A. 生物素標記的DNA探針用什麼方法檢測
生物素標記的DNA探針用什麼方法檢測
以病原微生物DNA或RNA的特異性片段為模板,人工合成的帶有放射性或生物素標記的單鏈DNA片段,可用來快速檢測病原體.
怎麼檢測：
將一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或熒光染料等標記後製成的探針.可與固定在硝酸纖維素膜的DNA或RNA進行互補結合,經放射自顯影或其他檢測手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在.
以細菌為例,目前分子雜交技術用於細菌的分類和菌種鑒定比之G+C百分比值要准確的多,是細菌分類學的一個發展方向.加之分子雜交技術的高敏感性,分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景.細菌的基因組大小約5×106bp,約含3000個基因.（各種細菌之間絕大部分DNA是相同的,要獲得某細菌特異的核酸探針,通常要採取建立細菌基因組DNA文庫的辦法,即將細菌DNA切成小片段後分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫.然後用多種其它菌種的DNA作探針來篩選,產生雜交信號的克隆被剔除,最後剩下的不與任何其它細菌雜交的克隆則可能含有該細菌特異性DNA片段.將此重組質粒標記後作探針進一步鑒定,亦可經DNA序列分析鑒定其基因來源和功能.）括弧里比較重要!
B. 誰知道測DNA甲基化的方法
http://www.ebiotrade.com/emgzf/genenews200404/gene5.htm您自己看吧！好多圖片粘貼不過來，還不如你自己看。
一種全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技術
DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學性修飾鹼基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位點，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區域，在哺乳動物中mC約佔C總量的2－7％。一般說來，DNA的甲基化會抑制基因的表達。DNA的甲基化對維持染色體的結構、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發生發展都起重要的作用。
CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區段，CpG保持或高於正常概率，這些區段被稱作CpG島。CpG島主要位於基因的啟動子和第一外顯子區域，約有60％以上基因的啟動子含有CpG島。 CpG甲基化的研究在腫瘤的研究中有著非常主要的地位。通過基因啟動子區及附近區域CpG島胞嘧啶的甲基化可以在轉錄水平調節基因的表達，從而引起相應基因沉默，去甲基化又可恢復其表達。DNA甲基化在生理情況下就參與了控制基因的時空表達，在腫瘤發生時，腫瘤細胞全基因組低甲基化是一個重要特徵。腫瘤細胞基因組甲基化的程度與正常細胞相比僅為20-60% , 同時伴有局部區域基因的高甲基化,包括腫瘤抑制基因、抑制腫瘤轉移和浸潤的基因、細胞周期調節基因、DNA修復基因、血管形成抑制基因等。但是目前研究手段的局限，限制了DNA甲基化的廣泛研究。
近年來，研究者不斷探索定性及定量檢測單個或多個甲基化位點的方法，但由於甲基化多態性區域存在的密度很高，所以對於延伸反應其引物的位置很難設計。Pyrosequencing技術作為一種新的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。
從原理上來看，Pyrosequencing是一種通過合成方法進行序列分析的方法，它通過核苷酸和模板結合後釋放的焦磷酸引發酶級聯反應，促使熒光素發光並進行檢測。這項技術曾經被用作單核苷酸多態性（SNP）的基因型和單倍型的檢測，以及細菌和病毒的鑒定和分型研究。這項技術的一個主要特點是在Pyrogarm™軟體上顯示的峰值高度來自於序列分析的原始數據，通過峰值的高度可以精確的檢測混合DNA模板中等位基因的頻率。
目前甲基化研究方面，很多甲基化定量分析的報道採用亞硫酸氫鹽處理甲基化樣本，並用混合的PCR產物
