生物活性的測定常用方法有哪些

A. 試述細胞因子的生物學檢測法原理，常用的方法有哪些

細胞因子的生物學檢測法是根據細胞因子特定的生物活性而設計的檢測方法，由於各種細胞因子具有不同的生物活性，因此可選擇某一細胞因子獨特的生物活性，對其進行檢測。生物學檢測法又稱為生物活性檢測法，可分為以下幾類：細胞增殖法、靶細胞殺傷法、細胞因子誘導的產物分析法、細胞病變抑製法等。該法比較敏感，並能直接測定生物學功能，屬於一種最可靠的方法，是科研部門最常用的技術，需要長期培養依賴性細胞株，步驟繁雜，影響因素多，是這一方法的缺點。

B. 生物活性的活性檢測

材料表面在 SBF 中形成磷灰石的能力能夠反應材料在體內的生物活性，具體檢測方法如下：
1.SBF 配置
由於SBF 溶液對於磷灰石過飽和，所以配備方法不恰當會導致溶液中磷灰石沉澱產生。整個配備過程需要確保溶液無色、透明，容器表面無沉澱出現，如果過程中產生沉澱，倒去溶液，洗凈儀器重新配製。准備一個 1000ml 的塑料燒杯。首先於塑料燒杯中裝好 700ml 離子交換蒸餾水、一個適當大小磁子，杯口密封以蒸發皿或塑料薄膜。攪拌並調節水溫至 36.5±1.5C。
按表1所列順序在 36.5C 恆溫下逐個溶解第一到第八個化合物，溶解過程
表1 配置1000 ml SBF 溶液時試劑添加順序、添加量 Order Reagents Amounts Containers Purities（%） Formula weights 1 NaCl 8.035 Weight paper 99.5 58.4430 2 NaHCO3 0.355 Weight paper 99.5 84.0068 3 KCl 0.225 Weight bottle 99.5 74.5515 4 K2HPO4·3H2O 0.231 Weight bottle 99.0 228.2220 5 MgCl2·6H2O 0.311 Weight bottle 98.0 203.3034 6 1.0 M-HCl 39ml Graated cylinder — — 7 CaCl2 0.292 Weight bottle 95.0 110.9848 8 Na2SO4 0.072 Weight bottle 99.0 142.0428 9 Tris 6.118 Weight paper 99.0 121.1356 10 1.0 M-HCl 0-5ml Syringe — — 2.磷灰石形成能力測試
對於密質薄片材料，測出樣品尺寸並計算樣品表面積精確到 2mm 應用如下公式計算出 SBF 用量：
Vs=Sa/10,
Vs（ml）是 SBF 的體積量，Sa（mm）表示樣品的表面積。
對於多孔材料，SBF 的用量應大於上式計算量准備好塑料瓶或燒杯，裝入計算出的 SBF 體積量加熱到 36.5C， 然後按示意圖往裡放置樣品。 筆記：樣品在容器中放置有兩種情況，如圖 1(a)，1(b)。少數情況下，SBF 溶液會生成同 質磷灰石沉積於樣品表面。所以如果樣品放置是圖 A1(b)種情況，表徵實驗應該檢測樣品的 下表面。 四個星期內，分別取出恆溫浸透不同時長的各組樣品，純水輕盈洗凈。然後將樣品放入乾燥 器中常溫乾燥。
圖1 SBF中樣品浸泡示意圖 1.四唑鹽（MTT）比色法：
檢測細胞存活和生長的方法除前面所介紹的方法外，還可用四唑鹽比色法試驗（MTT）。此法的原理是：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物，並沉積在細胞中，而細胞無此功能。二甲基亞碸（DMSO）能溶解細胞中的藍紫色結晶物，用酶聯免疫檢測，以在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反應活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶物形成的量與細胞數成正比。
●0.25%胰蛋白酶消化細胞使其成為單細胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培養基配成1x10^9個/L的但細胞懸液，將細胞接種於96孔培養板中，每孔100ul。
●將培養板置CO2培養箱中，在37℃、5%CO2條件下，培養3-5天。
●培養3-5天後，每孔加入MTT溶液10ul，繼續置培養箱孵育3-6h，終止培養，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培養數小時，將細胞內與細胞周圍的MTT顆粒充分溶解。
●用酶聯免疫檢測儀測定每孔吸光度（OD），選波長490nm。以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。
用此法測細胞活力，為保證結果的准確性，最好在試驗前測定每種細胞的貼比率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，再確定每孔細胞接種數和培養時間，以保證培養終止時不會過滿。另外，實驗時設空白對照，比色時，以空白孔調零。
3.2.2 CCK-8 法
Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用於簡便而准確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。
● 制備細胞懸液：細胞計數
● 接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數，每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做3個重復。
● 37℃培養箱中培養：細胞接種後貼壁大約需要培養2-4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。
●加入10ul CCK8：由於每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑後輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養基，以換液的形式加入。
●培養1-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。
●測定450nm吸光度：建議採用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

