rDNA序列，不論是全長還是部分，都可以提交到GenBank採用BLAST程序與已知序列進行相似性分析。Gen Bank將按照與測得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應的微生物種類，但更為精確的微生物分類還取決於系統發育分析(phylogenetic analysis)。
高通量測序的優越性體現在：測序序列長，可以覆蓋16S /18S rDNA、ITS等高變區域； 測序通量高，可以檢測到環境樣品中的痕量微生物；實驗操作簡單、結果穩定，可重復性強；無需進行復雜的文庫構建，微生物DNA擴增產物可以直接進行測序，實驗周期短；測序數據便於進行生物信息分析。
該方法得到頂級期刊的認可（Nature等），已成為土壤微生物多樣性檢測的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，為客戶提供的土壤樣本進行高通量測序並進行生物信息學分析。高通量測序因其數據量大，操作過程簡單，盡可能避免了繁瑣的實驗操作過程所造成的樣本損失，能夠相對客觀的反應出土壤樣本的真實情況。
二、高通量測序在土壤微生物研究中的應用
1、 研究土壤微生物的物種多樣性
微生物物種多樣性主要從對微生物類群即細菌、真菌和放線菌這三大類群的數量及其比例組成來描述微生物多樣性，或者按照微生物在生態系統中的作用將其劃分成不同的功能群(function group)，通過某一功能群中物種的分類及其數量來研究土壤微生物多樣性，如對土壤中的產甲烷細菌、固氮菌、根瘤菌等的多樣性進行研究。以下是幾篇具有代表性的文章。
Roesch等[9]採用454測序法對西半球的一個大的橫斷面的4類土壤進行檢測和統計學評價。結果表明，這4種土壤中，最豐富的微生物類群擬桿菌綱、β-變形菌綱和α-變形菌綱。與農業土壤相比，森林土壤的微生物多樣性更為豐富，然而檢測結果表明森林土壤中的古生菌多樣性較少，僅為該位點所有序列的0.009%，而農業土壤的比例則為4% -12%。
土壤中細菌的多樣性差距非常大，因土壤結構的不同土壤中的細菌群體也呈現出多樣化。Triplett等[10]基於焦磷酸測序法來對16S rRNA的V2-V3區域進行測序，估測9個草地土壤中的菌群的整體和垂直特性。對所有752,838條數據序列進行聚類分析，探索菌群在豐度、多樣性和組成成分等方面的特異性。作者發現在不同的土壤層中，細菌系統發生的種群或者亞群的不同分配是與土壤的性質有關的，包括有機碳含量、總含氮水平或者微生物生物量。
2、研究土壤微生物功能多樣性
土壤微生物功能多樣性指包括微生物活性、底物代謝能力及與N、P、S 等營養元素在土壤中轉化相關的功能等, 通過分析測定土壤中的一些轉化過程, 如有機碳、硝化作用以及土壤中酶的活性等來了解土壤微生物功能。
氨氧化反應是硝化作用的第一步，也是全球氮循環中由微生物活動形成硝化鹽的重要進程。Leininger[11]檢測了3個氣候區域12塊原始和農業用地的土壤里編碼氨單加氧酶(amoA)的一個亞基的基因豐度。採用反向轉錄定量PCR研究及無需克隆的焦磷酸測序技術對互補DNA測序，證實古細菌的氨氧化活性要遠高於細菌，證實Crenarchaeota可能是土壤生態系統中最富有氨氧化活性的微生物。
Urich等[12]採用基於RNA的環境轉錄組學方法同時獲得土壤微生物種群結構和功能信息。結果認為，通過該方法可以同時研究微生物生種群結構與功能從而避免其他方法所造成的偏差。群落基因組學分析可以通過研究微生物基因組序列與某些表達特徵之間的關系，獲得一些微生物功能方面的信息。但同時也需要運用其他方法將特定功能與具有這種特定功能的微生物群落結構對應起來。對rRNA表達基因和與環境因素相關的主要酶類的基因進行定量化和比較分析，將能了解微生物結構與特定功能之間的關系，如硝化、反硝化和污染物降解。
反硝化作用是參與到氮流失和溫室氣體排放等氮循環過程的重要流程之一。通過宏基因組測序的方法，結合分子檢測和焦磷酸測序，Ryan等分離鑒定了操縱編碼反硝化過程的酶類。通過篩選77,000個土壤宏基因組文庫中得到的克隆，最終分離並鑒定了9個參與反硝化作用的酶簇[13]。
3、 研究環境的突然變化對土壤微生物菌群的影響
環境的突然改變會導致微生物群落的結構和功能發生變化。Zachary等[14]以重水穩定同位素探測技術（H218O-SIP）鑒定與土壤增濕相關的細菌。通過液相色譜/質譜（LC-MS），作者確定H218O中的氧原子結合到了所有的DNA結構成分中。盡管這種結合不是均勻的，還是可以明顯的將標記了18O和未標記的DNA區分開來。作者發現DNA和細胞外的H2O中的氧原子在體外沒有發生交換，表明摻入DNA的18O是相對穩定的，並且摻入到細菌DNA中的18O的比例較高（48-72h）。土壤增濕後，對土壤中16S rRNA進行高通量測序，發現Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相對比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例則降低。作者通過控制土壤濕度的動態變化，對微生物菌群的結構發生變化進行研究和生態類群的劃分。
