工業生產上常用的微生物培養技術有哪些

1. 微生物分離和純培養技術有哪些

微生物的培養方式
1．分批培養（batchculture）將微生物置於一定容積的培養基中，經培養，最後一次收獲，謂分批培養。在分批培養中，培養基一次加入，不予補充，不再更換。由於營養消耗，代謝產物積累，對數生長期不能長期維持。
2．連續培養（continuous culture）在培養器中不斷補充新鮮營養物質，並不斷排出部分培養物（包括菌體和代謝產物），以保持長時間生長狀態的一種培養方式。主要有恆濁連續培養和恆化連續培養兩類。恆濁連續培養通過不斷調節流速，使培養液濁度保持恆定，因而可不斷提供具有一定生理狀態的細胞，並可得到以最高生長速率進行生長的培養物。恆化連續培養通過控制恆定的流速使營養物濃度基本恆定，從而使微生物保持恆定的生長速率。用不同濃度的限制性營養物進行恆化培養，可得到不同生長速率的培養物。
3．半連續培養（semi-continuous culture）在發酵罐中的一部分發酵液保留下來作為菌種液，放出其餘部分進入提練加工工序，在剩餘的培養液中加滿新的未接種的培養液，繼續培養，如此反復，謂之半連續培養。
4．補料分批培養（fed-batch culture）補料分批培養又稱半分批培養，是指在分批培養過程中，間歇或連續地補加新鮮培養液，但不取出培養物。待培養到適當時期，將其從反應器中放出，從中提取目的生成物（菌體或代謝產物）。若放出大部分培養物後，繼續進行補料培養，如此反復進行，則稱為重復補料分批培養（repeated fed-batch culture）。與傳統分批發酵相比，補料分批發酵的優點在於使發酵系統中的基質濃度維持在低水平，這有以下優點：①可除去快速利用碳源的阻遏效應，並維持適當的菌體濃度，以減輕供氧矛盾；②避免有毒代謝物的抑菌作用；③大為減少了無菌操作要求十分嚴格的接種的次數。與連續發酵相比，補料分批培養不會產生菌種老化和變異等問題。故其應用范圍十分廣泛。
5．同步培養 能使培養的微生物處於較一致的，生長發育在同一階段上的培養方法叫同步培養法。利用同步培養法控制細胞的生長，使它們處於同一生長階段，所有細胞都能同時分裂，這種生長方式叫同步生長（圖3—4）。用同步培養法得到的培養物叫同步培養物（synchronous culture）。這樣，群體和個體行為一致，即可用研究群體的方法來研究個體水平上的問題。由於同步群體的個體差異，同步生長往往最多維持2個～3個世代，然後又逐步變為隨機生長。

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生化試劑：經營多種生化試劑，品種齊全，質量保證。

2. 微生物的培養技術及應用有哪些

微生物的培養技術及應用有好氧培養和厭氧培養。

應用是不斷發現和廣泛應用各種抗生素，對細菌細胞和病毒形態的研究已經達到亞顯微結構的水平，從而進一步理解它們的活動規律，進一步闡明了細菌內、外毒素的性質、組成和作用機理，顯著地改進了分離培養技術，大大提高了從病人標本中分離彎麴菌或類桿菌的陽性率。

好氧培養也稱好氣培養。就是說這種微生物在培養時，需要有氧氣加入，否則就不能生長良好。在實驗室中，斜面培養是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養多數是通過搖床振盪，使外界的空氣源源不斷地進入瓶中。

微生物培養技術

厭氧培養也稱厭氣培養。這類微生物在培養時，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養過程中，最重要的一點就是要除去培養基中的氧氣。研製開發免疫原性好，副作用小的新型微生物，研製特異，靈敏，簡便，快速的微生物學診斷方法及技術。