C. 生物製品鑒別實驗包括以下哪些方法

二、指採用生物學方法，的測定方法。以下為生物學測定常用方法，根據具體情況，在產品的常規質控時可採用其中的一種或幾種。鑒於一種測定方法僅能反映製品某一方面的特性，且方法的變異一般較大，為更好控制產品質量，必要時需同時採用多種方法進行測定。（一）、酶反應試驗是指在體外能促進酶分子的活化或本身具備酶的活性，通過底物的變化檢測酶活性。主要用於酶、輔酶、激酶、激活劑、抑制劑等的活性測定。這類方法的變異相對較小，結果比較准確。（二）、結合試驗是基於產品與某種物質的結合特性而設計的試驗，如免疫結合試驗。目前主要用於生物製品的鑒別。由於在結合試驗中測定的分子不一定都具有生物活性，所以一般不用作製品的活性（或效力）測定。這類方法的變異也相對較小。（三）、細胞測定試驗是指產品可以誘導細胞產生可測定的應答，如細胞增殖、聚集、分化、死亡、遷移或產生特定的化學物質等。細胞測定試驗一般能較好地反映製品的生物學活性，常用於各種生物製品的活性（效力）測定。與上述兩類方法相比，這類方法的變異較大。與使用傳代細胞相比，使用原代細胞的方法變異更大。（四）、動物試驗是指以整體動物為試驗材料檢測製品生物學活性（或效力）的試驗方法，如動物保護力試驗，一般用於疫苗的效力測定。由於動物實驗的成本高、周期長和變異大，所以一般僅用於成品檢定。對於某些治療用的製品，由於其作用機理或本身化學性質的原因，難以建立體外測活的方法，也可以採用動物試驗方法測定，但由於這類方法的變異一般相對較大，在進一步的研究中應盡可能以體外法代替。

D. 請教各位那些技術可以測定微生物活性

土壤微生物活性表示土壤中整個微生物群落或其中的一些特殊種群狀態，可以反映自然或農田生態系統的微小變化。土壤微生物活性的表徵量有:微生物量、C/N、土壤呼吸強度和纖維呼吸強度、微生物區系、磷酸酶活性、酶活性等。
土壤呼吸強度和纖維分解強度是土壤微生物活性的重要標志，反映了土壤中微生物活性及對有機質殘體分解的速度和強度。纖維素分解強度採用埋片法；呼吸強度採用鹼吸收滴定法。土壤微生物活性用土壤呼吸CO2測定法（5g鮮土於310mL試劑瓶中，22℃24h測CO2釋放量(用exH23os紅外CO:分析儀測定)）。直接測定土壤呼吸的方法基本可分為靜態氣室法、動態氣室法和微氣象法三種。
土壤酶大多數來自土壤微生物，在土壤中已發現50—60種酶，它們參與並催化土壤中發生的一系列復雜的生物化學反應。如水解酶和轉化酶對土壤有機質的形成和養分循環具有重要的作用。已有研究表明，土壤酶活性和土壤結構參數有很好的相關性。土壤微生物酶主要有脫氫酶、磷酸酶、精氨酸酶及芳基硫酸酯酶等。

E. 生物活性物質常用的分析方法有哪些

依據生物活性物質分子本身的理化特性,如溶解度、帶電性、大小、揮發性等進行分離純化，
植物的活性物質的提取多採用：溶劑法、水蒸汽蒸餾法、超臨界二氧化碳提取分離法、萃取法。分離多用硅膠柱色譜法。
動物的生理活性物質提取分離比較復雜,方法多種：如鹽析法、電泳法、高速離心法、受體識別法等.

