如何抽取原核生物rna

❶ 原核生物的RNA在哪裡DNA在哪裡

DNA在原核生物的擬核內，但有個例外，細菌是單細胞的原核生物，細胞質內含有質粒，質粒是小型環狀DNA分子。
RNA在原核生物的細胞質基質和核糖體內都有，像轉移RNA在基質里，信使RNA在核糖體里。
另外，在擬核區，也有RNA，是轉錄中的RNA。

❷ 原核生物也能轉錄出RNA

原核生物的基因組成
原核生物基因分為編碼區與非編碼區。
[編輯本段]編碼區與非編碼區的定義及位置
所謂的編碼區就是能轉錄為相應的信使RNA，進而指導蛋白質的合成，也就是說能夠編碼蛋白質。非編碼區則相反，但是非編碼區對遺傳信息的表達是必不可少的，因為在非編碼區上有調控遺傳信息表達的核苷酸序列。
非編碼區位於編碼區的上游及下游。在調控遺傳信息表達的核苷酸序列中最重要的是位於編碼區上游的RNA聚合酶結合位點。RNA聚合酶是催化DNA轉錄為RNA。，能識別調控序列中的結合位點，並與其結合。

❸ 真核生物（如小鼠）的質粒如何提取，請寫下詳細步驟，謝謝

對於小鼠來說，質粒只存在於線粒體中
質粒提取可分為三個部分
1 裂解細胞
2 質粒DNA與染色體DNA的分離
3 純化

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小鼠CD40Ig基因真核表達質粒的構建及鑒定

1 材料和方法

1.1 實驗動物 Balb-c小鼠，6周齡, 雌性, 購自北京大學醫學院實驗動物部。

1.2 質粒、菌株、細胞株和主要試劑 質粒pEGFP-N1、pGEM-T載體質粒、E coli.DH5a（天根公司）。低代次HEK293細胞株（本元正陽）。AdMaxTM Kit E試劑盒（Microbix Biosystems，Inc.）。Taq酶、T4 DNA連接酶（Takara公司）。限制性核酸內切酶XmaⅠ、Bgl II、Hind III（Biolabs）。Trizol 試劑、Lipofectamine 2000（Invitrogen）。逆轉錄試劑盒、PCR Master Mix（MBI）。質粒提取、膠純化試劑盒（QIAGEN）。DMEM高糖培養基、胎牛血清、胰酶（Gibco）。引物合成由上海生工公司完成，基因測序由北京諾塞基因研究中心有限公司完成。

1.3 構建小鼠CD40Ig基因真核表達質粒

1.3.1 小鼠脾臟總RNA的提取：將小鼠以頸椎脫臼法處死，取出脾臟，加入液氮研磨後，用Trizol試劑提取總RNA，方法按產品說明進行。

1.3.2 CD40、IgG2a Fc、GFP基因的制備：以小鼠脾臟總RNA為模板，oligo-dT為引物，RT-PCR合成cDNA，再以此cDNA為模板，用CD40和mIgG Fc特異引物進行PCR擴增，另以pEGFP-N1質粒為模板進行PCR擴增，引物及PCR反應條件見表1，分別獲得CD40、mIgG2a Fc和GFP基因。

1.3.3 質粒pGEM-IgG的構建：將IgG Fc的PCR產物與pGEM-T質粒進行TA連接反應，即10μl PCR產物加2μl的pGEM-T載體加10 U的T4連接酶，16 ℃過夜。取2μl的連接產物以氯化鈣法轉化大腸桿菌DH5α，用藍白斑方法挑選含氨苄青黴素抗性的白斑克隆，在3 ml LB培養基（含氨苄青黴素100 μg/ml）中37 ℃、80 r/min振盪培養過夜，提取質粒pGEM-IgG並測序。

