A. 微生物的擴大培養為什麼要得到由單個細胞繁殖而來的菌落呢
有時單菌落很多次，你可以從單細胞繁殖，它必須重復分離純種的方法有很多你第一次面臨著非常全面的，可以看看。
微生物實驗室分離純化方法日期:2010-03-01瀏覽次數：18
混合微生物種群僅包含某一種或一個微生物過程稱為微生物的分離和純化。在分子生物學的研究和應用，不僅
只包含一個特定的方法或微生物的過程稱為微生物的分離和純化，混合微生物種群中分離。在分子生物學的研究和應用，不僅通過混合的天然微生物的分離和純化技術分離出特定的微生物，但也一定要注意保持微生物純培養物的「純潔」，以防止其他微生物的污染。
1，與固體培養基中分離和純化
單個微生物的合適的固體介質的表面或內部生長，繁殖，在一定程度上，可以形成可見的，是一個一定的形態結構的子細胞生長組稱為菌落。即使當表面的固體培養基許多菌落到細菌的草坪成為此。不同的微生物的生長和形成的菌落在一個特定的介質或細菌草坪通常有穩定的特點，可以成為微生物的分類和鑒定的重要依據。大多數細菌，酵母，以及許多真菌和單細胞藻類，形成孤立的固體培養基上的菌落，用一個合適的片劑分離方法是很容易獲得的純培養。所謂的平面，即培養板中提到的，它是指在固體培養基倒入無菌的陪替氏培養皿中，並冷卻和固化後，盛固體培養基平板。此方法包括一個單一的分離微生物，並固定在固體培養基的表面或內部的。固體培養基凝固與瓊脂凝膠材料中，每一個獨立的活微生物的生長，繁殖，形成菌落，菌落形成可移植的。最常見的分離，培養的微生物瓊脂固體培養基上是一個堅實的中小板。容易被科克成立100多年來，一直是最常見的手段的不同菌株板分離微生物純培養。
1.1稀釋倒平板法
第一個微生物懸浮液了一系列的稀釋（如1:10,1:100,1:1000,1:10000），然後稀釋劑一點，並已熔化和瓊脂培養基冷卻至50℃或約混合，振搖後，傾入消毒的陪替氏培養皿，直到在瓊脂凝固後，使細菌的瓊脂平板中，並培養一定的時間，可能會出現的菌落。如果稀釋適當地在平坦的表面上出現或瓊脂培養基中，可以分散的單個菌落，菌落可能傳播由細菌細胞中，就形成了。然後挑取單個菌落，或重復以上操作數次，就可以得到一個純粹的文化。
1.2擴展板的方法可以很容易地導致死亡的一些熱敏感的菌株，並利用微生物懸浮液加入熱介質，然後倒平板電腦也導致一些稀釋倒平板法嚴格的需氧細菌缺乏氧氣由於固定在瓊脂中間影響其生長，因此純種的分離方法是微生物學研究的擴散板方法中使用。其做法是第一熔融培養基傾入無菌的陪替氏培養皿中，以制備無菌的片劑，冷卻和固化後，一定量的微生物的懸浮液逐滴加入到在平板表面，然後作為一個無菌玻璃從整個板的表面均勻地分散塗布棒桿菌，拾取單個菌落培養後（圖1）。
圖1擴展板的方法
1.3平板劃線法
最簡單的方法分離的微生物平板劃線法，即接種環無菌精選小料要分開的連續劃線無菌平坦面（圖2），微生物細胞的數目將減少與劃線的數目增加，並且逐漸分散，如果越過如果合適，該微生物可以11分散後的培訓，上述平面板的表面上，得到單菌落。有時單菌落，它必須重復多次，然後才能得到純種分離的單細胞繁殖。其原理是，微生物的樣品多次的固體培養基的表面達到分離的目的，從點到線「稀釋」。劃線的方法很多，常見的容易出現的單菌落劃線的斜杠法曲線法，網格法，輻射，四格的方法。
圖2平板劃線法
1.4稀釋搖管
固體培養基分離嚴格厭氧菌的特殊性，，如果機體暴露在空氣中立即死亡，可以准備通常的方法平板，然後放置在一個封閉的容器中培養，並在容器中的氧氣可以是化學，物理或生物的方法來清除。對於那些誰是更敏感的氧厭氧微生物純培養，分離培養法都不能動搖稀釋管，它是另一種形式的稀釋傾注法。管加熱的第一串聯盛無菌瓊脂培養基瓊脂熔化後，冷卻並維持在50℃左右，梯度稀釋的材料，可以與這些管分離，管快速搖動均勻，冷凝後，在瓊脂表面傾倒滅菌的液體石蠟和固體石蠟，介質和空氣的混合物的柱層被分離。培養後，形成的菌落在瓊脂上在中間的列。挑取單菌落，移植，需要使用無菌針頭蓋和用毛細管插入瓊脂和它們之間的壁進入無菌無氧氣體中除去液體石蠟 - 石蠟，瓊脂柱吸出，放置在陪替氏菜用無菌刀瓊脂柱切成薄片觀察和殖民地移植。
2，用液體培養基中分離和純化
大多數細菌和真菌分離使用的板方法通常是令人滿意的，因為它們是在固體介質中的大多數物種上看起來很不錯。然而，迄今為止，不是所有的微生物，可以在固體培養基上生長，例如，一些大的細菌的細胞，許多原生動物和藻類等，這些微生物需要使用液體介質中分離，得到的純培養。使用液體培養基中分離和純化的