F. 化合物對生物活性測試的方法

酶標儀啊，測量OD值，或者做生長曲線。這些都是專門針對生物活性測量的方法。最原始的就是分光光度計比色法也行啊

G. 生物活性成分的篩選方法都有哪些

1、壓榨法。2、用溶劑去萃取。3、蒸餾法。4、壓榨。5、蒸發。6、過濾。7、溶劑提取法。8、溶劑提取法有浸漬法、滲源法、煎煮法、迴流提取法、連續提取等。分離純化方法有，系統溶劑分離法、兩相溶劑舉取法、沉澱法、鹽析法、透析法、結晶法、分餾法等。 從目標物中萃取有效成分，當恢復到常壓常溫時，溶解在流體中成分立即以溶於吸收液的液體狀態與氣態流體分開。萃取過程一般分為流體壓縮→萃取→ 減壓→分離四個階段。

H. 如何檢測原生質體的生物活性

由於原生質體沒有細胞壁。那麼不能用質壁分離的方法來檢測。
可用熒光染料來檢測，不能自由透過細胞膜而滯留於細胞內，在熒光顯微鏡下根據熒光強度即可判斷原生質體死活。（細胞膜有選擇透性）

I. 生物活性物質常用的分析方法有哪些

生物活性物質，是指來自生物體內的對生命現象具體做法有影響的微量或少量物質。
這種物質的檢測只能依靠醫學檢驗相關的分析方法。

J. 殺蟲劑的常規活體生物測定有哪幾種

殺蟲劑的常規活體生物測定技術是在長期的殺蟲劑篩選過程中發展起來的技術。有些經典的方法和配套的設備在現在的應用中仍然佔有相當重要的地位。現將各類方法介紹如下：

（1）觸殺作用（contactaction）。由於許多殺蟲劑都具有觸殺活性，因此，這方面的毒力測定方法及儀器很多。常用的方法有噴霧法、噴粉法、浸液法、點滴法、葯膜法。

①噴霧法：噴霧法及噴粉法都是基於模擬田間實際防治時的施葯情況，盡量使昆蟲體表獲得的葯劑劑量相同且均勻。現在主要的試驗用噴霧儀器有Hoskings橫筒噴霧器、Campbeil轉盤式噴霧器、沉澱降霧裝置、Potter噴霧塔。

②噴粉法：噴粉法與噴霧法目的大致相同。此方法的優點在於噴灑不僅均勻，同時不只局限於上表面，而可使被噴的對象各個表面均可噴到。

③浸液法：浸漬法使用的對象一般是水生昆蟲（如蚊子幼蟲、水蚤）、儲糧害蟲、介殼蟲及蚜蟲、供試昆蟲的卵。對蚊子幼蟲，可做長時間的浸液接觸處理，即直接浸於一定濃度的葯液中，一定時間後觀察結果。其他的陸生昆蟲時間較短，一般幾秒鍾到幾分鍾不等。

④點滴法：其原理是將一定劑量的葯劑滴在昆蟲體壁上，以觀察葯劑對穿透昆蟲體壁的觸殺毒力。此方法是殺蟲毒力測試中最精確的方法，也是目前普遍採用的一種測試技術，大多數的目標昆蟲及蟎類都可以運用。

在滴加葯液前一般要先將昆蟲麻醉，以免因為昆蟲的自身運動影響實驗操作準確性。麻醉的一般方法有冷凍法、乙醚處理法、二氧化碳處理法。另外，還需要注意昆蟲的握拿方法，盡量不對供試昆蟲造成機械傷害，對體型較大的昆蟲可以用手拿，對較小的昆蟲可以將昆蟲吸在吸管管口上加葯，在管口上加上細紗布效果更好。

⑤注射法：該法的使用也相當廣泛，且使用儀器與點滴法有所類似，也有施葯量精確的特點。只不過注射法是將葯劑注入供試昆蟲的體內，而非點滴在體表。

⑥葯膜法：該方法是一種接觸處理方法。原理是通過噴霧、噴粉、點滴、塗抹、浸液等方法，將一定量的葯劑均施於濾紙、玻璃板或蠟紙上，形成一個均勻的葯膜，再將供試昆蟲放在上面，爬行一定的時間，然後再轉移到正常的環境下，一定的時間後觀察記錄昆蟲死亡情況。

此法適用於一切爬行的昆蟲，也可用於某些飛翔的昆蟲（如蚊、蠅等成蟲），可以製作一個方形的玻璃盒，盒的6個面的內部都經過葯膜處理，使得無論昆蟲停息在哪裡，都一樣接觸到葯劑。另外，葯膜放置不同時間後，或經過風化或日曬等處理後，再放入供試昆蟲，可以測定葯劑的持效性。