B. 土壤微生物有哪些
土壤微生物是土壤中一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱，嚴格意義上應包括細菌、古菌、真菌、病毒、原生動物和顯微藻類。其個體微小，一般以微米或毫微米來計算，通常1克土壤中有幾億到幾百億個，其種類和數量隨成土環境及其土層深度的不同而變化。它們在土壤中進行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等過程，促進土壤有機質的分解和養分的轉化。
土壤微生物一般以細菌數量最多，有益的細菌有固氮菌、硝化細菌和腐生細菌；有害的細菌有反硝化細菌等。施用有機肥有益於微生物的生長和繁殖。
土壤微生物功能多樣性：指土壤生態系統中微生物的物種豐富度和均一度，主要從分類學、系統學和生物地理學角度對一定地域內物種的現狀進行研究。主要通過培養基最大限度地培養各種菌落，由此了解土壤中可培養的微生物種群。
土壤微生物的功能多樣性：指土壤微生物群落所能執行的功能范圍以及這些功能的執行過程，對自然界元素循環具有重要意義如：分解功能、營養傳遞功能以及促進或抑制植物生長的功能等。一般採用底物誘導下的代謝響應模式測算土壤微生物群落的代謝功能多樣性。
土壤微生物結構多樣性：指土壤微生物群落在細胞結構組分上的多樣化程度，這是導致微生物代謝方式和生理功能多樣化的直接原因。
土壤微生物的遺傳多樣性：是土壤微生物在基因水平上攜帶的各類遺傳物質和遺傳信息的總和，這是微生物多樣性的本質和最終反映。
土壤微生物是土壤中物質轉化的動力：如;固氮作用，硝化作用、反硝化作用、腐殖質的分解和合成，土壤酶與微生物細胞一起推動物質轉化。全球變暖、森林銳減、土壤退化都與微生物有關。
C. 地上植物的多樣性會影響土壤微生物的多樣性嗎
地上植物的多樣性會影響土壤微生物的多樣性
生物多樣性通常包含三層含義，即生物種類的多樣性、基因（遺傳）的多樣性和生態系統的多樣性．生物種類的多樣性是指一定區域內生物鍾類（包括動物、植物、微生物）的豐富性，如我國已知鳥類就有1244種之多，被子植物有3000種，即物種水平的生物多樣性及其變化．基因（遺傳）的多樣性是指物種的種內個體或種群間的基因變化，不同物種（兔和小麥）之間基因組成差別很大，同種生物如兔之間（有白的、黑的、灰的等）基因也有差別，每個物種都是一個獨特的基因庫．基因的多樣性決定了生物種類的多樣性；生物種類的多樣性組成了不同的生態系統；生態系統的多樣性是指生物群落及其生態過程的多樣性，以及生態系統的環境差異、生態過程變化的多樣性等．
D. 壽光大棚蔬菜基地生物多樣性
一、土壤動物多樣性
壽光市大棚蔬菜基地不同樣地大型土壤動物類群組成統計結果見表5-13。從中可以看出：大型土壤動物中蚯蚓等耐污性強的類群占相對優勢，間或夾雜有螻蛄、步甲和金龜子等常見農田昆蟲，而蜘蛛、馬陸等不耐污種類也佔有有相當比重。這一方面體現了當地農田土壤動物區系的特點，同時也反映出壽光市重金屬污染較魚台等地輕微。
該區不同樣地土壤動物不同類群及數量統計結果見表5-14。從中可以看出：土壤動物中原生動物密度最大，線蟲次之，旱生動物數量也不少，土壤線蟲與旱生動物密度之比平均為12∶1。旱生動物中蜱蟎目和彈尾目是優勢類群，這些都符合農田土壤動物區系的一般規律。旱生土壤動物豐度高於魚台縣，顯示出該地區重金屬污染程度較低。
研究區土壤動物各類群數量與土壤重金屬元素含量的相關性分析統計結果見表5-15。從中可以看出：土壤原生動物數量與各種元素均未顯示明顯相關關系。土壤線蟲數量與Cd含量呈顯著正相關（r＝0.517，P＜0.05），而與其他元素均未顯示明顯相關關系。旱生土壤動物數量與Cr含量呈顯著正相關（r＝0.719，P＜0.01），而與其他元素未顯示明顯相關關系。
以上結果顯示動物數量與某些重金屬元素含量成正相關，這主要是由於該地區重金屬污染程度較輕，還沒有達到影響土壤動物數量的程度。可能是由於其他外在因素對土壤動物數量影響更大，從而形成了干擾。
壽光大棚蔬菜基地兩個深層土壤剖面樣品中土壤動物數量統計結果見表4。從中可以看出土壤動物數量隨著深度增加而急劇降低，這可能是由於土壤有機質含量降低所致，也可能是土壤孔隙的含氧量降低所致。
表5-13 壽光大棚蔬菜基地不同樣地大型土壤動物區系組成表
表5-14 壽光大棚蔬菜基地不同樣地土壤動物類群數量表