稀釋法。在液體培養基中，接種物的順序稀釋以獲得高程度的稀釋效應，少於一個微生物是在試管中分配。大多數的管子，如果稀釋後沒有微生物的生長，並在體外培養中得到的微生物的生長可能然後有一個純培養。稀釋後管的比例將大幅增加微生物的生長，獲得純培養的降水。因此，稀釋法，固液分離，必須在許多平行試管稀釋，大部分（一般應不超過95％）表明沒有增長。
3，
分離的單細胞（孢子）只能從該總數的類型的混合微生物種群的優點是被隔離的稀釋方法的一個重要的缺點。在自然界中，許多微生物在混合組是少數。在這種情況下，您可以採取的顯微切割法直接分離細胞或單個個體進行培養，獲得純培養物，被稱為單細胞（或單孢子）分離方法，從一個混居的。單細胞分離難度和細胞或個人的大小成反比，較大的微生物，如藻類，原生動物更容易，個別的小細菌是困難得多。的
較大的微生物，可以使用毛細管提取單個個體，並在大量的滅菌介質轉印洗滌數次除去較小的微生物污染。此操作可以在低倍率的顯微鏡進行，如在解剖顯微鏡下。相對小的單個微生物，需要在顯微鏡下使用顯微操作使用毛細管或微觀的針，鉤，環拾取一個單一的微生物細胞或孢子，得到純培養。在顯微鏡下的顯微操作在沒有單細胞分離，也有一些替代的方法可以使用??，例如，可以通過適當稀釋的樣品制備後成小液滴，在顯微鏡下觀察到的，並只選擇一個單元格含有液體純培養分離。分離的單細胞操作技術有更高的要求，使用大多限於高度專業化的科研。分離
4，選擇培養的培養基或培養條件沒有能夠滿足所有的微生物的生長的需要，所有的培養基中選擇在一定程度上性質。如果在某種微生物的生長需要是已知的，可以設計適合於該微生物的生長的特定的環境，從而能夠以該微生物選自混合微生物種群進行培養，雖然在混合微生物種群種微生物可能是是少數。等的分離，在被稱為選擇培養分離，特別是適合於從自然界分離的，找到有用的微生物的微生物的純培養的技術通過選擇培養。自然，在大多數場合中的微生物群落是由各種各樣的微生物，分離所需的特定的微生物是非常困難的，尤其是當存在時相比，以非常小的其他微生物的量和一定的微生物種，單用途板在一般的稀釋方法幾乎是不可能的。這種微生物的分離，必須基於的特性的微生物，包括營養，生理，生長條件，培養菌株。或抑制大多數微生物不能生長，或造成這種微生物的成長環境，有利於社區的數量的增加，因此，在一定的時間來培養板稀釋的純培養??分離細菌。
4.1使用在選擇平板
直接分離，根據被分離微生物功能選擇不同的培養條件下，也有各種方法可以使用??。要分開，例如，嗜熱菌，可以在高溫條件下培養;分離某些抗生素的耐葯菌株，並用抗生素，可以分離成板，一些微生物，如螺旋體，粘細菌，藍藻等在的瓊脂平板的表面。或的士車廂內，他們可以利用的滑動特性的分離和純化，因為滑行可以讓自己和其他微生物不能單獨移動。板的微生物群落，使微生物在跑道上滑行滑行前挑接種反復進行，以獲得一個純粹的文化。
4.2富集培養
富集培養的原則和方法是很簡單的，不同利用不同的微生物的生命活動的特點，制定具體的環境條件下，唯一的條件相適應的微生物強勁的增長，它在社會上，可以很容易地分離到所需的特定微生物數量大大增加。富集條件可以根據需要分離的物理，化學，生物，和集成的許多方面，如溫度，pH，紫外線，高的壓力，光，氧氣，營養等許多方面的微生物的特性選擇。在相同的培養基和培養條件下，它是容易反復移位的物種的菌株後，在固體培養基上生長，並最終濃縮的單個菌落。如果你想分開一段寄生菌的樣品接種到相應敏感宿主細胞群體，有很大的增長。通過反復移動的物種可以得到純寄生菌。
5，二元文化
分離，得到純培養的目的。然而，在某些情況下，這是很難做到的。但可用的二進制文化作為替代品的純化和培養。文化包含兩個或更多種微生物混合培養作為一個已知的，並僅含有2種微生物的培養，但也有是同時保持意識文化稱為二進制文化之間的特定關系。如二進制文化是最有效的方式來保存病毒，因為病毒是細胞生物的嚴格細胞內寄生。有些細胞和微生物也有嚴格的生物細胞內寄生物，或特殊的共生關系。這些微生物，二元文化是最接近的純培養物的培養方法，在控制的條件下，可以在實驗室中實現。此外，原生動物大鱷微小的微生物很容易在實驗室培養的方法與雙文化，文化的微生物原生動物和狩獵。例如，纖毛蟲，變形蟲和粘菌。