（2）胃毒作用（stomachaction）。其原理是利用昆蟲的貪食性，在昆蟲取食正常食物的同時將葯劑食入，檢測葯劑是否能通過昆蟲的消化道對昆蟲產生毒力。一般方法有飼喂法、飼飲法、口腔注射法。

①飼喂法：飼喂的方法又分為無限制給食法及定量給食法。根據飼喂的方式又分為葉片夾毒法及單葉飼喂法。其中葉片夾毒法（sandwichmethod）最為常用。葉片夾毒法是在兩葉片中間均勻的加入一定量的葯劑，飼喂昆蟲，葯劑隨葉片一起被昆蟲食入，根據被吞食的葉片面積計算吞食的葯量。為使加在葉片上的葯劑量均勻，通常在一張葉片的一面通過噴粉、噴霧、塗布或滴加葯劑等方法予以施葯。待葯液干後，將另一張葉片的一面塗抹漿糊或明膠後相互黏連，投喂昆蟲。其優點是避免了葯劑與蟲體的直接接觸，排除了葯劑對昆蟲的觸殺作用。

吞食葯量的計算是以試蟲吞食葉面積乘以單位面積葉片的劑量，從而求得每頭試蟲單位體積中所取食的劑量（μg/g）。葉面積的計算有幾種方法：1）方格紙法：將試蟲吞食剩餘的葉片放在方格紙上，計算所食方格紙的數量，算出方格的面積，2）葉面積測定儀法：採用葉面積測定儀直接測定吞食的葉面積；3）電腦掃描法：用數碼相機攝下每個處理中試蟲吞食後剩餘的葉片，通過電腦計算出葉面積。

致死中量的求法是按每頭蟲吞食劑量的大小順序排列，並標明該劑量下試蟲的死活情況，從而將蟲劃分成生存組、生死組和死亡組。

1～8號為生存組，9～40號為生死組，41～47號為死亡組。生死組中既有生存的又有死亡的，分別計算生死組中生存個體和死亡個體平均吞食的葯量，記為A和B。即A=（生死組活蟲劑量總和）/生死組活蟲總數，B=（生死組死蟲劑量總和）/生死組死蟲總數，LD50=（A＋B）/2。

殺蟲劑對某種昆蟲的食葯量反應示範

A=（0.21＋0.23＋0.28＋……＋0.64）/16=6.00/16=0.375

B=（0.20＋0.22＋0.25＋……）＋0.65/17=5.89/17=0.368

LD50=（A＋B）/2=（0.375＋0.368）/2=0.372（μg/g）

該法的缺點是無限制飼喂法無法控制單一供試昆蟲的取食量，定量給食法也不能排除昆蟲吞食後嘔吐行為等未知因素的影響，且計算昆蟲食用葉片面積的方法不是十分精確，從而影響所食葯劑的劑量。另外，也比較費事、費時，這種方法只適用於咀嚼式口器的昆蟲。

飼喂法中，除了飼喂葉片外，還有飼喂毒餌等方法。

②飼飲法：此法適用蠅類、蝽類等有吸食習性的昆蟲。也分為自由飼飲法和強制飼飲法。自由飼飲法是一種無限制的飼飲方法，讓昆蟲自己取食配好的混有葯劑的糖液，通過測定吸食前後昆蟲的重量或葯液的體積計算昆蟲吸食葯劑的量。而強制性飼飲法就是將昆蟲固定後，將裝有葯液的移液管口放在昆蟲的口邊，昆蟲吸食到一定的體積後就移開移液管，這樣可以保證每頭蟲體吸取葯劑的量相同。另外，還有一種口腔注射法，該方法是將含糖的葯液直接用注射器注入昆蟲口腔內，強迫其吞食。一般要求針尖光滑，以免刺破口腔內的組織，並且要求操作技術熟練。

（3）熏蒸作用（fumigationaction）。熏蒸劑可以是氣體，也可以是液體或固體，但最終都要以氣態的形式通過昆蟲的呼吸系統起到毒殺作用。氣體易擴散的性質決定了熏蒸劑必須在密閉的環境下使用的特點。因此，葯劑的熏蒸作用的檢測也必須在密閉的條件下進行，並且要求不能以固態或液態的狀態與昆蟲直接接觸。所有的熏蒸作用測定的方法都是基於該點來設計的。

目前熏蒸劑的儀器裝置主要有靜止氣體的測定方法裝置、有氣流出入控制的熏蒸器。一般一些簡單的熏蒸器都屬於前一種，通過一定的方法使密閉的容器內充入飽和的氣體，通過控制放入供試昆蟲的時間來控制對充入氣體的吸收量或調節容器內氣體的濃度，達到控制劑量的目的。

