微生物實驗要注意哪些

① 做微生物實驗要注意什麼

呵呵 我也是學這個專業的
從一開始的時候，老師就強調我們
微生物的實驗最怕什麼。就是最怕微生物 會沾染雜菌
而且 除了你要培養的微生物的安全之外你還要考慮好自身的安全以及環境安全

進實驗室之前一定要穿實驗服，如果有條件的可以經常給實驗服滅滅菌，帶手套是一定要的，還有口罩，一般活性炭口罩就可以了。必要時要帶腳套和帽子，如果需要接觸有毒物質，最好在乳膠手套外面再增加一個一次性的塑料手套，透明的那種，可以隨時扔掉

關於你自己的東西可以紫外線殺菌，然後操作之前要用無水乙醇有的說是醫用酒精，濃度百分之七十五的擦拭雙手，所有動作要在超凈台中進行。

實驗器具也要滅菌，一般不太講究的就是乾熱滅菌和高壓蒸汽滅菌，一般培養基什麼的都是高壓蒸汽滅菌。以前專業課老師講過，高壓蒸汽滅菌的話效果比乾熱滅菌要好，因為受熱均勻滅的比較透徹。蒸汽滅菌鍋我就不多說了吧，樓主應該會用。

其他的東西 比如平皿什麼的就用乾熱滅菌，在烘箱裡面，一般用報紙裹好，至於你常用的槍頭和槍的話同樣也要滅菌。
如果要求嚴格的話所有的器皿我指的是玻璃的，要先刷洗干凈後泡在鉻酸洗液當中，要求過夜，完後拿出來控干，差不多不滴水就行，用少量自來水洗去帶顏色的那部分鉻酸，這一部分的水是要求倒入廢液瓶中，不可以進入下水道的。然後用自來水洗四十遍，其實要求是四十到五十遍，沒錯，我沒有打錯，你也沒有看錯，就是要這么多遍。然後，蒸餾水潤洗三遍，晾乾就可以進行乾熱滅菌了。瓶蓋瓶塞之類的要在鹽酸當中過夜，1%的，然後自來水洗蒸餾水洗滌就好。
有棉塞什麼的東西記得要在酒精的的外焰上過一下，接種針要灼燒到發紅在晾涼！
培養的過程要看你是連續培養還是半連續的還是不連續的，在加培養液的時候同樣注意不要引入雜菌
記住，在實驗室里堅決不允許吃東西喝水！
出來的時候要記得洗手哈，實驗服別隨便亂扔
至於廢料肯定不能帶出來滴，那些有毒的或者生長非常快的微生物沾染過的不要隨便的就扔掉要放在廢物桶里統一處理，培養皿清洗干凈後，再次乾熱滅菌就又可以用了哈
然後差不多粗淺的說一下吧，具體的如果你需要更詳細的資料的話應該書上應該有更詳細的。

這個問題貌似剛剛回答過一次了，那我就直接把我回答過的答案又復制過來了，這個可不涉及到那種能搜一搜到的啊，可是我一個字一個字的敲上去的，樓主看著辦吧

② 用顯微鏡觀察微生物時需注意哪些問題

1、持鏡時必須是右手握臂、左手托座的姿勢，不可單手提取，以免零件脫落或碰撞到其它地方。

2、放置玻片標本時要對准通光孔中央，且不能反放玻片，防止壓壞玻片或碰壞物鏡。

3、要養成兩眼同時睜開觀察的習慣，以左眼觀察視野，右眼用以繪圖。

4、水滴、酒精或其它葯品切勿接觸鏡頭和鏡台，如果沾污應立即用擦鏡紙擦凈。

5、輕拿輕放，不可把顯微鏡放置在實驗台的邊緣，應放在距邊緣10cm處，以免碰翻落地。

6、保持顯微鏡的清潔，光學和照明部分只能用擦鏡紙擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，機械部分用布擦拭。

7、不要隨意取下目鏡，以防止塵土落入物鏡，也不要任意拆卸各種零件，以防損壞。

8、使用完畢後，必須復原才能放回鏡箱內，取下標本片，轉動旋轉器使鏡頭離開通光孔，下降鏡台，平放反光鏡，下降集光器、關閉光圈，推片器回位，蓋上綢布和外罩，放回實驗台櫃內。最後填寫使用登記表。

③ 微生物檢測手段及注意事項

1. 微生物計量法

1.1 體積測量法

又稱測菌絲濃度法，通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液(如10 mL)放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間(如5 min)和轉速(如5000 rpm)，離心後，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為(10-v)/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。

1.2稱 乾重法

可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10~20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速，進行離心，並用清水離心洗滌1~5次，進行乾燥。乾燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘乾，或採用紅外線烘乾，也可在80 ℃或40 ℃下真空乾燥，乾燥後稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾後用少量水洗滌，在40 ℃下進行真空乾燥。稱乾重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常採用這種方法，如活性乾酵母(Activity Dry Yeast, ADY),一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