幾種方法如上所述，平板分離方法一般用於實驗室微生物的分離和純化。在固體培養基上的單個菌落的微生物的生長和形成，通常是由一個細胞組件製成的復製品。單菌落被選中，並獲得一個純粹的文化。可以通過稀釋塗布平板或板裸奔技術的方法，以獲得單個菌落。值得注意的是，通過在平板上生長的單個菌落，分離從微生物種群不一定可以保證的純培養。因此，純文化的決心，除了觀察菌落特徵，但也與顯微鏡檢查，以確定個體的形態特徵，一些純培養的微生物通過一系列的分離和純化過程，以及各種特性，以獲得。
B. 為什麼要進行微生物菌種改良，有哪些方法
微生物的代謝產物或者其本身的菌種特性能夠為人們利用，在生物醫葯，食品和發酵行業有著不可替代的作用，但是，剛從自然界分離得到的菌種，原始特性不能滿足大規模的需要，因此，通過菌種改良的方法篩選菌種，能夠降低生產成本，滿足大規模生產需要。
菌種育種方法很多，有推理育種，基因組重排，原生質體融合，抗性篩選，代謝工程等多種方法。
C. 3 微生物發酵生產的工廠，為什麼都要進行菌種的擴大培養，一般如何進行菌種的擴大培養
在微生物發酵生產時，為保證足夠的接種量，常採用菌種的擴大培養。
用以生產的菌株第一步要在實驗室環境下培養達700ml以上菌種時，接入一級種子罐種培養1-2天後，輸入二級種子罐培養1-2天，再輸入發酵罐中培養7天左右。
發酵時出現產量不穩定由多種因素引起，種子質量，接種量，原材料的質量，在發酵過程中糖、氮的補充，發酵控制條件不成熟等。
原材料的影響不大，除非是賣到發霉變質的，或者是質量嚴重不合格的原材料。
本人認為重要可能是發酵過程中糖氮的補充，掌握不成熟。易引起發酵產量不穩定。
D. 微生物培養實驗菌種來源
不知道你為什麼要做這個微生物培養的實驗，一般做微生物培養是為了從病人的無菌體液中分離出細菌（這個一般為單一細菌，例如腦脊液，血液，胸腹水等），這些體液經過無菌採集後塗於相應微生物培養基上；還有就是從有正常菌群生長的人體排泄物中分離出致病菌（例如痰液，糞便等）。上述標本經過分區劃線在最後一區會得到單個的菌落，這些單個的菌落就是單一的菌種。
E. 生理生化實驗，為什麼選用大腸桿菌，枯草芽孢桿菌作為試驗菌
實驗一常用培養基的制備、滅菌與消毒一、實驗目的了解培養基的配製原理；掌握配製培養基的一般方法和步驟；了解常見滅菌、清毒基本原理及方法；掌握乾熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。二、實驗原理培養基是人工按一定比例配製的供微生物生長繁殖和合成代謝產物所需要的營養物質的混合物。培養基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水。根據微生物的種類和實驗目的不同，培養基也有不同的種類和配製方法。牛肉膏蛋白腖培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基，有時又稱為普通培養基。由於這種培養基中含有一般細胞生長繁殖所需要的最基本的營養物質，所以可供微生物生長繁殖之用。乾熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質變性從而達到殺死微生物的效果。三、試劑與器材1.器材試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等。2.試劑牛肉膏、蛋白腖、NaCl、瓊脂四、實驗內容1.稱量→溶化→調pH→過濾→分裝→加塞→包紮→滅菌→無菌檢查2.乾熱滅菌：裝入待滅菌物品→升溫→恆溫→降溫→開箱取物3.高壓蒸汽滅菌：加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恆壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查4.過濾除菌：組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌五、關鍵步驟及注意事項1.要嚴格按配方配製。2.調pH不要過頭。3.乾熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時間控制，70ºC以下放物、取物。4.