㈠ 基因工程中的ICM是什麼
inner cell mass (abbreviated ICM and also known as the embryoblast or pluriblast）
也就是胚胎早期,中間的那個纖山純細胞毀咐陀,由多能幹細胞組成唯攔
㈡ 生物信息學筆記-術語篇
它是一種度量兩個變數間相關程度的方法。它是一個介於 1 和 -1 之間的值，其中，1 表示變數完全正相關， 0 表示無關，-1 表示完全負相關。
r值就是皮爾遜相關系數的大小，代表了相關的強度，即兩個變數共變性的程度，取值范圍為（-1,1）。
p值是顯著性，與皮爾遜相關顯著性檢驗有關，P<0.05時表示相關顯著，即在當前的樣本下可以明顯的觀察到兩變數的相關，兩個變數的相關有統計學意義。
能提供有關數據位置和分散情況的關鍵信息，尤其在比較不同的母體數據時更可表現其差異。
如上圖所示，標示了圖中每條線表示的含義，其中應用到了分位值（數）的概念。
隨訪研究，如對 某人群進行跟蹤，直至出現一個特殊事件或終點，如死亡、癌症復發等，對所有研究對象從某特定時間點開始追蹤，記錄出現特殊事件的時間。通常，當所有研究對 象出現該事件時研究才結束，但也有些研究對象可能失訪，或者研究提前結束，這樣就有一些對象的結局未知，對這些對象記錄跟蹤的時間（截尾數據）。
假設檢驗 是推斷統計中的一項重要內容。用SAS、SPSS等專業統計軟體進行假設檢驗，在假設檢驗中常見到P值( P-Value，Probability，Pr)，P值是進行檢驗決策的另一個依據。
P值即概率，反映某一事件發生的可能性大小。統計學根據顯著性檢驗方法所得到的P 值，一般以P < 0.05 為顯著， P<0.01 為非常顯著，其含義是樣本間的差異由抽樣誤差所致的概率小於0.05 或0.01。實際上，P值不能賦予數據任何重要性，只能說明某事件發生的機率。
主要包含六個數據節點，將一組數據從大到小排列，分別計算出他的上邊緣，上 四分位數 Q3， 中位數 ，下四分位數Q1，下邊緣，還有一個 異常值 。
是表示這兩組之間的生存率是否有差異。
因為一般生存分析研究的都是一個實驗組的治療方法之類的， 一個對照組的傳統方法之類。通過生存分析對比，可以發現兩組生存率之間是否存在差異，繼而說明兩種實驗處理是否有差異，或者哪種處理更有效
是整體比較，比如你的生存時間是5年的，那自然是比較整體5年下來的生存率，如果你的生存時間是10年的跟蹤數據，那自然是比較整體10年下來的生存率。
生存分析比較的生存率，本來就是一個整體一段時間持續下來的生存率，而不是單個時間點的生存率
數據標准化是指：數值減去均值，再除以標准差;所謂中心化， 是指變數減去它的均值.