作為校正。其主要原理是：亞硫酸氫鹽可以將沒有甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而在適當的實驗條件下甲基化的胞嘧啶保持不變。因而，用它處理樣本後，再進行PCR擴增，甲基化的位點可以被當作一個C/T的SNP來處理，它的基因頻率為0－100％。在此，我們給大家介紹一個研究人員使用Pyrosequencing技術分析並精確定量DNA甲基化水平的例子。
研究者在一個Pyrosequencing反應中同時檢測了6個甲基化位點。這種方法同樣可以用於石蠟包埋的組織，並且具有較高的重復性和精確性。實驗選擇谷胱甘肽-S-轉移酶π（GSTP1）轉錄啟動位點的CpG島進行檢測。這些位點在正常前列腺組織中是非甲基化的，而在腫瘤樣本中高甲基化。通過PCR擴增一個包含17個甲基化多態位點140bp的片段，並用4個測序引物研究其中15個位點（Table 1）。使用在線的SNP測序引物設計軟體（Pyrosequencing AB）設計測序引物，其中一些甲基化多態性位點用最可能的鹼基所代替，以減少計算的數量。再通過人工檢測測序引物可能存在的錯配。此外，同時在PSQ 96MA DNA分析儀上運行空白對照，扣除由測序引物、生物素標記的引物或是模板引起的背景。
PCR引物設計完全與模板相匹配，不覆蓋任何甲基化多態性區域。使用10ng亞硫酸氫鹽轉化的DNA樣本或是10 fmol純化的PCR產物，10 pmol 正向（5』-GTGATTTAGTATTGG-3』）和反向（5』-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3』）引物擴增GSTP1轉錄啟動位點的基因片段，擴增片段長度為144bp。反應體系為60 mM Tris-SO4, pH 8.9, 18 mM (NH4)2SO4, 1 mM MgSO4, 200 μM dNTPs，以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶，終體積為50μL。PCR循環設置：首先在95℃下變性4分鍾，然後在95℃ 30S，50℃ 45S以及72℃ 20S條件下重復50個循環，最後一步延伸步驟在72℃下4分鍾，中止反應。PCR反應在Eppendorf的Mastercycler 96
哺乳動物基因組中，DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化. DNA甲基化是一種基因外修飾，不改變DNA的一級結構; 他在細胞正常發育、基因表達模式以及基因組穩定性中起著至關重要的作用. 全基因組低甲基化，維持甲基化模式酶的調節失控和正常非甲基化CpG島的高甲基化是人類腫瘤中普遍存在的現象. DNA高甲基化是導致抑癌基因失活的又一個機制.
http://www.wjgnet.com/1009-3079/abstract_cn.asp?f=1420&v=11
C. 生物上基因診斷的步驟是什麼
1、核酸雜交：酸雜交是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的傳統方法。其原理是核酸變性和復性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復後又可依鹼基配對規律形成雙邊結構。雜交通常在一支持膜上進行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據檢測樣品的不同又被分為DNA印跡交（Southern blot hybridization ）和RNA印跡雜交（Northern blot hybridization）。其基本過程包括下列幾個步驟。
（1）制備樣品：首先需要從待檢測組織樣品提取DNA或RNA。DNA應先用限制性內切酶消化以產生特定長度的片段，然後通過凝膠電泳將消化產物按分子大小進行分離。一般來說DNA分子有其獨特的限制性內切酶圖譜，所以經酶切消化和電泳分離後可在凝膠上形成特定的區帶。再將含有DNA片段的凝膠進行變性處理後，直接轉印到支持膜上並使其牢固結合。這樣等檢測片段在凝膠上的位置就直接反映在了轉印在膜上。RNA樣品則可直接在變性條件下電泳分離，然後轉印並交聯固定。