1.3 比濁法

微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可採用一種特製的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用於發酵工業菌體生長監測。如使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600 nm處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.coli的生長及誘導時間。

1.4 菌絲長度測量法

對於絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度，或是利用一隻一端開口並帶有刻度的細玻璃管，到入合適的培養基，卧放，在開口的一端接種微生物，一段時間後記錄其菌絲生長長度，藉此衡量絲狀微生物的生長。

2. 微生物計數法

2.1 血球計數板法

血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平台，兩嵴的表比兩平台的表面高0.1 mm，每個平台上刻有不同規格的格網，中央0.1 mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1 mL菌液中所含的菌體數。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜於單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，並且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

2.2 染色計數法

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。藉助不同的染料對菌體進行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色後在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。

2.3 比例計數法

將已知顆粒(如黴菌孢子或紅細胞)濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較粗放。並且需要配製已知顆粒濃度的懸液做標准。

2.4 液體稀釋法

對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5 mL試樣，接種1 mL到3組共15隻裝培養液的試管中，經培養後記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然後查最大或然數表MPN(Most Probable Number)得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用於食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

2.5 平板菌落計數法

這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液塗布於已凝固的固體培養基平板上。保溫培養後，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9 cm的平板上出現50~500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的'細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。

2.6 試劑紙

在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC，無色)待蘸取測試菌液後置密封包裝袋中培養。短期培養後在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標准紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷准確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

2.7 膜過濾法

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。

3. 間接測定法

微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸鹼度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。因此可利用生理指標等間接參數來測定生物量。

3.1 測定含氮量

大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%，酵母為7.5%，黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱後產生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO2後即可測出N2的量。

3.2 測定含碳量

將少量(乾重0.2~2.0 mg)生物材料混入1 mL水或無機緩沖液中，用2 mL 2%的K2Cr2O7溶液在100 ℃下加熱30分鍾後冷卻。加水稀釋至5 mL，在580 nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標准樣品做標准曲線。

3.3還原糖測定法

還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用於大規模工業發酵生產上微生物生長的常規監測。方法是，離心發酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鍾，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點時加入澱粉溶液，繼續加Na2S2O3至終點，查表讀出還原糖的含量。

3.4 氨基氮的測定

離心發酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02 mol/L的NaOH調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應數刻，加入0.02 mol/L的使之變色，根據NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據培養液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。

3.5 其他生理物質的測定

P，DNA，RNA，ATP，NAM(乙醯胞壁酸)等含量以及產酸，產氣，產CO2(用標記葡萄糖做基質)，耗氧，黏度，產熱等指標，都可用於生長量的測定。也可以根據反應前後的基質濃度變化，最終產氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如在BMP-2的發酵生產上，隨時監測溶氧量的變化和酸鹼度的變化，判斷細菌的長勢。

4. 商業化快速微生物檢測法

微生物的檢測，其發展方向是快速，准確，簡便，自動化，當前很多生物製品公司利用傳統微生物檢測原理，結合不同的檢測方法，設計了形式各異的微生物檢測儀器設備，正逐步廣泛應用於醫學微生物檢測和科學研究領域。例如：

4.1 試劑盒，培養基等手段

抗干擾培養基和微生物數量快速檢測技術結合解決了傳統微生物檢測手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測系統奠定了堅實的基礎。如：抗干擾微生物培養基，新型生化鑒定管，微生物計數卡，環境質量檢測試劑盒等，可方便的用於多項檢測。

4.2 藉助新型先進儀器

BACTOMETER全自動各類總菌數及快速細菌檢測系統可以數小時內獲得監測結果，樣本顏色及光學特徵都不影響讀數，對酵母和黴菌檢測同樣高度敏感原理是利用電阻抗法(Impedance Technology)將待測樣本與培養基置於反應試劑盒內，底部有一對不銹鋼電極，測定因微生物生長而產生阻抗改變。如微生物生長時可將培養基中的大分子營養物經代謝轉變為活躍小分子，電阻抗法可測試這種微弱變化，從而比傳統平板法更快速監測微生物的存在及數量。測定項目包括總生菌數，酵母菌，大腸桿菌群，黴菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌等。

微生物OD值是反映菌體生長狀態的一個指標，OD是Optical Density(光密度)的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度。通常400～700 nm 都是微生物測定的范圍，需要紫外分光光度計測最大吸收波長。用得最多的是：505 nm測菌絲菌體、560 nm測酵母、600 nm測細菌。用測OD方法畫微生物生長曲線時，同一株菌的起始培養濃度可以准備多管(根據檢測點的需要，如需檢測10個點，就准備10管)，然後每個點取一管出來測OD值就行了。

一般測菌體密度的OD的波長范圍是580 nm-660 nm，如枯草芽孢桿菌用600 nm，已經屬於可見光區(200 nm～400 nm為紫外光區，400 nm～800 nm為可見光區)。空白如用水做，需要離心洗滌菌體;空白如用不接種的培養基做就不需要洗滌，但是不接種的培養基要和接種的同時培養以求條件一致，最後注意一般OD值在控制在0.1~0.4最好，在這個區內的值就可靠，如果OD大於1.0，一般要稀釋後再測，因為OD太大，分光光度計的靈敏度就會顯著降低。