3. 微生物接種技術有哪些

七、塗布接種

先倒好平板，讓其凝固，然後再將菌液倒入平板上面，迅速用塗布棒在表面作來回左右的塗布，讓菌液均勻分布，就可長出單個的微生物的菌落。

4. 微生物培養技術常用哪些設備，功能如何

這也太多了，怎麼也得上百種吧。
主要有：超凈工作台、恆溫培養箱、厭氧培養箱、冰箱和低溫冰箱、高壓滅菌鍋、生物安全櫃、搖床、顯微鏡、恆溫水浴鍋、恆溫乾燥箱、酸度計、分光光度計、馬弗爐、高速組織搗碎機、多用途振盪器、標准篩、各種各樣的玻璃儀器一大批、各種各樣的生化試劑和化學制劑一大批。
反正一般的化學實驗室、化學分析室中的儀器設備，在微生物培養中都能用到。

5. 工業發酵常用的微生物有哪些

工業生產上常用的微生物有細菌、放線菌、酵母菌和黴菌,由於發酵工程本身的發展以及遺傳工程的介入,藻類、病毒等也正在逐步成為工業生產的微生物.
1．細菌 工業生產中常用的細菌有：枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、醋酸桿菌、棒狀桿菌、短桿菌、節桿菌、假單胞菌、小球菌等,用於生產乳酸、醋酸、氨基酸、核苷酸、澱粉酶、蛋白酶、脂肪酶、維生素、肌苷酸、丙酮丁醇等產品以及生物防治、細菌浸礦等.
2．放線菌 它的最大經濟價值在於能產生多種抗生素.從微生物中發現的抗生素,有60%以上是放線菌產生的,如鏈黴素、金黴素、紅黴素、慶大黴素等.常用的放線菌主要來自以下幾個屬：鏈黴菌屬、小單孢菌屬和諾卡氏菌屬等.近年來也用放線菌生產氨基酸、核苷酸、維生素和酶制劑等.
3．酵母菌 工業上常用的酵母菌有：啤酒酵母、假絲酵母、類酵母等,用於釀酒、製造麵包、製造低凝固點石油、生產酒精、脂肪酶,以及生產可食用、葯用和飼用的酵母菌體蛋白等.
4． 黴菌 工業上常用的黴菌有：藻狀菌綱的根霉、毛霉、犁頭霉、子囊菌綱的紅麴黴,半知菌類的麴黴、木霉、青黴等；它們可用於生產多種酶制劑、抗生素、有機酸、生長素及甾體激素等.

6. 微生物大規模工業生產常用的培養的方法有哪些

深層液體發酵攪拌罐； 固態發酵培養；

7. 微生物育種技術有哪些

其方法通常為自然選育和人工選育兩類，可單獨使用，也可交叉進行。
DNA Shuffling技術
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隨著PCR技術的發展和應用，1994年美國的stemmer提出了一個全新的人工分子進化技術——DNA Shuffling（又稱洗牌技術），該技術能模擬生物在數百年間發生的分子進化過程，並可在短的實驗循環中定向篩選出特定基因編碼的酶蛋白活性提高幾百倍甚至上萬倍的功能性突變基因。其基本原理是將來源不同但功能相同的一組同源基因，用DNA核酸酶I進行消化 產生隨機小片段，由這些小片段組成一個文庫，使之互為引物和模板，進行PCR擴增，當一個基因拷貝片段作為另一個基因拷貝的引物時，引起模板轉換，重組因而發生，導入體內後，選擇正突變體作新一輪的體外重組。一般通過2-3次循環，課獲得產物大幅度提高的重組突變體。
2自然選育
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對自然界中的微生物，在未經人工誘變或雜交處理的情況下進行分離和純化（見微生物的分離和純化），然後進行純培養和測定（見微生物測定法），擇優選取微生物的菌種。這種方法簡單易行，但獲得優良菌種的幾率小，一般難以滿足生產的需要。
3人工選育
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分誘變育種和雜交育種兩種。
誘變育種