（2）制備探針：探針是指一段能和待檢測核酸分子依鹼基配對原則而結合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。在核酸雜交實驗中，探針需要被標記上可直接檢測的元素或分子。這樣，通過檢疫與恩印膜上的核酸分子結合上的探針分子，既可知道被檢測的核酸片段在膜上的位置，也就是在電泳凝膠上的位置，也就知道了它的分子大小。
（3）雜交：首先要進行預雜交，即用非特異的核酸溶液封閉膜上的非特異性結合位點。由於轉印在膜上的核酸分子已經是變性的分子，所以雜交過程中只需變性標記好的探針，再讓探針與膜在特定的溫度下反應，然後洗去未結合的探針分子即可。
（4）檢測：檢測的方法依標記探針的方法而異。用放射性同位素標記的探針需要用放射自顯影來檢測其在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法標記的探針則需要用相應的免疫組織化學的方法進行檢測。
D. DNA探針、DNA晶元
分類: 教育/科學 >> 學習幫助
問題描述:
它們的工作原理是什麼？
解析:
DNA探針技術又稱分子雜交技術，是利用DNA分子的變性、復性以及鹼基互補配對的高度精確性，對某一特異性DNA序列進行探查的新技術。
DNA探針是利用同位素、生物素等標記的特定DNA片斷，該片斷可大至寄生蟲基因組DNA，小至20個鹼基。
當DNA探針與待測的非標記單鏈DNA（或RNA）按鹼基順序互補結合時，以氫健將2條單鏈連接而形成標記DNA-DNA（或標記DNA-RNA）的雙鏈雜交分子。將未配對結合的核苷酸溶解後用檢測系統（放射自顯影或酶檢測等）檢測雜交反應結果。
由於DNA分子鹼基互補的精確性，單連DNA探針僅與樣品中變性處理的DNA單鏈出現配對雜交，由此決定了探針的特異性。
DNA晶元是一種縮小了的生物化學分析器。通過晶元上微加工獲得的微米結構和生物化學處理結合，便可將成千上萬的與生命相關的信息集成在一小塊玻璃晶元上。
採用晶元可進行生命科學和醫學中所涉及的各種生物化學反應，以達到對基因、抗原和活體細胞等進行測試分析的目的。通過分析可得到大量具有生物學、醫學意義的信息。
關於DNA晶元的設想可追溯到1989年，當時美國Affymetrix公司的科學家打算用許多分子研製一種硬幣般大小的裝置。他們想出一種巧妙的辦法，利用光刻法與光化學合成法相結合，在一塊平滑的玻璃片上，用不同的分子構建一個高密度網路。開始，他們把某些蛋白質堆放在玻璃片上，一名叫斯蒂芬·福多的年輕科學家立即看出了採用DNA的可能性，他意識到，晶元上的DNA分子就好像一條條細細的分子「維可牢(velcro)」(「維可牢」是一種尼龍刺粘搭鏈，兩面相合即粘住，一扯即分開，用以替代服裝上的紐扣等)可選擇性地與某些基因，即DNA的短片段結合，從而檢查出變異型基因。福多在理論上推定，讓未知的DNA樣品與分布在DNA晶元上已知的DNA序列接觸，就能對其作出鑒定。因為DNA雙螺旋的兩條單核苷酸鏈總是遵循「鹼基互補」的原則配對，即一條鏈上的A總是與另一條鏈上的T相結合，C也總是與G相結合。因此，當一條鏈上的鹼基序 *** 定之後，即可推知另一條鏈上的鹼基序列。這類帶有已知DNA序列的晶元就能檢測突變基因或鹼基的各種改變。
E. 怎樣篩選目的基因
有4種方法：
1、從基因文庫中獲得目的基因.
方法：
第一步,通過PCR方法將目的基因已知的部分核苷酸序列擴增出來,進行放射性同位素標記（也可以用別的標記方法進行,如生物素、熒光素等）,即用標記了放射性同位素的目的DNA片段作為探針,與擴增出來的DNA雜交.
第二步,將基因文庫中的所有菌落轉移至硝酸纖維膜上（也可以用其他類型的膜）,然後,通過處理溶解消化掉細菌中的蛋白質,並使DNA固定在膜上.
第三步,按Southern雜交的方法進行雜交.
第四步,在X光底片上出現黑斑的菌落,這表明這個菌落中含有所需要的目的基因（若選用別的標記方法,有陽性信號的菌落則含有所需要的目的基因）.
第五步,從該菌落中再提取目的基因.
2、PCR 篩選法方法：
第一步：將反應體系（包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應所需的離子等）加熱至90～95 ℃,使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開,變成單鏈DNA,作為互補鏈聚合反應的模板.
第二步：將反應體系降溫至55～60 ℃,使兩種引物分別與模板DNA鏈3′端的互補序列互補配對,這個過程稱為復性.