又稱蛋白質印跡(Western blotting)，是一種藉助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。該方法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術，既具有凝膠電泳的高解析度又具備固相免疫測定的高特異性和高靈敏性，可檢測1－5ng的中等大小蛋白。其優點是方法簡便、標本可長期保存、結果便於比較，故被廣泛應用於分子生物學等領域，成為一種常用的一種研究方法。
保守性一般是在進化理論中應用較多，「保守性好」指的是發生突變的幾率低。以蛋白為例，一般用於進化或物種親緣關系分析的蛋白都含有可變部分——非保守區，和穩定部分——保守區。
順式作用元件(cis-acting element)是指DNA分子上對基因表達有調節活性的特定核苷酸序列。順式作用元件的活性隻影響同一DNA分子上的基因。這種DNA序列多位於基因上游或內含子中。
真核基因的順式作用元件按其功能可以分為：啟動子、增強子和靜止子。
啟動子的結構和功能
啟動子是轉錄因子和RNA聚合酶的結合位點，位於受其調控的基因上游，鄰近基因轉錄起始點，是基因的一部分。
增強子的結構和功能
增強子（enhancer），又稱強化子（transcriptional enhancer），是一種遠端調控元件，至少距轉錄起始點上游100bp以上，通常位於－700～－1000處，所以又稱為上游激活序列(upstream activator sequence, UAS)。
增強子也要通過與特定的蛋白質因子(轉錄因子)結合而實現其對轉錄的增強作用。
靜止子
是一種類似增強子但起負調控作用的順式作用元件。有人稱為沉默基因。靜止子與相應的反式作用因子結合後，可以使正調控系統失去作用。
不論是啟動子還是增強子序列，他們的轉錄調節功能都是通過與特定的DNA結合蛋白的相互作用而實現的。
真核生物的RNA聚合酶與原核生物的RNA聚合酶不同，它本身不能啟動轉錄，純化了的真核生物RNA聚合酶在體外是不能啟動轉錄的。因此必須事先有一套轉錄因子裝配到啟動子上，RNA聚合酶才能啟動轉錄。
這些轉錄因子一般並不是RNA聚合酶的組成成分。
能直接或間接識別各種順式調控元件並與之結合從而調控基因轉錄效率的各種蛋白質分子稱為反式作用因子 (trans-acting factor)。
能激活真核生物基因轉錄的蛋白質稱為轉錄因子(transcription factor, TF)。轉錄因子是參與正調控的反式作用因子，是轉錄起始過程中RNA聚合酶所需要的輔助因子。
是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。
將混合抗原樣品在凝膠板上進行單向或雙向電泳分離, 然後取 固定化 基質膜與凝膠相貼。在印跡紙的自然吸附力、 電場力 或其它外力作用下, 使凝膠中的單一抗原組份轉移到印跡紙上, 並且固相化。最後應用免疫覆蓋液技術如免疫同位素探針或免疫酶探針等, 對抗原固定化 基質 膜進行檢測和分析。
有時稱為短干擾RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一個長20到25個 核苷酸 的雙股RNA，在生物學上有許多不同的用途。
CpG表示核苷酸對，其中G在DNA鏈中緊隨C後。CpG對很少出現在人類基因中。然而，在許多基因的 啟動子 （promotor）或 轉錄起始位點 （transcription start site，TSS）區域周圍， 甲基化 經常被抑制。這些區域包含濃度相對較高的CpG對，與染色體一起稱作 CpG島 ，其長度通常在幾百到幾千核苷酸的長度內變化。
CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區段，CpG保持或高於正常概率，這些區段被稱作CpG島，在哺乳動物基因組中的1~2kb的DNA片段，它富含非甲基化的CpG雙倍體。
所謂陰性和陽性指的是細胞生存下來的條件。陽性選擇指的是只有反應的細胞才能生存，否則凋亡。陰性選擇指的是只有不反應的細胞才能生存，否則凋亡。
對於B細胞來說
陰性選擇指的是只有在骨髓發育中不予自身抗原反應的B細胞才能生存；陽性選擇指的是在外周在體細胞高頻突變的過程中能高親和力識別T細胞提呈的B細胞才能增殖。B細胞是先陰選後陽選
對於T細胞來說
陽性選擇指的是只有在胸腺皮質發育中識別MHC分子的T細胞才能生存；陰性選擇指的是只有在胸腺髓質發育中不予自身抗原反應的T細胞才能生存；T細胞是先陽選後陰選
一般指基因組中由短的重復單元(一般為1～6個鹼基)組成的DNA串聯重復序列。
微衛星DNA符合孟德爾遺傳模式，共顯性表達，廣泛分布於真核生物的基因組中，包括編碼區和非編碼區.研究表明，可能是DNA復制過程中的「鏈滑」(strand slippage)現象造成微衛星DNA多態性信息容量(polymorphic information content, PIC)較高.