以誘發基因突變為手段的微生物育種技術。1927年，H.J. 馬勒發現X射線有增加突變率的效果；1944年，C.奧爾巴克首次發現氮芥子氣的誘變效應；隨後，人們陸續發現許多物理的（如紫外線、γ射線、快中子等）和化學的誘變因素。化學誘變因素分為3種：①誘變劑與一個或多個核酸鹼基發生化學變化，使DNA復制時鹼基置換而引起變異，如羥胺亞硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、硝基胍、亞硝基甲基脲等；②誘變劑是天然鹼基的結構類似物，在復制時參入DNA分子中引起變異，如5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤和2-氨基嘌呤等；③誘變劑在DNA分子上減少或增加1～2個鹼基，使鹼基突變點以下全部遺傳密碼的轉錄和翻譯發生錯誤，從而導致碼組移動突變體的出現，如吖啶類物質和一些氮芥衍生物（ICR）等。誘變育種操作簡便，突變率高，突變譜廣，它不僅能提高產量，改進質量，還可擴大產品品種和簡化工藝條件。如1943年從自然界分離到的青黴素產生菌的效價只有20單位/毫升，經過一系列的誘變育種後，效價已達40000單位/毫升；金黴素產生菌經誘變後，發酵液中又積累了去甲基金黴素；谷氨酸棒桿菌1299經紫外線誘變後，有的能產賴氨酸，有的能產纈氨酸，增加了產品的種類；土黴素產生菌經誘變後，選到了能減少泡沫的突變菌株，從而提高了發酵罐的利用率。誘變育種的不足是缺乏定向性。
雜交育種