第三步：將反應體系升溫至70～75 ℃,在耐高溫的DNA聚合酶催化作用下,將與模板互補的單個核苷酸加到引物所提供的3-OH上,使DNA鏈延伸,產生一條與模板鏈互補的DNA鏈.
上述三步反應完成後,一個DNA分子就變成了兩個DNA分子,隨著重復次數的增多,DNA分子就以2n的形式增加.PCR的反應過程都是在PCR擴增儀中完成的.
3、核酸雜交法、
DNA和DNA分子之間的雜交.目的基因是否整合到受體生物的染色體DNA中,這在真核生物中是目的基因可否穩定存在和遺傳的關鍵.如何證明這一點,就需要通過Southern雜交技術.基本做法是：
第一步,將受體生物DNA提取出來,經過適當的酶切後,走瓊脂糖凝膠電泳,將不同大小的片段分開；
第二步,將凝膠上的DNA片段轉移到硝酸纖維素膜上；
第三步,用標記了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作為探針與硝酸纖維素膜上的DNA進行雜交；
第四步,將X光底片壓在硝酸纖維素膜上,在暗處使底片感光；
第五步,將X光底片沖洗,如果在底片上出現黑色條帶,則表明受體植物染色體DNA上有目的基因.
4、免疫篩選法
Western雜交──蛋白質分子（抗原—抗體）之間的雜交.它是檢測目的基因是否表達出蛋白質的一種方法.具體做法是：
第一步,將目的基因在大腸桿菌中表達出蛋白質；
第二步,將表達出的蛋白質注射動物進行免疫,產生相應的抗體,並提取出抗體（一抗）；
第三步,從轉基因生物中提取蛋白質,走凝膠電泳；
第四步,將凝膠中的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上；
第五步,將抗體（一抗）與硝酸纖維素膜上的蛋白雜交,這時抗體（一抗）與目的基因表達的蛋白（抗原）會特異結合.由於這種抗原—抗體的結合顯示不出條帶,所以加入一種稱為二抗的抗體,它可以與一抗結合,二抗抗體上帶有特殊的標記.如果目的基因表達出了蛋白質,則結果為陽性.
F. 如何驗證生物素探針活性劑
用比色法。
1、用DNA稀釋緩沖液，稀釋生物素醯化標准DNA，濃度為0、1、2、5、10和20 pg/μl。以同樣稀釋液處理待測DNA。
2、 對干硝酸纖維素濾膜：每個稀釋度取1 μl 點膜，在80℃供干約1 h接步驟4。
3、 對於足龍膜：每個稀釋度取1 μl 點膜，晾乾後用紫外照射法將DNA交聯至膜上。接步驟4或化學發光檢測。
4、用少量體枳AP7.5液沆膜1 min，在密封袋中（剪成合適大小），用10 ml 封阻液，37℃封閉1 h 注意排出氣泡。
5、稀釋10 μl 親和素-AP交聯物至10 ml AP7.5。剪去封閉袋一角擠出封閉液，用親和素-AP交聯物代替，重新封口，在旋轉平台室溫揺盪10 min。
6、從袋中取出濾膜移到一個淺盤中，用200 ml AP7.5冼2次，每次15 min。再用 200m AP9. 5洗1次，10 min，輕微搖盪。
7、加入33 μl 75mg/ml 的NBT至7.5 ml AP9.5液中，混勻。再加25μl50mg/ml BCIP，混勻。
8、在淺盤中避光溫育溶液，不時觀察直至發色達到滿意程度為止。
9、加TE pH8，以終止反應，比較測定DNA樣品和標准DNA的顏色強度以確定生物素醯化dNTP的摻入效率。如果該探計至少有一半標准品的強度，它可作為探針用於原位雜交。
G. 怎樣用生物素標記dna
先用限制性內切酶在DNA上切出兩個粘性末端，然後在DNA連接酶的配合下用與這個粘性末端相配的有標志性的（可以是放射性和熒光性等同位素一般屬於放射性）DNA片段標記出來，簡單地說就是這樣～