表5-15 壽光大棚蔬菜基地土壤動物各類群數量與土壤重金屬元素含量的相關性表
註：*為P＜0.05，**為P＜0.01。
壽光大棚蔬菜基地深層土壤動物數量與土壤重金屬元素含量相關性分析結果見表5-16。結果顯示：壽光剖面17 土壤原生動物數量與 Cd 含量呈明顯正相關（r ＝0.965，P ＜0.01），與Cu含量呈明顯正相關（r＝0.974，P＜0.01），與Mn含量呈明顯正相關（r＝0.903，P＜0.05），與Mo含量呈明顯正相關（r＝0.973，P＜0.01），與Zn含量呈明顯正相關（r＝0.976，P ＜0.01）；壽光剖面18 土壤原生動物數量與Cu 含量呈明顯正相關（r＝0.884，P＜0.05），與Mo含量呈明顯正相關（r＝0.902，P＜0.05）。這可能是由於重金屬元素含量較低，還沒有達到影響土壤動物數量的程度。
表5-16 壽光大棚蔬菜基地深層土壤剖面原生動物和線蟲數量表
二、不同生理類群土壤微生物多樣性
表5-18顯示了壽光大棚蔬菜基地表層土壤中不同生理類群微生物總數。選取其中的代表性數據進行分析。其中樣品 SGP001、SGP011、SGP021 取自大棚內的土壤，而SGP006、SGP016、SGP026來自大棚外的土壤，SGP001、SGP006所處的土壤類型為潮土，而SGP011、SGP016、SGP021、SGP026所處的土壤類型為石灰性褐土。同時6 個樣品所處土壤上栽種的農產品依次為：大棚黃瓜、玉米、大棚茄子、玉米、綠豆和番薯、玉米，這幾種農作物的生長狀況依次為剛出土→成熟→幼苗→成熟→成熟→成熟。除栽種的作物外，還存在各種優勢野草和伴生野草。從實驗數據觀察，土壤樣品中的優勢菌主要是細菌、放線菌、固氮菌、氨化菌。總的來看，無論是微生物總量還是各類微生物的量，大棚內土壤樣品中微生物的數量明顯高於大棚外土壤的。
表5-17 壽光大棚蔬菜基地深層土壤剖面原生動物和線蟲數量與土壤重金屬元素含量相關性表
註：*為P＜0.05，**為P＜0.01。
表5-18 壽光大棚蔬菜基地表層土壤中不同生理類群微生物總數表（×10 5 number g -1 soil dw）
在6個樣品中，細菌的數量都極大地高於其他菌的數量，這說明了不同作物根際細菌占絕對優勢。除細菌之外，栽種茄子的土壤中真菌量較其餘5個樣品中的量大幅度增加，而在栽種黃瓜的土壤中，放線菌、固氮菌的量明顯高於其他的樣品的，李文慶等的研究發現壽光蔬菜產區，黃瓜、架豆、苦瓜能夠增加土壤細菌數量，西葫蘆、豆角、茄子引起土壤細菌降低，黃瓜、辣椒表現抑制土壤真菌作用，黃瓜、西紅柿能夠促進放線菌數量的增長，茄子、豆角、西葫蘆不利於土壤放線菌的生長。這也與我們的研究結果相符。在栽種綠豆和番薯的土壤中的樣品中，氨化菌的數量較其他的增加。在栽種玉米的土壤中的樣品中，除反硝化菌、真菌之外，石灰性褐土的土壤樣品中各類菌的數量都高於潮土的土壤樣品中各類菌的數量，同時纖維分解菌數量增加也較明顯。
土壤中有豐富的化學元素，它參與了微生物的各種生命活動中，化學元素的量也間接影響了微生物的生物量。本實驗根據各微生物類群的數量和相應土樣中的化學元素量計算出土壤中的主要元素與8類微生物量的相關性，結果見表5-19。
表5-19 壽光大棚蔬菜基地主要化學元素與微生物的相關性比較表
註：*為P＜0.05。
從實驗數據得出除個別情況，化學元素都極大地影響著微生物的數量，同一種化學元素與8大類微生物的相關性數據差別不大，而不同元素對同一微生物的影響卻有明顯的差異，這反映了不同元素參與的生命活動不同。同時Ni、Hg、Pb等重金屬在含量較低時對微生物影響極小，反映了微生物對其的需求極少，而P、N、S、Zn與微生物的相關性高可能由於它們參與生命必須物質的合成，生物需求量極高。
由表5-20看出，大棚內每一深度的樣品中各類微生物的數量總是大於其相應點的大棚外土壤樣品中的，優勢菌主要是細菌、放線菌、氨化菌，其中細菌占絕對優勢。忽略個別數據，無論大棚內外微生物數量總的趨勢是隨土層加深而減少，但到達一定深度實會出現數量的增加，表現出上層多於下層的垂直分布特點。表層土壤中微生物分布最多，佔三層微生物總數的80%多，亞表層土壤微生物占微生物總數的10%左右，底層土壤微生物極少。各類群微生物在表層的分布情況為細菌、放線菌、真菌、纖維素分解菌、固氮菌、氨化菌、硝化菌、反硝化菌分別約占 77.88%、65.67%、71.42%、44%、33.05%、55.93%、22.22%、67.07%。說明真菌、細菌、放線菌、反硝化菌絕大多數為好氣的，主要分布在表層，與之相比，纖維素分解菌、固氮菌、氨化菌、硝化菌相對分布在土壤較深層次。但宏觀地說，微生物數量及生物活性最大的區域是表層土壤。其中細菌數量最多，垂直遞減陡度較大，各類菌都有中途數量回升的現象，這可能與厭氧菌數量的增加有關。