由於微衛星具有數量多、在基因組內分布均勻、多態性信息豐富、易於檢測等優點被作為優良的遺傳標記(genetic marker)而得到廣泛應用。
根據重復單元的構成與分布,微衛星DNA序列被分為3種類型：單一型(pure)，復合型(compound)和間斷型(interrupted), 例如:
單一型:ATATATATATATATATATATATAT
復合型: ATATATCACACACACACACAC
間斷型: ATATATCA ATATATCA ATATATA
某一物種的染色體圖譜（也就是我們所知的連鎖圖譜），顯示所知的基因和/或遺傳標記的相對位置，而不是在每條染色體上特殊的物理位置。由遺傳重組測驗結果推算出來的、在一條染色體上可以發生的突變座位的直線排列（基因位點的排列）圖。
遺傳圖譜即遺傳連鎖圖譜，是基因組研究中的一個重要組成部分，它是指基因組中基因以及專一的多態性標記之間相對位置的圖譜。即通過兩點測驗和三點測驗對統計的各種帶型個體數進行連鎖分析計算，建立連鎖群。也可從第二個標記開始，測驗與前一個標記是否協同分離。根據分離資料，用最大似然法估計不同標記位點間的重組率數值並轉換成遺傳距離，連鎖的遺傳標記間距離，一般用cM表示，IcM為同源染色體配對期望交換值1%的染色體長度。隨著計算機技術的發展，目前已有多個構建遺傳圖譜的軟體，研究者用的較多的軟體主要有MapMaker及 JoinMap 3.0 。
在某些情況下，待檢驗樣本中不含待測物質或者含有但是濃度很低，為了證明自己建立的方法能對樣本中待測物質進行有效的檢測，可在待檢樣本中加入一定量的待測物質（外標）來進行該方法檢測能力的驗證。有時，這種加入外標的物質，也可用作為陽性對照。
In genetics, a mosaic, or mosaicism describes the presence of two or more populations of cells with different genotypes in one indivial, who has developed from a single fertilized egg.Mosaicism has been reported to be present in as high as 70% of cleavage stage embryos and 90% of blastocyst-stage embryos derived from in vitro fertilization.
WGA是一組對全部基因組序列進行 非選擇性擴增的技術，其目的是在沒有序列傾向性的前提下大幅度增加 DNA 的總量。其中最具代表性方法是 DOP-PCR 和 PEP-PCR。 DOP-PCR 和 PEP-PCR 的基本原理都是通過其隨機引物與基因組 DNA 多處退火從而使大部分基因組序列得到擴增。DOP-PCR 的引物是由其 3′和 5′端的特異核苷酸序列和中間的 6 個核苷酸構成的隨機引物組成。PEP-PCR 的引物是由15 個隨機核苷酸組成的完全隨 機引物。
㈢ icm在醫學是什麼意思
內細胞團(Inner Cell Mass)
㈣ 什麼是ICM
應該是.ICM
21世紀商品分銷模式的重大創新突破ICM的定義和原理
互動式合作營銷是一種獨創的嶄新營銷模式，其英文表述為∶Interactive Cooperation Marketing，簡稱∶ICM。它獨創了顧客成為經營者且平等參與社會財富分配的新型商業營銷模式，提出了21世紀商品分銷和零售領域的游戲規則---「顧客同我們都是老闆」！打破了20世紀商品分銷和零售領悉晌迅域的游戲規則---「顧客是我們的老闆」！把顧客與零售終端消費的關系只是一買一賣的純顧客關系變成了跟零售消費終端是合作經營的生意夥伴關系。ICM的誕生並非一夜空穴來風，它是集體智慧結晶之結果，是許多營銷專家、企業管理專家以及許多有識之士艱苦卓絕努力探索之結果，是西方營銷文化同東方文化相互交融之結果，是21世紀挑戰和機遇並存而改變舊觀念大膽創新之結果，是有識之士復興中華夢想的偉大使命之結果！