不同基因型的品系或種屬間，通過交配或體細胞融合等手段形成雜種，或者是通過轉化和轉導形成重組體，再從這些雜種或重組體或是它們的後代中篩選優良菌種。通過這種方法可以分離到具有新的基因組合的重組體，也可以選出由於具有雜種優勢而生長旺盛、生物量多、適應性強以及某些酶活性提高的新品系。雜交育種的方式因實驗菌株的生殖方式不同而異，如有性雜交、准性重組、原生質體融合、轉化、轉導、雜種質粒的轉化等；但是，選擇親株、分離群體後代的培養、擇優去劣和雜種遺傳分析的過程基本是相同的。雜交法一般指有交配反應的菌株進行交配或接合而形成雜種。這種方法適用范圍很廣，在酒類、麵包、葯用和飼料酵母的育種，鏈黴菌和青黴菌抗生素產量的提高，麴黴的酶活性增強等方面均已獲得成功。
體細胞融合是在不具性反應的品系或種屬間細胞融合和染色體重組，先用酶溶解細胞壁，再用氯化鈣-聚乙二醇處理原生質體，促使融合，獲得雜種。此法在工業微生物的菌種改良中有積極作用。
轉化和轉導首先應用於細菌，現已廣泛用於鏈黴菌和酵母菌等。隨著重組DNA技術的發展，重組質粒的構建和轉化系統的確立，已可將目的基因轉移到受體細胞內，得到能產生具有重要經濟價值的生物活性物質（如疫苗、酶等）的株系。
微生物與釀造工業、食品工業、生物製品工業等的關系非常密切，其菌株的優良與否直接關繫到多種工業產品的好壞，甚至影響人們的日常生活質量，所以培育優質、高產的微生物菌株十分必要。微生物育種的目的就是要把生物合成的代謝途徑朝人們所希望的方向加以引導，或者促使細胞內發生基因的重新組合優化遺傳性狀，人為地使某些代謝產物過量積累，獲得所需要的高產、優質和低耗的菌種。作為途徑之一的誘變育種一直被廣泛應用。目前，國內微生物育種界主要採用的仍是常規的物理及化學因子等誘變方法。此外，原生質體誘變技術已廣泛地應用於酶制劑、抗生素、氨基酸、維生素等的菌種選育中，並且取得了許多有重大應用意義的成果。
4誘變育種
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1.1物理誘變
1.1.1紫外照射
紫外線照射是常用的物理誘變方法之一，是誘發微生物突變的一種非常有用的工具。DNA 和RNA 的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰在260nm，因此在260nm 的紫外輻射是最有效的致死劑。紫外輻射的作用已有多種解釋，但比較確定的作用是使DNA 分子形成嘧啶二聚體[1]。二聚體的形成會阻礙鹼基間正常配對，所以可能導致突變甚至死亡[2]。
紫外照射誘變操作簡單，經濟實惠，一般實驗室條件都可以達到，且出現正突變的幾率較高，酵母菌株的誘變大多採用這種方法。
1.1.2電離輻射
γ- 射線是電離生物學上應用最廣泛的電離射線之一，具有很高的能量，能產生電離作用,可直接或間接地改變DNA 結構。其直接效應是可以氧化脫氧核糖的鹼基，或者脫氧核糖的化學鍵和糖- 磷酸相連接的化學鍵。其間接效應是能使水或有機分子產生自由基，這些自由基可以與細胞中的溶質分子發生化學變化，導致DNA 分缺失和損傷[2]。
除γ- 射線外的電離輻射還有X- 射線、β- 射線和快中子等。電離輻射有一定的局限性，操作要求較高，且有一定的危險性，通常用於不能使用其他誘變劑的誘變育種過程。
1.1.3離子注入
離子注入是20 世紀80 年代初興起的一項高新技術，主要用於金屬材料表面的改性。1986 年以來逐漸用於農作物育種，近年來在微生物育種中逐漸引入該技術[3]。
離子注入時，生物分子吸收能量，並且引起復雜的物理和化學上的變化，這些變化的中間體是各類活性自由基。這些自由基，可以引起其它正常生物分子的損傷，可使細胞中的染色體突變，DNA 鏈斷裂，也可使質粒DNA 造成斷裂。由於離子注入射程具有可控性，隨著微束技術和精確定位技術的發展，定位誘變將成為可能[4]。
離子注入法進行微生物誘變育種，一般實驗室條件難以達到，目前應用相對較少。
1.1.4 激光
激光是一種光量子流，又稱光微粒。激光輻射可以通過產生光、熱、壓力和電磁場效應的綜合應用，直接或間接地影響有機體，引起細胞染色體畸變效應、酶的激活或鈍化，以及細胞分裂和細胞代謝活動的改變。光量子對細胞內含物中的任何物質一旦發生作用，都可能導致生物有機體在細胞學和遺傳學特性上發生變異。不同種類的激光輻射生物有機體，所表現出的細胞學和遺傳學變化也不同[5]。
激光作為一種育種方法，具有操作簡單、使用安全等優點，近年來應用於微生物育種中取得不少進展。
1.1.5 微波
微波輻射屬於一種低能電磁輻射，具有較強生物效應的頻率范圍在300MHz~300GHz，對生物體具有熱效應和非熱效應。其熱效應是指它能引起生物體局部溫度上升。從而引起生理生化反應；非熱效應指在微波作用下，生物體會產生非溫度關聯的各種生理生化反應。在這兩種效應的綜合作用下，生物體會產生一系列突變效應[6]。
因而,微波也被用於多個領域的誘變育種，如農作物育種、禽獸育種和工業微生物育種，並取得了一定成果。
1.1.6 航天育種
航天育種，也稱空間誘變育種，是利用高空氣球、返回式衛星、飛船等航天器將作物種子、組織、器官或生命個體搭載到宇宙空間，利用宇宙空間特殊的環境使生物基因產生變異，再返回地面進行選育，培育新品種、新材料的作物育種新技術。空間環境因素主要有微重力，空間輻射，以及其它誘變因素如交變磁場，超真空環境等，這些因素交互作用導致生物系統遺傳物的損傷，使生物發生諸如突變、染色體畸變、細胞失活、發育異常等。
航天育種較其它育種方法特殊，是航天技術與微生物育種技術的有機結合，技術含量高，成本高，個體研究者或一般研究單位都難以實現，只能與航天技術相結合，由國家來完成。