表5-20 壽光大棚蔬菜基地深層土壤微生物總數表（×10 -6 number g -1 soil dw）
三、土壤微生物功能多樣性
表5-21顯示了壽光大棚蔬菜基地土壤微生物 BIOLOG 多樣性指數。SGP081、SGP076、SGP101、SGP091、SGP051、SGP086、SGP066、SGP061 75 h 可利用的單一碳源底物較少，各種多樣性指數較低，平均光吸收值（AWCD）較少，而SGP046、SGP041、SGP036、SGP026、SGP001、SGP056、SGP011 可利用的單一碳源底物較多，各種多樣性指數較高，平均光吸收值（AWCD）較大。
表5-22說明 SGP081、SGP076、SGP101、SGP091、SGP051、SGP086、SGP066、SGP061與SGP046、SGP041、SGP036、SGP026、SGP001、SGP056、SGP011的Shannon指數存在顯著差異性。前者Shannon指數明顯小於後者，說明前者多樣性明顯低於後者。
表5-21 壽光大棚蔬菜基地土壤微生物BIOLOG 多樣性指數表
表5-22 壽光大棚蔬菜基地Shannon 指數差異性比較表
續表
表5-23可看出S值，H′、U、G與As、Co、Ni、Pb、N、MgO、K2 O存在顯著相關性，U 與B 存在顯著相關性，S E 與As，Ni 存在顯著相關性，M E 與Ni 存在顯著相關性，AWCD與As、B、Co、Ni、Pb、MgO、K2 O存在顯著相關性。
表5-23 壽光大棚蔬菜基地土壤微生物BIOLOG 多樣性指數與地球化學元素的相關性表
續表
註：*為P＜0.05。
壽光深層土壤微生物S、H′、U、AWCD 值隨著深度的增加而減少，G、S E 值總的來說隨著深度的增加而增加，M E 隨深度的變化規律不明顯（表5-24）。
表5-24 壽光大棚蔬菜基地深層土壤微生物BIOLOG 多樣性指數表
四、土壤微生物結構多樣性
壽光大棚蔬菜基地表層土壤微生物群落結構多樣性分析結果見表5-25。SGP 066、SGP 041的細菌總量明顯高於其他樣地，而SGP 076、SGP 051、SGP 081、SGP 101細菌總量較低。SGP056真菌含量明顯高於其他樣地，SGP076、SGP081、SGP096真菌含量較低。壽光市所有樣地中土壤GP含量少於GN。除了SGP046、SGP056其餘樣地中就細菌與真菌而言細菌含量占優勢。
由表5-26可看出SGP071、SGP 076、SGP 051、SGP 081、SGP 101與SGP 066、SGP 041、SGP 031、SGP 056存在顯著差異性。前者土壤表層細菌含量明顯少於後者。
表5-27顯示了壽光大棚蔬菜基地表層土壤微生物結構多樣性與地球化學元素的相關性。在P＜0.05范圍內，GP和真菌與Co、Ni、V存在顯著負相關，與K2 O存在顯著正相關。細菌總數與Co、Ni顯著負相關，與K2 O存在顯著正相關。GP/GN與Co、Ni、V存在顯著負相關，Bacteria/Fungi 與As、Pb 呈顯著負相關，與 Co、Cr、Ni、V 呈顯著正相關。
表5-25 壽光大棚蔬菜基地表層土壤微生物群落結構表
表5-26 壽光大棚蔬菜基地表層土壤微生物細菌含量差異性比較表
表5-27 壽光大棚蔬菜基地表層土壤微生物結構多樣性與地球化學元素的相關性表
續表
註：*為P＜0.05。
表5-28給出了壽光大棚蔬菜基地深層土壤微生物群落結構。壽光市大棚蔬菜基地深層代表GN、GP、Fungi的FAME的含量總的來說隨著深度的增加而降低，但SGP01708數值偏大。
表5-28 壽光大棚蔬菜基地深層土壤微生物群落結構表
五、土壤種子庫群落結構多樣性
壽光大棚蔬菜基地土壤種子庫中共計7科11屬12種植物，其中禾本科5種，十字花科2種，占總數的58.3%；其餘科各1種。其中，一年生草本植物10種，多年生草本植物2種，分別占總數的83.3%、16.7%，無半灌木。
該區土壤種子庫密度為483.4 ± 129.5 粒/m2，其中，以酢漿草（Oxalis corniculata）的密度最高。壽光蔬菜產區主要以大棚生產為主，人為降低了土壤雜草種子庫的輸入，且耕作頻繁，人工干擾大，種子庫輸出頻繁，是種子庫密度明顯低於濟南、魚台的重要原因。
各樣地的多樣性指數如表5-29所示。壽光大棚蔬菜基地的種子庫Margalef豐富度指數、辛普森多樣性指數、香農-威納指數和 Peilou 均勻性系數分別為1.966、0.796、1.80、0.72。
表5-29 壽光大棚蔬菜基地各樣地種子庫密度和多樣性指數表
註：R為Margalef豐富度指數；D為辛普森多樣性指數；H′為香農-威納指數；E為Peilou均勻性系數。