高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱後排除冷空氣，到時降壓回零取物。5.過濾除菌要注意各部件滅菌，壓濾時，壓力要適當，不可太猛太快，濾膜要注意清洗保存。六、思考題1.培養基配好後，為什麼必須立即滅菌?如何檢查滅菌後的培養基是無菌的?2.在配製培養基的操作過程中應注意些什麼問題?為什麼?3.培養微生物的培養基應具備哪些條件?為什麼?4.培養基的配製原則是什麼?實驗二土壤中微生物分離純化培養一、實驗目的掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固體培養基和液體培養基中的生長特徵；進一步熟練和掌握微生物無菌操作技術；掌握微生物培養方法。二、實驗原理從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的分離、純化方法：單細胞挑取法，稀釋塗布平板法，稀釋混合平板法，平板劃線法稀釋塗布平板法步驟：倒平板－制備土壤污水稀釋液－塗布－培養－挑菌落；平板劃線法步驟：倒平板－標記培養基名稱－劃線。三、試劑與器材1.器材盛9m1無菌水的試管、盛90m1無菌水並帶有玻璃珠的三角燒瓶、無菌玻璃塗棒、無菌吸管、接種環、酒精燈、無菌培養皿、顯微鏡、血細胞計數板等。2.試劑牛肉膏蛋白腖培養基，高氏1號培養基，查氏培養基四、實驗內容1.土壤稀釋液的制備2.微生物分離純化：稀釋塗平板法，平皿劃線分離法，微生物培養技術五、關鍵步驟及注意事項1.掌握含菌培養基的配製，嚴格控制溫度。2.平板劃線應防止染菌，同時應注意劃線深度及密度。六、思考題1.如何確定平板上某單個菌落是否為純培養?請寫出實驗的主要步驟。2.如果要分離得到極端嗜鹽細菌，在什麼地方取樣品為宜?並說明理由。實驗三菌種保藏一、實驗目的1.學習並掌握菌種保藏的基本原理。2.掌握常用的幾種不同的菌種保藏方法。二、實驗原理微生物個體微小、代謝旺盛、生長繁殖快，如果保存不妥容易發生變異和雜菌污染，甚至導致細胞死亡等現象。因此，保存好菌種是非常必要和重要的。常用的菌種保藏方法包括傳代培養法、載體法、懸液法、冷凍法和真空乾燥法三、試劑與器材1.材料大腸桿菌、青黴菌、放線菌2.試劑液體石蠟、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％鹽酸、無水氯化鈣、食鹽、乾冰3.器材無菌吸管、無菌滴管、無菌培養皿；安額管、凍干管、40目與100目篩子、油紙、濾紙條(0.5X1.2cm)、乾燥器、真泵器、真空泵、真空壓力表、噴燈、L形五通管、冰箱、低溫冰箱(—30℃)、超低溫冰箱和液氮罐等。四、實驗內容1.斜面保藏法2.液體石蠟法3.穿刺保藏法4.砂土管保藏法5.冷凍真空乾燥保存法五、關鍵步驟及注意事項1.清楚各種保藏方法的優缺點，針對不同要求選擇適宜的保藏方法。2.熔封安瓶時防止封閉不嚴。3.液氮凍存操作應防止凍傷。六、思考題根據你自己的實驗。談談1--2種菌種保藏方法的利弊?實驗四細菌形態觀察及單染色一、實驗目的1.了解簡單染色法的原理，並掌握其操作方法。2.學習並掌握微生物塗片、染色的基本技術和無菌操作技術。3.鞏固顯微鏡(油鏡)的使用方法。4.初步認識細菌的形態特徵。二、實驗原理細菌個體微小，且較透明，必須藉助染色法使菌體著色，與背景形成鮮明的對比，以便在顯微鏡下進行觀察。根據實驗目的不同，可分為簡單染色法、鑒別染色法和特殊染色法等。簡單染色法是最基本的染色方法，是利用單一染料對細菌進行染色。此法操作簡便，適用於菌體一般形狀和細菌排列的觀察。常用鹼性染料進行簡單染色。三、試劑與器材1.材料大腸桿菌，枯草芽孢桿菌2.試劑呂氏鹼性美藍染液(或草酸銨結晶紫染液)、齊氏石炭酸復紅染液。3.器材顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環、雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)等。四、實驗內容簡單染色法：塗片→乾燥→固定→染色→水洗→乾燥→鏡檢五、關鍵步驟及注意事項1.塗片時，生理鹽水及取菌不宜過多，塗片應盡可能均勻，2.水洗步驟水流不宜過大，過急，以免塗片薄膜脫落。六、思考題1.你認為制備細菌染色標本時，尤其應該注意哪些環幣?2.為什麼要求製片完全乾燥後才能用油鏡觀察?3.