1.1.7 常壓室溫等離子體誘變育種
常壓低溫等離子體（Atmospheric and Room Temperature Plasma）簡稱為ARTP，指能夠在大氣壓下產生溫度在25-40 °C之間的、具有高活性粒子（包括處於激發態的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）濃度的等離子體射流。ARTP技術作為一種新型的物理方法，在微生物誘變育種領域有著廣闊的應用前景。
等離子體中適當劑量的活性粒子作用於微生物，能夠使微生物細胞壁/膜的結構及通透性改變，並引起基因損傷，菌株出現遺傳物質損傷後，微生物啟動SOS修復機制，其誘導產生DNA聚合酶Ⅳ和V，它們不具有3ˊ核酸外切酶校正功能，於是在DNA鏈的損傷部位即使出現不配對鹼基，復制仍能繼續前進。在此情況下允許錯配可增加存活的機會。ARTP對遺傳物質造成的損傷，多樣性較高；又SOS誘導修復本身為容錯性修復，因此，ARTP多樣性的損傷將可能在修復過程中包容於DNA鏈中，在微生物進行復制修復時，其可能帶來多樣性的錯配可能。
ARTP應用於微生物突變育種，成本低、操作方便，沒有很多物理誘變設備（如離子束注入等）所需的離子或電子加速、真空和製冷等附屬設備；ARTP對遺傳物質的損傷機制多樣，具有較高的正突變率，突變性能多樣，對於真菌、細菌、藻類等都有效果；ARTP對環境無污染，保證操作者的人身安全，無論用何種氣體放電，其均無有害氣體產生。[1]
5化學誘變
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2.1.1 烷化劑
烷化劑能與一個或幾個核酸鹼基反應，引起DNA 復制時鹼基配對的轉換而發生遺傳變異，常用的烷化劑有甲基磺酸乙酯、亞硝基胍、乙烯亞胺、硫酸二乙酯等。
甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulphonate,EMS) 是最常用的烷化劑，誘變率很高。它誘導的突變株大多數是點突變，該物質具有強烈致癌性和揮發性，可用5%硫代硫酸鈉作為終止劑和解毒劑。
N- 甲基- N'- 硝基- N- 亞硝基胍（NTG) 是一種超誘變劑，應用廣泛，但有一定毒性，操作時應該注意。在鹼性條件下，NTG 會形成重氮甲烷（CH2N2），它是引起致死和突變的主要原因。它的效應很可能是CH2N2 對DNA 的烷化作用引起的[2]。
硫酸二乙酯（DMS) 也很常用，但由於毒性太強，目前很少使用。乙烯亞胺，生產的較少，很難買到。使用濃度0.0001%~0.1%，高度致癌性，使用時需要使用緩沖液配置。
2.1.2 鹼基類似物
鹼基類似物分子結構類似天然鹼基，可以摻入到DNA 分子中導致DNA 復制時產生錯配，mRNA 轉錄紊亂，功能蛋白重組，表型改變。該類物質毒性相對較小，但負誘變率很高，往往不易得到好的突變體。主要有5- 氟尿嘧啶（5- FU) 、5- 溴尿嘧啶（5- BU) 、6- 氯嘌呤等。程世清等[25]用5- BU 對產色素菌（分枝桿菌T17- 2- 39） 細胞進行誘變，生物量平均提高22.5%.
2．1.3 無機化合物
誘變效果一般，危險性較小。常用的有氯化鋰，白色結晶，使用時配成0.1%~0.5%的溶液，或者可以直接加到誘變固體培養基中，作用時間為30min～2d。亞硝酸易分解，所以現配現用。常用亞硝酸鈉和鹽酸製取，將亞硝酸鈉配成0.01~0.1mol/L 的濃度，使用時加入等濃度等體積的鹽酸即可。
2.1.4 其他
鹽酸羥胺，一種還原劑，作用於C 上，使G- C 變為A- T。也較常用,使用濃度為0.1%～0.5%，作用時間60min～2h。
此外，誘變時將兩種或多種誘變因子復合使用，或者重復使用同一種誘變因子，效果更佳。顧正華等[7]以谷氨酸棒桿菌ATCC- 13761 為出發菌株，經DMS 和NTG 多次誘變處理，獲得一株L- 組氨酸產生菌。
2、誘變劑
2.1 誘變劑的選擇
在選擇誘變劑時，需要注意誘變劑的專一性，即某一誘變劑或誘變處理優先使基因組的某些部分發生突變而別的部分即使有也很少發生突變。對誘變劑專一性的分子基礎不十分了解萬盡管有關的修復途徑必定對此有影響，但它們的關系並不那麼簡單，其它各種因素，包括誘變處理的環境條件也能影響突變類型。
工業遺傳學家很難正確地預言改良某一菌種時需要何種類型的分子水平的突變。因此，為了產生類型盡可能多的突變體，最適當的方法是採用幾種互補類型的誘變處理。遠紫外無疑是所有誘變劑中最為合適的，似乎可以誘導所有已知的損傷類型。採取有效、安全的預防方法也很容易。在化學誘變劑中，液體試劑比粉末試劑更易進行安全操作。的另一個不利因素是它有產生緊密連鎖的突變叢的趨勢，盡管這種效應在某些體系中能成為有利條件。最後，必須認識到可能某些特異菌系用某些誘變劑是不能被誘變的。當然這一點通過測定易檢出的突變體，如抗葯性突變體或原養型回復突變體的誘變動力學可以相當容易地得到驗證。[8]
2.2 誘變劑的劑量
從隨機篩選的最佳效果看，誘變劑的最適劑量就是在用於篩選的存活群體中得到最高比例的所需要的突變體，因為這會使在測定效價的階段更省力。
因此在菌株改良以前，為了決定所用誘變劑的最適劑量，並為突變性的增強技術打下基礎，聰明的做法通常是測定不同誘變劑處理不同菌種時的突變動力學。用高單位突變本身來測定最適劑量有時是不可能的，因為這種突變的檢測很困難。但如使用容易檢出的標記如耐葯標記，只要估計到方法的局限性，還是可以提供一些有價值的資料的。