1.3.4 質粒p516-IgG的構建：用Bgl II分別消化pGEM-IgG和pDC516，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳後進行膠純化。將IgG片段和pDC516線性載體按7:1的摩爾濃度比例加T4連接酶16 ℃過夜進行連接反應。取5μl連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α，用pDC516-f和mIgG-r引物組合進行菌落PCR篩選正向插入的重組子（見表2），將PCR陽性的重組子進行細菌培養，提取質粒並測序。

1.3.5 質粒p516-CD40-IgG融合基因的構建：用Xma I分別消化CD40的PCR產物和p516-IgG，將CD40片段和pDC516-IgG 線性載體進行連接（方法同上）。轉化大腸桿菌DH5α後，用pDC516-f和CD40-r引物組合進行菌落PCR篩選（見表2），將陽性結果的重組子進行細菌培養，提取質粒並測序。

1.3.6 PDC516-CD40-IgG-GFP質粒的構建：用Hind Ⅲ分別消化GFP的PCR產物和pDC516-CD40-IgG，將GFP片段和pDC516-CD-IgG 線性載體進行連接反應（方法同上），用GFP-f和pDC516-r引物組合進行菌落PCR篩選正向插入的重組子（見表2），提取質粒並測序。

1.3.7 PDC516-CD40-IgG-GFP質粒的大量制備：按QIAGEN EndoFree Plasmid Purification試劑盒說明進行制備，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳證實（見圖2），紫外分光光度儀測OD值，過濾除菌後-20 ℃保存備用。

1.3.8 重組質粒轉染293細胞：在6孔板中將2.0×105個細胞接種於2 ml含血清不含抗生素的DMEM中，在5% CO2、37 ℃培養箱中培養24 h，使細胞在轉染時鋪滿平板的60%～70%。用Lipofectamine 2000轉染試劑介導重組質粒轉染，在無菌EP管中准備A、B兩種溶液。A液：將4.0μg DNA溶於250μl無血清DMEM中，輕輕混勻；B液：將10μl Lipofectamine 2 000溶於250μl無血清培養液中，輕輕混勻，室溫孵育5 min。將A液和B液混合並混勻，室溫孵育20 min，以形成脂質體/DNA復合物。換去6孔板中舊的培養液，重新加入2 ml含血清不含抗生素的DMEM，逐滴加入500μl脂質體/DNA復合物。在5% CO2、37 ℃培養箱中培養24 h後換液。

2 結果

2.1 獲得小鼠CD40胞外區、IgG2a Fc段及GFP基因 引物CD40-f和CD40-r經PCR擴增的小鼠CD40胞外區基因片段為572 bp；引物mIgG-f和mIgG-r經PCR擴增的小鼠IgG2a Fc段為700 bp；引物GFP-f和GFP-r經PCR擴增的GFP基因片段為765 bp。瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。

2.2 pDC516-CD40-IgG-GFP真核表達質粒的成功構建

2.2.1 pDC516-IgG的構建：pGEM-T載體為3 000 bp的質粒，構建的pGEM-IgG質粒為3 700 bp。pGEM-T質粒的多克隆位點上游110 bp處含有T7 Primer序列，用T7+mIgG-r引物組合可擴增出約810 bp的片段，用T7 primer測序證實IgG序列的正確性。將IgG片段和pDC516線性載體進行連接反應，用pDC516-f測序證實IgG插入序列的正確性（見圖3）。

2.2.2 pDC516-CD40-IgG的構建：將CD40片段和pDC516-IgG線性載體進行連接反應，用引物pDC516-f測序證實CD40插入序列的正確性。

2.2.3 pDC516-CD40-IgG-GFP質粒的構建：將GFP片段和pDC516-CD40-IgG 線性載體進行連接反應，用pDC516-r測序證實GFP插入序列的正確性。CD40-IgG-GFP含酶切位點的融合產物為2001bp，編碼667aa（見圖4）。