另外，對土壤熏蒸劑在設計實驗方法時還應考慮到土壤的物理及化學性質上的調節等問題。

（4）內吸作用（systemicaction）。內吸作用的基本原理是將葯劑通過處理植物的某一特定部位（根、莖、葉或種子）後，葯劑能被植物吸收，並通過傳導，到達其他部位，讓昆蟲取食未直接用葯的部位後觀察昆蟲是否中毒死亡，以判定葯劑是否具此特性。

據此原理處理方法通常被稱作直接測定法。不同的施葯部位，處理的方法也有所不同。如果是從根部吸收的處理方法，可將植物主根頂端切除，留存部分插入盛葯液的小指形管內，保存側根浸入營養液中，或將營養液中加入葯液配成所需的濃度，主側根全浸在其中；如果從葉部施葯，可用滴灌或毛筆蘸葯塗抹甚至局部噴霧的方法將葯劑施於葉片的正面或正反兩面；如果是從莖部施葯，木本植物可在莖部包紮一圈具有一定濃度葯劑的脫脂棉，外部再以塑料布纏繞後包紮，如果植物較幼嫩可用塗抹的方法將葯液塗在莖上，老樹則需要將老樹皮颳去一層後施葯；如果試驗種子的內吸作用，一般可將種子用浸液的方法處理，葯液一般相當於種子重量的兩倍，或以浸泡時完全淹沒種子為度。

另一種被稱為間接測定法，用葯液處理植物的局部，一定時間後取未處理的部位加以研磨，稀釋成不同濃度的汁液，再放入一定數量的孑孓或水蚤觀察其死亡情況，利用此浸液法間接測定該葯劑是否有內吸作用。

（5）拒食作用。拒食作用的設計方法通常跟胃毒作用的方法相同。但是觀察的結果通常不是供試昆蟲的死亡率，而往往是昆蟲的取食量或是昆蟲對食物的所食部位和昆蟲體重的變化等做的分析，作為葯劑對供試昆蟲是否有拒食活性的依據。

一般對食葉咀嚼式口器昆蟲的拒食活性的測定方法為葉碟法。即將葯劑均勻施加在葉片上，製成大小相同的葉碟，放在保濕的培養皿中，後放入供試昆蟲。其中在同一培養皿中交錯放入處理葉碟與對照葉碟的方法叫做選擇性拒食活性測定法。僅放入對照或處理葉碟的方法叫非選擇拒食活性測定法。如，黑色圓圈表示加葯的葉片，白色圓圈表示未加葯的葉片。A表示選擇拒食活性的測定，B、C表示非選擇拒食活性的測定。讓供試昆蟲取食一定時間後，將殘存的葉片取出，算出昆蟲取食葉片的面積。通過公式計算出拒食率：

葉碟法

（6）引誘作用。引誘劑基本上可分為性引誘劑、食物引誘劑和產卵引誘劑。

粗略的測定方法可以通過設置誘惑陷阱。如在紗籠中放入一個有黏膠的架子，黏膠中央黏上滴有葯劑的棉花，引誘目的昆蟲。對體型較大的昆蟲，可以將黏膠換成毒氣瓶，通過計算誘集昆蟲的數量，判斷葯劑的有效率。

這些方法多數是在田間操作的，易受氣候因素及田間昆蟲數量多少的影響。在實驗室測定的方法中很多要用到嗅覺計。基本原理是讓昆蟲在兩個可選擇的道路的分叉處，這兩個道路一個支路放有待測葯劑，另一個則沒有。觀察昆蟲進入哪一個支路。如果葯劑沒有作用，則昆蟲進入兩條支路的幾率是相等的，而一旦引誘劑有作用，作用越強，昆蟲被引誘的數量越多。

（7）驅避作用。其原理與引誘劑的原理類似，在試驗設計時也可以用到嗅覺計，方法大致相似。

（8）生長發育與生育干擾作用。有此性質的化合物通常不直接殺死昆蟲，而是通過干擾昆蟲腦激素、保幼激素、蛻皮激素和幾丁質的合成導致昆蟲生長、變態、滯育等生理現象發生改變，間接導致為害降低的目的。試驗方法可以通過以上介紹的胃毒、接觸、熏蒸、內吸等處理方法，觀察昆蟲蛻皮、化蛹、羽化的變化及其形態的變化、產卵量及卵的孵化率等指標來觀察葯劑作用的效果。