一般都測吸光值，而且最好是整個實驗過程中，保持發酵液或菌體的稀釋倍數一致，吸光值與稀釋倍數不一定成正比，可保證整個實驗點有可比性。且取值的時候要連續讀數，重復3次的數最好。

另，用分光光度計測微生物的OD值為什麼要把波長設為600 nm

這個波長其實只是針對濁度，而分光光度計在600 nm處對濁度的反應比較靈敏。測吸收峰的實際意義並不大，比如LB搖瓶培養過夜的大腸桿菌，其實在400多納米處的吸收最大，但那很可能是培養液的吸收峰。

④ 微生物實驗中無菌操作應注意什麼

環境，人員，器具
環境的話主要靠超凈台，操作過程要靠近酒精燈
人員的話，實驗操作者一定要注意消毒，操作過程要小心
器具則是實驗過程中用到的東西一定都要事先滅過菌，不能高溫滅菌的應用紫外滅菌，直接接觸微生物的，在進行操作之前還行通過酒精棉和酒精燈再次消毒。

⑤ 實驗室微生物檢驗需要注意哪些問題

微生物檢驗無菌操作的注意事項有很多細節，日常的微生物檢驗過程中要注意無菌操作，除了要在潔凈台和操作器皿上的消毒，還需要注意人員衛生和環境的衛生。

【操作技巧】

進行培養時，動作要准確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。為拿取方便，工作檯面上的用品要有合理的布局，原則上應是右手使用的東西放置在右側，左手用品在左側，酒精燈置於中央。工作由始至終要保持一定順序性，組織或細胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養液在未用前，不要過早開瓶;用過之後如不再重復使用，應立即封閉瓶口直立可增加落菌機會。吸取營養液、PBS、細胞懸液及其它各種用液時，均應分別使用吸管，不能混用，以防擴大污染或導致細胞交叉污染。工作中不能面向操作野講話或咳嗽，以免唾沫把細菌或支原體帶入工作檯面發生污染。操作前用酒精擦拭超凈檯面及雙手。手或相對較臟的物品不能經過開放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時如吸管尖碰到瓶口，則應將吸管丟掉。

【培養前准備】

在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關數據的計算要事先做好。根據實驗要求，准備各種所需器材和物品、清點無誤後將其放置操作場所(培養室、超凈台)內，然後開始消毒。這可以避免開始實驗後.囚物品不全往返拿取而增加污染機會。

【火焰消毒】

在無菌環境進行培養或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈或煤氣燈。以後一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處並經過燒灼進行。但要注意：金屬器械不能在為焰中燒的時間過長，以防退火，燒過的金屬鑷要待冷卻後才能挾取組織，以免造成組織損傷。吸取過營養液後的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入營養液中。開啟、關閉長有細胞的培養瓶時，火焰滅菌時間要短。防止因溫度過高燒死細胞。另外膠塞過火焰時也不能時間長，以免燒焦產生有毒氣體，危害培養細胞。

【洗手和著裝】

原則上和外科手術相同。平時僅做觀察不做培養操作時，可穿裝細胞培養室內紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈台工作時，因整個前臂要伸入箱內，應著長袖的清潔工作服，並於開始操作前要用75%酒精消毒手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養室都要重新用消毒液洗手。進入原代培養室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。

【操作台消毒】

體外培養細胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養成功或失敗的首要條件。即便使用設備完善的實驗室。若實驗者粗心大意，技術操作不規范,也會導致污染。因而.為在一切操作中為最大可能的保證無菌.每一項工作都必須做到有條不紊和完全靠。無菌培養室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用).紫外線照射消毒30-50min，超凈工作台檯面每次實驗前要用75%酒精擦洗。然後紫外線淌毒30min。在工作檯面消毒時切勿將培養細胞和培養用液同時照射紫外線，消毒時工作檯面上用品不要過多或重疊放置.否則會遮擋射線降低消毒效果。—些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗後置於台內同時紫外線消毒。

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⑥ 微生物檢測應注意什麼事項

1、工作室要矮小平整、光滑、無凹凸不平或稜角、四壁及屋頂用不透水之材質，便於擦洗及殺菌。

2、室內採光面積應大，從室外應能看到室內的情況。

3、為保證無菌室的潔凈，無菌室周圍需設緩沖走廊，走廊旁再設緩沖間，其面積可小於無菌室。

4、無菌室、緩沖走廊及緩沖間均設有日光燈及紫外燈，殺菌紫外燈離工作台以一米為宜，其電源開關應設在室外。

5、無菌室與緩沖間進出口應設推拉門，門與窗平齊，門縫要封緊，兩門要錯開，以免空氣對流造成污染。

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