8. 在實驗室,以及在大規模的微生物工業生產中,如何培養微生物

實驗室採用恆溫培養箱和搖床等實驗設備培養，工業上在實驗種的基礎上，再採取多級擴大培養的方式，比如從搖瓶種接到立方級別的的種子罐，根據生產需要可以採取多級種擴大的工藝。

9. 微生物主要培養哪些

按照微生物培養基的物理狀態分：
培養基按其物理狀態可分為固體培養基、液體培養基和半固體培養基三類。
(1)固體培養基。是在培養基中加入凝固劑，有瓊脂、明膠、硅膠等。固體培養基常用於微生物分離、鑒定、計數和菌種保存等方面。
(2)半固體培養基。是在液體培養基中加入少量凝固劑而呈半固體狀態。可用於觀察細菌的運動、鑒定菌種和測定噬菌體的效價等方面。
(3)液體培養基。液體培養基中不加任何凝固劑。這種培養基的成分均勻，微生物能充分接觸和利用培養基中的養料，適於作生理等研究，由於發酵率高，操作方便，也常用於發酵工業。
按照微生物的種類分類：
培養基按微生物的種類可分為細菌培養基、放線菌培養基、酵母菌培養基和黴菌培養基等四類。
(1)常用的細菌培養基有營養肉湯和營養瓊脂培養基。
(2)常用的放線菌培養基為高氏1號培養基。
(3)常用的酵母菌培養基有馬鈴薯蔗糖培養基和麥芽汁培養基。
(4)常用的黴菌培養基有馬鈴薯蔗糖培養基、豆芽汁蔗糖(或葡萄糖，葡萄糖比較昂貴)瓊脂培養基和察氏培養基等。
按照微生物培養基用途分類：
培養基按其特殊用途可分為基礎培養基、加富培養基、選擇性培養基和鑒別培養基。
(1)基礎培養基。是含有一般微生物生長繁殖所需基本營養物質的培養基。牛肉膏蛋白腖培養基是最常用的基礎培養基。
(2)加富培養基。是在基礎培養基中加入血、血清、動植物組織提取液製成的培養基。用於培養要求比較苛刻的某些微生物。
(3)選擇性培養基。是在普通微生物培養基中加入特殊營養物質或化學物質，以抑制不需要的微生物的生長，有利於所需微生物的生長。用於將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。