2.3 重組質粒在真核細胞內表達 pDC516-CD40-IgG-GFP質粒抽提後在紫外分光光度計下檢測到OD值為0.1257。將該質粒用Lipofectamine 2000轉染293細胞的第4天開始可見零星的細胞上有GFP表達，隨著時間的延長，GFP表達的細胞量逐漸增多，第7天左右在熒光顯微鏡下見大量的細胞有綠色熒光發生（見圖5）。

參考資料：http://www.studa.net/yixue/081031/16370955-2.html

❹ 原核細胞RNA轉錄過程

原核細胞，沒有以核膜為界分開細胞核，細胞核與細胞質基質在同一空間，轉錄過程與真核細胞是一樣的，在轉錄酶(RNA聚合酶)的作用下，核糖核苷酸與擬核鹼基互補配對形成單鏈的RNA
RNA聚合酶正確識別DNA模板上的啟動子,開始轉錄，在原核生物基因上通常有一段終止序列即終止子；RNA合成就在這里終止

❺ 原核生物有RNA

原核生物也有rna，是由擬核轉錄出來的。
這個知識點 可以記為：有細胞結構的生物 都有dna和rna

❻ 簡述原核生物DNA復制，RNA轉錄及蛋白質翻譯的詳細過程。

DNA復制，RNA轉錄及蛋白質翻譯的詳細過程：有細胞的生物，都是遵循「DNA自我復制→轉錄→翻譯」的。

遺傳物質是一條不與組蛋白結合的環狀雙螺旋脫氧核糖核酸（DNA）絲，不構成染色體（有的原核生物在其主基因組外還有更小的能進出細胞的質粒DNA）。

在蛋白質合成過程中起重要作用的核糖體散在於細胞質內，核糖體的沉降系數為70S。大部分原核生物有成分和結構獨特的細胞壁等等。總之原核生物的細胞結構要比真核生物的細胞結構簡單得多。

(6)如何抽取原核生物rna擴展閱讀：

原核生物細胞能進行有氧呼吸。有的原核生物，如硝化細菌、根瘤菌，雖然沒有線粒體，但卻含有全套的與有氧呼吸有關的酶，這些酶分布在細胞質基質和細胞膜上，因此，這些細胞是可以進行有氧呼吸的。利用細胞膜和細胞質的酶系進行有氧呼吸。