如果你的塗片未經熱固定，將會出現什麼問題?如果加熱溫度過高、時間太長，又會怎樣呢?實驗五放線菌及黴菌形態觀察一、實驗目的1.了解放線菌、黴菌形態觀察的原理。2.學習並掌握觀察放線菌、黴菌形態的操作方法。3.初步了解放線菌、黴菌的形態特徵。二、實驗原理放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽性細菌。常見放線菌大多能形成菌絲體，緊貼培養基表面或深入培養基內生長的叫基內菌絲(簡稱「基絲」)，基絲生長到一定階段還能向空氣中生長出氣生菌絲(簡稱「氣絲」)，並進一步分化產生孢子絲及孢子。有的放線菌只產生基絲而無氣絲。在顯微鏡下直接觀察時，氣絲在上層、基絲在下層，氣絲色暗，基絲較透明。孢子絲依種類的不同，有直、波曲、各種螺旋形或輪生。黴菌可產生復合分枝的菌絲體，分基內菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產生孢子。黴菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲)及孢子的形態特徵是識別不同種類黴菌的重要依據。黴菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗得多，常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。人們設計了各種培養和觀察方法，這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌自然生長狀態下的形態特徵。本實驗採用插片法。插片法：將放線菌接種在瓊脂平板上，插上滅菌蓋玻片後培養，使放線菌菌絲沿著培養基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻上。觀察時，輕輕取出蓋玻片，置於載玻片上直接鏡檢。這種方法可觀察到放線菌自然生長狀態下的特徵，而且便於觀察不同生長期的形態。三、試劑與器材1.材料黑麴黴、青黴和根霉，細黃鏈黴菌或青色鏈黴菌，滅菌的高氏I號瓊脂和滅菌的查氏培養基。2.實驗器材經滅菌的：平皿、玻璃紙、無菌吸管、蓋玻片、玻璃塗棒，以及載玻片、接種環、接種鏟、鑷子、顯微鏡等。四、實驗內容倒平板→接種→插片→培養→鏡檢五、關鍵步驟及注意事項1.倒平板要厚一些，接種時劃線要密。2.插片時要有一定角度並與劃線垂直。3.觀察時，宜用略暗光線；先用低倍鏡找到適當視野，更換高倍鏡觀察。4.如果用0.1%美藍對培養後的蓋玻片進行染色後觀察，效果會更好。六、思考題1.鏡檢時，你如何區分放線菌的基內菌絲和氣生菌絲?2.你認為黴菌和放線菌菌絲的主要區別是什麼？實驗六革蘭氏染色及芽孢染色一、實驗目的1.了解革蘭氏染色法和芽孢染色法的原理，並掌握其操作方法。2.了解革蘭氏染色法在細菌分類鑒定中的重要性。3.學習並掌握微生物塗片、染色的基本技術和無菌操作技術。4.學習顯微鏡(油鏡)的使用方法。5.初步認識細菌的形態特徵。二、實驗原理革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結晶紫進行染色，再用碘液媒染，然後用乙醇(或丙酮)脫色，最後用復染劑(如番紅)復染。經此方法染色後，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色(紅色)，該菌屬於革蘭氏陰性菌。革蘭氏染色反應是細菌重要的鑒別特徵，為保證染色結果的正確性，採用規范的染色方法是十分必要的。芽孢染色法的基本原理，用著色力強的染色劑孔雀綠或石炭酸復紅，在加熱條件下染色，使染料不僅進入菌體也可進入芽孢內，進入菌體的染料經水洗後被脫色，而芽孢一經著色難以被水洗脫，當用對比度大的復染劑染色後，芽孢仍保留初染劑的顏色，而菌體和芽孢囊被染成復染劑的顏色，使芽孢和菌體更易於區分。三、試劑與器材1.材料：枯草芽孢桿菌12～18h營養瓊脂斜面培養物，大腸桿菌約24h營養瓊脂斜面培養物2.試劑革蘭氏染色液(結晶紫液、碘液、95％乙醇、番紅液)。5％孔雀綠水溶液3.實驗器材小試管、滴管、燒杯、試管架、濾紙、木夾子、載玻片、蓋玻片、凹載玻片、無菌水、顯微鏡等、接種環、雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)、擦鏡紙、生理鹽水等。