E. 微生物的多樣性包括哪些方面
微生物在地球上幾乎無處不有，無孔不入，人的皮膚上，口腔，腸道里都有許多微生物。微生物聚集最多的地方是土壤，土壤是各種微生物生長繁殖的大本營，約占微生物總量的70-90%，任意取一把土或一粒土，就是一個微生物世界，不論數量或種類均最多。在肥沃的土壤中，每克土含有20億個微生物，即使是貧瘠的土壤，每克土中也含有3－5億個微生物。空氣里懸浮著無數細小的塵埃和水滴，它們是微生物在空氣中的藏身之地。哪裡塵埃多，哪裡的微生物就多。
迄今為止，我們知道的微生物約有10萬種，目前已知的種類只佔地球上實際存在的微生物總數的20%，人類生產和生活中僅開發利用了已發現微生物種數的1%。
微生物種類繁多，人們研究得最多、也較深入的主要有細菌、放線菌、藍細菌、枝原體、立克次氏體、古菌、真菌、顯微藻類、原生動物、病毒、類病毒和朊病毒等。
細菌是一類細胞細而短、結構簡單、細胞壁堅韌，以二等分裂方式繁殖的原核微生物，分布廣泛。觀察細菌常用光學顯微鏡，其大小用測微尺在顯微鏡下進行測量，以微米(μm)為單位。不同種類的細菌大小不一，同一種細菌也因菌齡和環境因素的影響而有差異。細菌按其外形，主要有球菌，桿菌，螺形菌
某些細菌到一定的發育階段或當環境條件不適於細菌繁殖時，會在細胞內形成一個圓形或橢圓形的，對不良環境條件具有高度抵抗力的休眠體，叫做芽孢；芽孢的形成能力是由這種菌的遺傳特性所決定的；細菌中球菌不會產生芽孢；產生芽胞的都是革蘭陽性菌。
放線菌的形態、大小和結構
放線菌的形態比細菌復雜些，但仍屬於單細胞。在顯微鏡下，放線菌呈分枝絲狀，我們把這些細絲一樣的結構叫做菌絲，菌絲直徑與細菌相似，小於1微米。菌絲細胞的結構與細菌基本相同。
根據菌絲形態和功能的不同，放線菌菌絲可分為基內菌絲、氣生菌絲和孢子絲三種。鏈黴菌屬是放線菌中種類最多、分布最廣、形態特徵最典型的類群。
黴菌的菌絲構成黴菌營養體的基本單位是菌絲。
菌絲是一種管狀的細絲，把它放在顯微鏡下觀察，很像一根透明膠管，它的直徑一般為3-10微米，比細菌和放線菌的細胞約粗幾倍到幾十倍。菌絲可伸長並產生分枝，許多分枝的菌絲相互交織在一起，就叫菌絲體。
提起酵母菌這個名稱，也許有人不太熟悉，但實際上人們幾乎天天都在享受著酵母菌的好處。因為我們每天吃的麵包和饅頭就是有酵母菌的參與製成的；我們喝的啤酒，也離不開酵母菌的貢獻，酵母菌是人類實踐中應用比較早的一類微生物，我國古代勞動人民就利用酵母菌釀酒；酵母菌的細胞里含有豐富的蛋白質和維生素，所以也可以做成高級營養品添加到食品中，或用作飼養動物的高級飼料。
酵母菌在自然界中分布很廣，尤其喜歡在偏酸性且含糖較多的環境中生長，例如，在水果、蔬菜、花蜜的表面和在果園土壤中最為常見。
病毒的形態基本可歸納為三種：桿狀、球狀和這兩種形態結合的復合型。沒有細胞構造，病毒粒子的主要成分是核酸和蛋白質，在宿主細胞協助下，通過核酸的復制和核酸蛋白裝配的形式進行增殖。病毒粒子通常形成螺旋對稱、二十面體對稱和復合對稱。
病毒粒子是無法用光學顯微鏡觀察的亞顯微顆粒，但當他們大量聚集在一起並使宿主細胞發生病變時，就可以用光學顯微鏡加以觀察。例如動、植物細胞中的病毒包涵體；有的還可用肉眼看到，如噬菌體的噬菌斑等。
F. 為什麼土壤微生物有多樣性
環境的復雜性導致了生物的多樣性。不同生物運用不同策略適應復雜環境導致了生物的多樣性。微生物亦是如此。
G. 如何運用克隆文庫法分析土壤真菌微生物多樣性
如何運用克隆文庫法分析土壤真菌微生物多樣性
按照我理解的「土壤中微生物的種類」是指古菌、細菌、真菌等生命體而不包括藻類、原生動物等低等動植物.
土壤中微生物的種類數量的調查屬於微生態區系分析的范疇.
一般說來,我們所開展的研究工作主要採用以下兩類方法進行研究分析：
1、經典的選擇培養法：
即採用選擇培養的方法,對土壤樣品中的細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等幾大類微生物進行分類培養,還可以採用詳細的選擇培養方式比如無氮培養基培養固氮微生物、利用MPN法測定氮循環微生物等等,從功能角度再細分一下微生物的種類組成；還可以通過寡營養、富營養、長周期培養等方法做進一步詳細的分析.
此類方法工作量大,分析精度和全面性都有一定的局限性.但同時是任何層面的研究都不可以忽略的方式方法,是獲得微生物菌種資源純培養以進行深入研究的唯一方法.
2、分子微生態學方法
是基於DNA分析和測序基礎上的分子微生態學研究方法,常用的有DGGE（變性梯度凝膠電泳）、克隆文庫構建、T-RFLP以及宏基因組技術,對樣品中的DNA進行電泳乃至測序分析,從分子水平確定樣品中微生物的種類和數量.
從全面性和深度以及工作效率方面都教常規方法有大幅度提升,但目前仍然有不成熟的地方.另外其成本遠高於常規方法.