第一個階段發生的場所在細胞質內，產生的丙酮酸進入三羧酸循環，被徹底氧化生成二氧化碳和水，同時釋放大量能量.因其呼吸鏈組分在細胞膜上，所以主要在細胞膜上進行。

有的原核生物如產甲烷桿菌等，沒有與有氧呼吸有關的酶，因此，只能進行無氧呼吸。總之，大多數原核生物能進行有氧呼吸。

❼ 原核生物怎麼進行轉錄

RNA的轉錄過程一般分兩步，第一步合成原始轉錄產物（過程包括轉錄的啟動、延伸和終止）；第二步轉錄產物的後加工，使無生物活性的原始轉錄產物轉變成有生物功能的成熟RNA。但原核生物mRNA的原始轉錄產物一般不需後加工就能直接作為翻譯蛋白質的模板。
啟動
RNA聚合酶正確識別DNA模板上的啟動子並形成由酶、DNA和核苷三磷酸（NTP）構成的三元起始復合物，轉錄即自此開始。DNA模板上的啟動區域常含有TATAATG順序，稱普裡布諾（Pribnow）盒或P盒。復合物中的核苷三磷酸一般為GTP，少數為ATP，因而原始轉錄產物的5′端通常為三磷酸鳥苷（pppG）或腺苷三磷酸（pppA）。真核DNA上的轉錄啟動區域也有類似原核DNA的啟動區結構，和在-30bp（即在酶和DNA結合點的上游30核苷酸處，常以—30表示，bp為鹼基對的簡寫）附近也含有TATA結構，稱霍格內斯(Hogness)盒或 TATA盒。第一個核苷三磷酸與第二個核苷三磷酸縮合生成3′-5′磷酸二酯鍵後，則啟動階段結束，進入延伸階段。
延伸
σ亞基脫離酶分子，留下的核心酶與DNA的結合變松，因而較容易繼續往前移動。核心酶無模板專一性，能轉錄模板上的任何順序，包括在轉錄後加工時待切除的居間順序。脫離核心酶的σ亞基還可與另外的核心酶結合，參與另一轉錄過程。隨著轉錄不斷延伸，DNA雙鏈順次地被打開，並接受新來的鹼基配對，合成新的磷酸二酯鍵後，核心酶向前移去，已使用過的模板重新關閉起來，恢復原來的雙鏈結構。一般合成的RNA鏈對DNA模板具有高度的忠實性。RNA合成的速度，原核為25～50個核苷酸/秒，真核為45～100個核苷酸/秒。
終止
轉錄的終止包括停止延伸及釋放RNA聚合酶和合成的RNA。在原核生物基因或操縱子的末端通常有一段終止序列即終止子；RNA合成就在這里終止。原核細胞轉錄終止需要一種終止因子ρ（四個亞基構成的蛋白質）的幫助。真核生物DNA上也可能有轉錄終止的信號。已知真核DNA轉錄單元的3′端均含富有AT的序列〔如AATAA(A)或ATTAA(A)等〕，在相隔0～30bp之後又出現TTTT順序（通常是3～5個T），這些結構可能與轉錄終止或者與3′端添加多聚A順序有關。

❽ RNA的提取方法步驟及原理.

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:

Trizol是一種總RNA抽提試劑，內含異硫氰酸胍等物質，能迅速裂解細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法進行提取組織或細胞中的RNA。

Trizol作用原理:

在勻質化或溶解樣品中，Trizol試劑可保持RNA的完整性，同時能破壞細胞及溶解細胞成分。加入氯仿離心後，裂解液分層成水相和有機相。RNA存在於水相中。

水相轉移後，RNA通過異丙醇沉澱回收。移去水相後，用乙醇可從中間相沉澱得到DNA，加入異丙醇沉澱可從有機相得到蛋白質。

(8)如何抽取原核生物rna擴展閱讀

與DNA不同，RNA一般為單鏈長分子，不形成雙螺旋結構，但是很多RNA也需要通過鹼基配對原則形成一定的二級結構乃至三級結構來行使生物學功能。

RNA的鹼基配對規則基本和DNA相同，不過除了A-U、G-C配對外，G-U也可以配對。

在細胞中，根據結構功能的不同，RNA主要分三類，即tRNA（轉運RNA），rRNA（核糖體RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白質的模板，內容按照細胞核中的DNA所轉錄；tRNA是mRNA上鹼基序列（即遺傳密碼子）的識別者和氨基酸的轉運者；rRNA是組成核糖體的組分，是蛋白質合成的工作場所。

❾ 如何尋找轉錄起始位點，promoter基本結構，原核生物1RNApol識別

（1）啟動子序列
A：原核生物啟動子序列：包括：
①CAP-cAMP結合位點：結合CAP-cAMP,調節基因轉錄；
②RNA聚合酶進入位點：a：在轉錄的-35附近,一個Sextama框,是RNA聚合酶的識別和初始結合位點；b：在轉錄的-10附近一段核苷酸序列,TATA序列,稱為Pribnow框,是RNA聚合酶的結合位點.
B：真核生物啟動子序列（以RNA聚合酶Ⅱ啟動子為例）
a:帽子位點：轉錄的起始位點
b：TATA框,又稱Hogness框,－25,類似於原核生物的Pribnow框,決定了轉錄起點的選擇.
c：CAAT框：－75附近,控制著轉錄起始的頻率
d：增強子：－100以上,對轉錄起著調節作用.
（2）終止子序列：在在正確的時間和地點終止轉錄作用.