四、實驗內容1.革蘭氏染色法製片→初染→媒染→脫色→復染→鏡檢。2.Schaefer-Fulton氏染色法製片→染色→水洗→復染→水洗→鏡檢。五、關鍵步驟及注意事項1.塗片時，生理鹽水及取菌不宜過多，塗片應盡可能均勻，2.乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關鍵環節，嚴格掌握脫色時間。六、思考題1.你認為要得到正確的改良的革蘭氏染色結果必須注意哪些操作?關鍵在哪一步?為什麼?2.現有一株細菌寬度明顯大於大腸桿菌的粗壯桿菌，請你鑒定其革蘭氏染色反應。你怎樣運用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對照菌株進行塗片染色，以證明你的染色結果正確性。3.你的染色結果是否正確?如果不正確，請說明原因。4.若塗片中觀察到的只是大量游離芽孢，很少看到芽孢囊及營養細胞，你認為這是什麼原因?5.說明芽孢染色法的原理。用簡單染色法能否觀察到細菌的芽孢?實驗七酵母菌的形態觀察及死活細胞的鑒定一、實驗目的1.觀察酵母菌的形態特徵、出芽生殖方式，並掌握酵母菌與細菌形態特徵的區別。2.學習鑒別死活細胞的實驗方法。二、實驗原理酵母菌是單細胞的真核微生物，菌體比細菌大而且不運動。酵母菌的繁殖方式分為無性繁殖和有性繁殖兩種，以無性繁殖為主。芽殖是酵母菌普遍的無性繁殖方式，少數為裂殖；有性繁殖是產生子囊和子囊孢子。本實驗是通過美藍染液水浸片和水一碘液水浸片來觀察酵母的形態和芽殖方式。美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型無色。用美藍對酵母活細胞染色時，由於細胞的新陳代謝作用，細胞內具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變為無色的還原型，而對代謝作用微弱或死細胞，無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍染成藍色或淡藍色。因此，不僅用此法可觀察酵母細胞形態，也可用來鑒別酵母菌的死細胞和活細胞。三、試劑與器材1.材料釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或卡爾酵母(Saccharomycescalsbergensis)培養2天左右的麥芽汁(或豆芽汁)液體培養物。2.試劑0.05％和O.1％呂氏鹼性美藍染色液、革蘭氏染色用的碘液。3.器材顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環、灑精燈等。四、實驗內容1.美藍浸片觀察酵母培養→製片→染色→鏡檢→30分鍾後再鏡檢2.水-碘浸片觀察五、關鍵步驟及注意事項1.染液不宜過多或過少，否則，在蓋上蓋玻片時，菌液溢出或出現大量氣泡。2.用鑷子取一塊蓋玻片，先將一側與菌液接觸，然後慢慢將蓋玻片放下，使其蓋在菌液上，蓋玻片不宜平著放下，避免氣泡產生。六、思考題1.呂氏鹼性美藍染液濃度和作用時間的不同，對酵母菌死細胞數量有何影響?試分析其原因。2.在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特徵區別於一般細菌?實驗八微生物直接計數法及測微技術一、實驗目的1.了解血球計數板計數原理，並掌握計數方法。2.掌握用測微尺測定微生物大小的方法。二、實驗原理顯微鏡直接計數法是將一定稀釋的菌體或孢子懸液注入血球計數板的計數室中，於顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法。因為計數板是一塊特別的載玻片。其上由四條槽構成三個平台；中間較寬的平台又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平台上各刻有一個方格網，每個方格網共分為九個大方格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格(見圖2—3—44)；另一種是一個大方格分成16個中方格，每個中方格又分成25個小方格，無論哪種每個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為0．