H. 土壤生物多樣性與土壤地球化學環境質量之間的關系
土壤由氣相、液相和固相三相合一的、生物賴以生存的重要載體，又是具有物理、化學性質及生命形式的復合體。土壤生物學家常把土壤看作是地下棲居生物的一個巨大的、變動的培養基地，並且是將高等植物所不能利用的物質通過土壤生物作用變成可以利用的一個場地。土壤有其本身的結構和肥力特點。土壤圈在地球化學循環中發揮著重要的功能作用，推動著土壤圈內部礦質營養元素的循環轉化，並能具有促進植物體生長的肥力效應而顯示出強大的生產力。占土壤組成極少部分的生物體，在土壤發揮其巨大功能的過程中起著關鍵不可替代的作用，即土壤生物是整個土壤圈的核心，它在促進有機質分解、土壤礦質營養循環、維持及提高土壤肥力方面發揮著關鍵作用，因而也對大氣圈、水圈產生著重大影響。因此，有必要研究土壤生物群落結構及其功能作用，特別是在傳統的化學農業因其帶來的環境負面效應而受到嚴峻挑戰的當今，人類在面臨既要提高或維持農業產量又要減少或防治環境污染的雙重壓力、應如何做出抉擇的形勢下顯得尤為突出。
土壤生物的組成，可分為土壤微生物和土壤動物兩大類群，一般包括微生物類群的細菌、真菌和放線菌，原生動物類群的鞭毛蟲、纖毛蟲和肉足蟲，微型節肢動物如土壤蟎類和彈尾目昆蟲，以及線蟲、線蚓和蚯蚓等。梁文舉等（2001）及Hendix等（1990）對土壤生物區系在土壤生態系統過程中包括在養分循環和土壤結構中所起的重要作用作了評述。在陸地生態系統中，土壤生物區系是分解者食物網的重要組成部分，是分解作用、養分礦化作用生態過程的主要調節者（Wardle，1995）。盡管在大多數系統中微生物群落約佔C和N礦化和固定量的90%，但其活動受著土壤動物的調節。土壤動物通過取食細菌和真菌及將微生物繁殖體向新的位點運輸直接調節微生物的活動。土壤動物消耗微生物生物量後，排泄出無機N，然後這些無機N素又進一步供給微生物或被植物吸收利用。土壤動物通過破碎有機質和形成糞粒來增加微生物侵襲的表面積，通過糞土的產生間接地改變微生物的微環境，轉過來又影響土壤孔隙度、團聚體大小和穩定性。一般來說，土壤動物活動對生態系統過程產生最終的影響是提高有機質的分解速率和養分周轉量。根圈（或稱根際）通常是指受作物根系活動影響，在物理、化學和生物學特性上與周圍土壤有別的土壤微區，是土壤根系生物群落相互作用的系統，也是養分、水分和其他物質進入根表面的門戶，因而普遍受到重視。胡鋒等（1998）通過盆栽試驗對比研究了兩種基因型小麥根際土壤動物和微生物的數量動態及根際效應，認為根際土壤動物與微生物之間相互作用機制在於食微動物與微生物形成的捕食者-獵物間的食物鏈關系。根際中豐富的分泌物促進了微生物的增殖。這些在食物鏈中處於最低營養級的微生物作為資源生物即土壤動物的食物，支持了較高的根際動物種群，而較高營養級的動物又可通過捕食、競爭作用影響微生物或其他土壤動物的數量乃至種群結構。
土壤種子庫的研究是生物多樣性研究中的一部分，長命種子具有重要的遺傳學意義，種子庫被認為是植物種群基因多樣性的潛在提供者（Harper，1977），所以土壤種子庫在維持種群和群落的生態多樣性和遺傳多樣性方面具有重要意義。其次，從實踐來說，在生長季剛開始的時候，了解種子庫的組成和多度可以幫助我們預測農田、牧場和自然植物群落的生產量及承載量（Russi et al.，1992）
本次對濟南重金屬污染區（簡稱濟南）、魚台優質稻生產基地（簡稱魚台）、壽光大棚蔬菜基地（簡稱壽光）各生物學參數的差異性進行比較，採用統計學方法進行了土壤生物學參數間及土壤生物學參數與土壤地球化學元素間的相關性分析，評價三地土壤的質量。
一、土壤生物多樣性變化特徵
濟南、魚台、壽光三地土壤生物多樣性分布特徵和變化規律各有其特點。3個地區土壤中線蟲數量顯著低於原生動物數量，原生動物數量又顯著低於細菌數量，這與其在食物鏈中的位置和取食關系是一致的。壽光的線蟲、真菌、放線菌、固氮菌和反硝化菌數量顯著高於濟南、魚台的線蟲、真菌、放線菌、固氮菌和反硝化菌數量，魚台地區高於濟南地區，但未表現出顯著差異。3 個地區的原生動物、細菌、氨化菌和硝化菌數量無顯著差異，表明這幾個生物類群對重金屬污染的敏感程度較低。纖維素分解菌的數量為魚台＜濟南＜壽光，說明纖維素分解菌除受到重金屬污染外還受到其他因素比如植物枯落物種類、數量等的影響。
代表微生物新陳代謝能力和多樣性的各多樣性指數與種群數量的分布規律存在差異（表5-46）。3個地區的Shannon豐富度不存在顯著性差異。Shannon多樣性指數濟南低於魚台壽光，McIntosh多樣性指數魚台和壽光低於濟南，Shannon均勻度和McIntosh均勻度濟南低於魚台和壽光。
表5-46 濟南、魚台、壽光三地的土壤生物參數的方差分析表
代表不均勻程度的Gini指數濟南高於魚台和壽光。代表新陳代謝能力的AWCD值濟南低於魚台和壽光。總體來說濟南地區微生物的新陳代謝能力和均勻性低於魚台和壽光。3個地區土壤微生物結構間存在差異，濟南地區革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌比例和細菌/真菌比例顯著高於其他兩地。3個地區的土壤種子庫各參數間不存在顯著差異，說明重金屬污染對土壤種子庫影響不大。3個調查地區各分析指標的變異系數差異較大，總體來說，微生物活性的變異系數低於微生物數量的變異系數，線蟲數量的變異系數低於原生動物的變異系數，地球化學元素的變異系數低於生物的變異系數。
二、土壤生物多樣性指標之間的相關關系