1mm，所以計數室的容積為0．1mm3。計數時，通常只用5個中格內的菌體(孢子)數即可。然後求出每個中方格的平均值，再乘上25或16，得出一個大方格中的總茵數，再換算成lml菌液中的總菌數。若設5個中方格中總菌數為N，菌液稀釋倍數為M，如果是25個中方格計數板，則計算方法為：lml菌液中的總菌數=平均每個中格中菌的個數×25×104×M=50000N•M(個)微生物細胞的大小是微生物基本的形態特徵，也是分類鑒定的依據之一。微生物大小的測定，需要在顯微鏡下，藉助於特殊的測量工具——測微尺，包括目鏡測微尺和鏡台測微尺。鏡台測微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般是將1mm等分為100格，每格長0．01mm(即10pm)。鏡台測微尺並不直接用來測量細胞的大小，而是用於校正目鏡測微尺每格的相對長度。三、試劑與器材1.材料釀酒酵母、藤黃微球菌和大腸桿菌的染色標本片、釀酒酵母24h馬鈴薯斜面培養物。2.實驗器材細胞計數板、顯微鏡、蓋玻片、無菌毛細滴管、目鏡測微尺、鏡台測微尺、載玻片、蓋玻片、顯微鏡等。四、實驗內容1.微生物直接計數法菌懸液制備→鏡檢計數室→加樣品→顯微鏡計數→清洗血細胞計數板2.微生物測微技術裝目鏡測微尺→校正→菌體大小測定五、關鍵步驟及注意事項1.防止加樣空氣泡產生。2.調節顯微鏡光線的強弱適當。六、思考題1.根據你的體會，說明用血細胞計數板計數的誤差主要來自哪些方面?應如何盡量減少誤差、力求准確?2.某單位要求知道一種乾酵母粉中的活菌存活率，請設計1～2種可行的檢測方法。3.為什麼更換不同放大倍數的目鏡或物鏡時，必須用鏡台測微尺重新對目鏡測微尺進行校正?實驗九大腸桿菌生長曲線的測定一、實驗目的1.了解大腸桿菌的生長曲線特徵和繁殖規律，並學會繪制生長曲線。2.復習光電比濁法測量細菌數量的方法。二、實驗原理將一定量的細菌轉入新鮮液體培養基中，在適宜的條件下培養細胞要經歷延遲期、對數期、穩定期和衰亡期四個階段。以培養時間為橫坐標，以細菌數目的對數或生長速率為縱坐標作圖所繪制的曲線稱為該細菌的生長曲線。不同的細菌在相同的培養條件下其生長曲線不同，同樣的細菌在不同的培養條件下所繪制的生長曲線也不相同。三、試劑與器材1.材料與試劑大腸桿菌、LB液體培養基70ml、分裝2支大試管(5ml／支)、剩餘60ml裝入250ml的三角瓶。2.器材722型分光光度計、恆溫振盪搖床、無菌試管、無菌吸管等。四、實驗內容編號→接種→培養→比濁測定五、關鍵步驟及注意事項1.測定OD值時，要求從低濃度到高濃度測定2.嚴格控制培養時間六、思考題1.根據實驗數據畫出生長曲線，並說明大腸桿菌生長特徵。2.如果用活菌計數法製作生長曲線，你認為會有什麼不同?兩者各有什麼缺點7．3.次生禮謝產物的大量積累在哪個時期?根據細菌生長繁殖的規律，採用哪些措施可使次生代謝產物積累?實驗十水中細菌總數的測定一、實驗目的1.學習水樣的採取方法和水樣細菌總數測定的方法。2.了解水源水的平板菌落計數的原理。二、實驗原理本實驗應用平板計數技術測定水中細菌總數。由於水中細菌種類繁多，它們對營養和其他生長條件的要求差別很大，不可能找到一種培養基在一種條件下，使水中所有的細菌均能生長繁殖，因此，以一定的培養基平板上生長出來的菌落，計算出來的水中細菌總數僅是一種近似值。目前一般是採用普通牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基。三、試劑與器材1.試劑牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基，滅菌水2.器材滅菌三角瓶，滅菌的帶玻璃塞瓶，滅菌培養皿，滅菌吸管，滅菌試管等。四、實驗內容1.水樣的採取2.細菌總數測定3.菌落計數方法五、關鍵步驟及注意事項1.注意全過程防止染菌六、思考題從自來水的細菌總數結果來看，是否合乎飲用水的標准？實驗十一細菌細胞的生化反應實驗一、實驗目的了解並掌握細菌鑒定中常用生理生化反應的原理和方法。二、實驗原理各種細菌由於具有不同的酶系統，致使它們能利用不同的底物，或雖然可以利用相同的底物，卻產生不同的代謝產物，因此可以利用各種生理生化反應來鑒別細菌。糖發酵是最常用的生化反應，存在於大多數細菌中。不同的細菌在糖的分解能力上存在很大的差異。有些細菌能分解某種糖並產生酸性物質(如乳酸、丙酸、醋酸等)和氣體(如二氧化碳、氫、甲烷等)，而有些細菌只產生酸不產生氣體。例如大腸桿菌分解乳糖和葡萄糖產酸並產氣，普通變形桿菌分解葡萄糖產酸產氣，但不能分解乳糖。酸的產生可利用指示劑來判斷。在培養基中加入溴甲酚紫(pH5．2為黃色，pH6．8為紫色)，當發酵產酸時，使培養基由紫色變為黃色。氣體的產生可由發酵試管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡的出現來驗證．三、試劑與器材1.材料大腸桿菌、普通變性桿菌、產氣桿菌、糖發酵培養基、蛋白腖水培養基、葡萄糖蛋白腖水培養基。2.試劑甲基紅試劑、40％KOH、5％a一萘酚、乙醚、吲哚試劑。3.實驗器材德漢氏小管、試管、接種環、恆溫培養箱。四、實驗內容培養基配製→編號→試管→接種→培養→觀察結果五、關鍵步驟及注意事項1.要嚴格按照培養基配方配製培養基。2.觀察結果時要注意滴加葯量及反應時間。六、思考題1.哪些生理生化試驗可用於區別大腸桿菌和產生腸桿菌?結果如何?2.做糖發酵試驗時應注意哪些問題?3.甲基紅試驗和伏一普試驗的最終產物如何?為什麼會出現不同的最終產物?實驗十二噬菌體的分離、純化及效價測定一、實驗目的1.學習分離、純化噬菌體的原理和方法2.觀察噬菌斑的形態和大小3.掌握噬菌體效價測定的基本方法二、實驗原理噬菌體是細菌的專性寄生物，自然界中凡是有細菌存在的地方，均可以發現其特異性的噬菌體，噬菌體侵入細菌細胞後，利用宿主細胞的酶系統進行復制和增殖，最終導致細菌細胞裂解，噬菌體從細胞中釋放出來，可以進一步侵染細菌細胞。在液體培養基中，噬菌體可以使渾濁的菌懸液變為澄清。在長有宿主細菌的固體培養基平板上，噬菌體可以裂解細菌形成透明的空斑，即噬菌斑，一個噬菌體產生一個噬菌斑，因此可以利用這個性質對噬菌體進行分離和效價的測定。噬菌體的效價是指噬菌體的濃度，即一毫升培養液中所含有的噬菌體數量。噬菌體效價的測定方法多採用雙層瓊脂平板法。先在培養皿中倒入底層固體培養基，凝固後再倒入含有宿主細菌和一定稀釋度噬菌體的半固體培養基。培養一段時間後，計算噬菌斑的數量。三、試劑與器材1.材料大腸桿菌、牛肉膏蛋白腖固體培養基、牛肉膏蛋白腖半固體培養基(含有瓊脂0．5％，試管分裝，每管3～5m1)、三倍濃縮的牛肉膏蛋白腖液體培養基。2.器材培養皿、無菌吸管、三角瓶、抽濾瓶、蔡氏細菌濾器、真空泵、陰溝污水。四、實驗內容噬菌體分離→噬菌體純化→效價測定五、關鍵步驟及注意事項1.噬菌體時要注意細菌濾器的型號。2.純化噬菌體時要注意形態、大小。3.效價測定時要注意雙層瓊脂平板法的使用技巧。六、思考題1.在固體培養基平板上為什麼能形成噬茵斑?2.從固體培養基平板上得到的噬菌斑數目，如何計算噬菌體的效價？
F. 微生物實驗微生物實驗為什麼洗細菌
防止被其他雜菌污染,影響實驗結果.雜菌是在微生物的分離、及純培養過程中出現的與分離培養菌種不同的其他菌種。1、競爭性雜菌主要是一些腐生性真菌，在培養料中與食用菌爭奪養料、水分和氧氣等，尤其是在栽培管理中的早期階段更易侵佔菌塊，分泌毒素，抑制食用菌體的擴展和蔓延。2、侵染性與非侵染性病害 侵染性病害包括真菌、細菌病害和線蟲病害等，它們都可以侵染食用菌體，造成菌絲萎縮和子實體腐爛。非侵染性病害主要是由一些不適宜的理化因素，如營養不良、水分供應失調、溫度過高或過低、日照過強或不足及有害物質引起的中毒所造成的生理紊亂。3、競爭性雜菌包括青黴、木霉、麴黴、鏈孢霉、毛霉和根霉等。在栽培過程中可以從雜菌的顏色、氣味、拮抗線三個方面來識別。
G. 為什麼選用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為常用的試驗菌
首先從微生物形態上分類：大腸為桿菌，金葡為球菌，枯草為產芽孢桿菌，主要為了區分桿菌、球菌、芽孢的不同形態受到的影響。
從實驗耐受性上分類，枯草的耐受力大於金葡，金葡大於大腸，根據耐受力的不同而研究。
從鑒定意義上，大腸、金葡以及枯草是非常常見的菌株，屬於模式菌株，更據有研究意義。
H. 所有微生物檢驗都要用到標准菌株嗎
所有微生物檢驗都要用到標准菌株。
標准菌株：由國內或國際菌種保藏機構保藏的，遺傳學特性得到確認和保證並可追溯的菌株。
標准菌株的復活或培養物的制備應按照供應商提供的說明或按已驗證的方法進行。