由表5-47可以看出，土壤細菌與放線菌、固氮菌、氨化菌、硝化菌和反硝化菌之間存在顯著的正相關關系。土壤真菌與放線菌、固氮菌，放線菌與細菌、真菌、固氮菌和反硝化菌，固氮菌與細菌、真菌、放線菌、反硝化菌，氨化菌與細菌、硝化菌和反硝化菌，硝化菌與細菌、氨化菌和反硝化菌，反硝化菌與細菌、放線菌、固氮菌、氨化菌和硝化菌之間存在顯著的正相關關系。這是合乎常理的，因為各微生物類群的適宜生活的條件雖然各有差異，但是總體是營養豐富的、肥沃的土壤適宜於絕大多數類群微生物的生長，而且微生物各分類群和功能群間也有交叉。
土壤線蟲與Biolog Shannon豐富度、McIntosh指數之間存在顯著負相關關系，與Shannon均勻度、McIntosh均勻度之間存在顯著正相關關系，而土壤微生物各生理類群與Biolog各多樣性指數間不存在顯著的正相關關系，說明土壤線蟲作為食微生物的動物會顯著降低微生物利用底物的多樣性，但通過這種捕食關系的調節，微生物的均勻度增加，線蟲在維持食物鏈的動態平衡中具有非常重要的作用。
三、土壤生物多樣性與土壤地球化學環境之間的關系
由表5-48可以看出土壤生物各參數與各地球化學元素間存在著不同的相關性。土壤線蟲與Ni之間存在著顯著的正相關關系，與Pb、Se之間存在著顯著的負相關關系。土壤原生動物與Cr、S之間存在著顯著的正相關關系。土壤真菌與K2 O，土壤放線菌、固氮菌、纖維素分解菌與N，土壤硝化菌與F之間存在著顯著的正相關關系。Biolog Shannon均勻度與Ni之間存在著顯著的正相關關系。Biolog McIntosh指數與Co、F、Mn、Ni、V、Al2 O3、Fe2 O3、MgO、K2 O之間存在著顯著的負相關關系，與Se、Na2 O之間存在著顯著的正相關關系。Biolog McIntosh均勻度與Ni之間存在顯著的正相關關系。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌PLFA含量都與B存在顯著的正相關關系。真菌PLFA含量與As、B、Mn、V、Al2 O3、Fe2 O3、MgO、CaO、K2 O存在顯著正相關關系，與SiO2、Na2 O存在顯著負相關關系。革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌比例與Cr、Hg、Mo、Zn、Se、S、K2 O存在顯著正相關關系。細菌/真菌存在顯著負相關關系。土壤種子庫各參數與地球化學元素間不存在顯著正相關關系。這說明各地球化學元素對各土壤生物的作用不同，通過不同的生物學指標可用於指示某種、某幾種重金屬或重金屬復合污染的情況。
四、土壤重金屬污染程度的生物學指標
壽光的線蟲、真菌、放線菌、固氮菌和反硝化菌數量顯著高於濟南、魚台數量，魚台地區高於濟南地區，但未表現出顯著差異。Biolog Shannon均勻度、Biolog McIntosh均勻度濟南低於魚台、壽光，代表不均勻程度的Gini指數濟南高於魚台、壽光，AWCD值濟南低於魚台、壽光。濟南地區革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌比例和細菌/真菌比例顯著高於其他兩地。說明以上指標可作為重金屬復合污染的生物學指標。線蟲、真菌、放線菌、固氮菌、反硝化菌數量、Biolog Shannon均勻度、Biolog McIntosh均勻度越低表明重金屬復合污染越嚴重，Gini指數越高表明重金屬復合污染越嚴重。
由表5-48我們可以找到重金屬污染的生物學指標。土壤線蟲、Biolog Shannon均勻度、Biolog McIntosh指數可作為Ni污染的生物學指標，土壤線蟲越多、Biolog Shannon均勻度越高表明Ni含量越高，Biolog McIntosh指數越低表明Ni污染越嚴重。土壤線蟲還可以作為Pb污染的生物學指標，土壤線蟲越少表明Pb污染越嚴重。土壤原生動物、革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌比例可作為Cr污染的生物學指標，土壤原生動物、革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌比例越高表明Cr污染越嚴重。Biolog McIntosh指數可作為Co污染的生物學指標，Biolog McIntosh指數越低暗示Co污染越嚴重。Biolog McIntosh指數和真菌PLFA含量都可以作為Mn、V污染的生物學指標，Biolog McIntosh指數越低、真菌PLFA含量越高暗示Mn、V污染越嚴重。真菌PLFA含量還可作為As污染的生物學指標，真菌PLFA含量越高暗示As污染越重。革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌比例還可作為Hg、Zn污染的生物學指標，其比例越高，表明Hg、Zn污染越嚴重。
總的來說，濟南地區土壤生物的數量和活性低於魚台壽光。細致的分，不同的生物學參數可作為不同重金屬污染的生物學指標。土壤動物尤其是土壤線蟲群落多樣性已用作土壤質量以及土壤生態演替過程的生物指標（李文芳等，2005；Liang，et al.1999）。研究發現土壤線蟲作為敏感生物可作為 Ni、Pb 的生物學指標。澳大利亞學者 Pankhurst 等（1995）把細菌、真菌、放線菌數量作為土壤質量的生物指標。同時研究者也發現土壤受污染程度越低、土壤質量越高，真菌、放線菌數量越高。此外，其他生物學指標如革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌比例、真菌PLFA含量、Biolog多樣性指數等也可作為重金屬污染的生物學指標。總之，用土壤生物作為敏感、快速的重金屬污染生物毒性的指示物，具有廣闊的應用前景。
通過濟南、魚台及壽光三地的生物多樣性研究表明，濟南、魚台、壽光土壤生物多樣性分布特徵和變化規律各有其特點。總體來說壽光的線蟲、真菌、放線菌、固氮菌、反硝化菌數量顯著高於濟南、魚台，魚台地區高於濟南地區，但未表現出顯著差異。3個地區的原生動物、細菌、氨化菌、硝化菌數量無顯著差異。濟南地區微生物的新陳代謝能力和均勻性低於魚台、壽光。3個地區土壤微生物結構間存在差異，濟南地區革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌比例和細菌/真菌比例顯著高於其他兩地。3個地區的土壤種子庫各參數間不存在顯著差異。
生物多樣性特徵符合農田重金屬污染地區的生態系統的一般規律，結果說明壽光市重金屬污染較魚台等地輕微，重金屬元素對土壤動物類群和數量以及微生物等具有不利影響。
表5-47 濟南、魚台、壽光三地土壤生物多樣性指標之間相關系數矩陣表
續表
註：*為P＜0.05。
表5-48 濟南、魚台、壽光三地土壤生物多樣性指標與土壤地球化學元素相關分析表
續表
I. 什麼是微生物多樣性它的表現方式有哪些
生物多樣性biodiversity是指一定范圍內多種多樣活的有機體(動物、植物、微生物) 有規律地結合所構成穩定的生態綜合體。 這種多樣包括動物、植物、微生物的物種多樣性，物種的遺傳與變異的多樣性及生態系統的多樣性。其中，物種的多樣性是生物多樣性的關鍵，它既體現了生物之間及環境之間的復雜關系，又體現了生物資源的豐富性。微生物多樣性是指微生物的生命形式的多樣性，包括生理代謝類型、代謝產物、遺傳基因及生態類型的多樣性。
J. 問答題（20分）：微生物的多樣性表現在哪些方面請加以簡要論述。
1.營養類型的多樣性
動物自身不能從簡單的無機物製造有機物，也不能從日光中獲得能量，必須直接或間接地以綠色植物為食，來獲取現成的有機物以獲得生命活動所需的能量。由此動物只能是化能異養性生物。絕大多數植物只從外界吸收簡單的無機物（從空氣中吸收二氧化碳，從土壤中吸收水和無機鹽），還吸收日光作為能源，通過光合作用在體內製造有機物提供本身代謝活動所需的有機物和能量。由此絕大多數的植物為光能自養型生物。微生物的營養類型之多是動植物所大大不及的。有以二氧化碳為碳源，光為能源的光能自養型微生物如：藍細菌，紫硫細菌，綠硫細菌，藻類等；有以有機物為碳源，光為能源的光能異養型微生物如：紅螺菌科的細菌（紫色無硫細菌）；有以二氧化碳為碳源，無機物為能源的化能自養型微生物如：硝化細菌，硫化細菌，鐵細菌，氫細菌，硫磺細菌等；有以有機物為碳源，有機物為能源的化能異養型微生物如：絕大多細菌和全部真菌。
2、 產能途徑的多樣性
動植物通過糖酵解途徑和三羧酸循環氧化葡萄糖分解成水和二氧化碳並釋放能量，植物還通過非環式光合磷酸化的方式合成能量。而微生物產能的途徑更為多，而且不同的微生物進行生物氧化所利用的物質不同，異養微生物利用有機物，自養微生物則利用無機物。
2.1.1異養微生物的產能途徑
（1）EMP途徑：以1分子葡萄糖為底物反應產生2分子丙酮酸，2分子NADH+氫離子和2分子ATP。EMP途徑是絕多數生物所共有的一條主流代謝途徑。
（2）HMP途徑：是從葡糖-6-磷酸開始的，其特點是葡萄糖不經EMP途徑和TCA循環而得到徹底氧化，並能產生大量還原型煙酸胺腺嘌呤二核苷酸磷酸以及重要中間代謝產物。在多數好氧菌和兼性厭氧菌種都存在HMP途徑，而且通常還與EMP途徑同時存在。只有HMP途徑而無EMP途徑的微生物很少，例如弱氧化醋桿菌，氧化葡糖桿菌，氧化醋單胞菌。
（3）ED途徑：以1分子葡萄糖為底物生成2分子丙酮酸，1分子ATP，1分子NADPH和NADH。其特點是只經過4步反應即可快速獲得由EMP途徑須經10步反應才能形成的丙酮酸。ED途徑在革蘭氏陰性菌中分布較廣，特別是假單胞菌和固氮菌的某些菌中較多存在，是缺乏完整EMP途徑的微生物中的一種替代途徑。ED途徑可不依賴於EMP途徑和HMP途徑而單獨存在。
（4）TCA途徑：以1分子丙酮酸為底物，經過一系列循環反應而徹底氧化，脫羧形成3分子CO2，4分子NADH2，1分子FADH2和1分子GTP，總共相當於15分子ATP，產能效率極高。這是一個廣泛存在於各生物體中的重要生物化學反應，在各種好氧微生物中普遍存在。
2.2自養微生物的產能途徑
自養微生物的生物合成的起始點是建立在對氧化程度極高的二氧化碳進行還原（即CO2的固定）的基礎上，為此，化能自養微生物必須從氧化磷酸化所獲得的能量中，花費一大部分ATP以逆呼吸鏈傳遞的方式把無機氫轉變成還原力。
而在光能自養微生物中，ATP是通過循環光合磷酸化，非循環光合磷酸化或紫膜光合磷酸化產生的，而還原力則是直接或間接利用這些途徑產生的。
3、代謝產物的多樣性。可分為初級代謝產物和次級代謝產物。初級代謝產物是指微生物通過代謝活動所產生的、自身生長和繁殖所必需的物質，次級代謝產物是指微生物生長到一定階段才產生的化學結構十分復雜、對該微生物無明顯生理功能，或並非是微生物生長和繁殖所必需的物質。
4、微生物的代謝調節的多樣性：酶合成的調節和酶活性的調節。