一、ICM的基本原理
ICM的基本原理∶消費者通過自身的完善和進步與企業一道去影響其它消費者在同一消費終端消費或者影響其它自然人或法人成為消費終端的方式且多勞多得而獲取傭金收入的一種企業產品分銷模式。
ICM有6大特點∶
1、它是全世界最簡單的一種個人生意模式；
2、它是企業最迅速、最公道、最人性的產品分銷模式；
3、它提供全球高品質的產品和商品；
4、它是當今各種營銷模式（如整合營銷、資料庫營銷、綠色營銷、一對一營銷、體驗營銷等）的集合體；
5、它是未來營銷模式致高境界「五網合一」的模式，即消費含零售終端網路、顧客消費網路、電子商務網路、物流配送網路、電腦資料庫及信息網路，這五種網路系統合而為一的網路化模式；
6、它屬於第三個經濟時代產品經濟時代、服務經濟時代、體驗經濟時代，即體驗經濟時代的體驗營銷模式。
怎樣理解ICM Interactive Cooperation Marketing的簡稱？簡單地講ICM既是一種公司創業模式又是一種個人創業模式。為了使讀者深入了解ICM，這里我們以個人創業模式為由來談一談。
如果說「進商場或店鋪買東西給您發獎金」是ICM。那麼，有人會講，那有這種好事！如果有，還不是「羊毛出在羊身上」。玩這種游戲的商場或店鋪里我見得多了，比如石家莊「女人世界商場」就是購物返還你50%的現金！她講得很有道理，所以，這不是ICM。
如果說進商場買東西給您發獎金倒不假，比如北京當代商城就是這么做。如果您在當代商城年消費額累計在10000~29999元，它就返還給您2%的禮金券或者贈送禮品。也就是講當您購物累計到10000元時，它返還您200元與之相當價值的東西，反正不是現金。我們說這300%肯定不是ICM。
如果說「給您一個賺錢的機會」是ICM。您會說賺錢的機會多了，報紙上天天都有「給您一個發財的機會」，那報紙上的機會不是都成了謹帆互動式合作營銷了。看來這也不是ICM。
如果說「您只要推薦或介紹別人進商場或店鋪買東西您就有錢賺」是ICM。聽起來有一點道理，不過會有「非法傳銷」的嫌疑，甚至會與「非法傳銷」劃等號。由此看來這也揭示不了ICM的內涵。
如果說「給您一個夢想成真的機會」是ICM。您會講，這跟「給您一個發財的機會」有什麼區別！看來這也說明不了ICM，善於「聯想」的人很容易又與「非法傳銷」劃等號，因為「非法傳銷」就是這么「喊」的。
如果說「消費者都可以平等地成為經營者參與社會財富分配的一個機會」是ICM。聽起來倒挺順耳，不過消費者怎樣才能平等地參與社會財富分配？幾百年都沒解決，怎麼今天您解決了？反正死活不相信。等您解釋清楚，他也睜此聽得不耐煩了。看來這樣理解ICM也不行。
如果說「專門有人教您掙錢的方式」是ICM。您說我暫且相信有這種好事。您會問教我掙錢那他掙不掙錢？我說幾乎不掙或掙得很少。您會問教我掙錢而他不掙錢？那他吃什麼？反而把我問倒；如果說他當然掙您錢。您會問那他掙我多少錢？如果我說少了，您不相信；如果我說多了，您說他太黑，您不幹！看來這也揭示不了ICM的內涵。
如果說「您替商場或店鋪賣商品，然後商場或店鋪按你的銷售額給您返一定比例的獎金給你」是ICM。您說大街上那家公司不是這樣做。這跟推銷有什麼區別？看來這也不是ICM。
如果說「培養您如何當老闆建立自己的生意」是ICM。您會說人人都想當老闆，但是我天生不是當老闆的料！我說當老闆很簡單。您會說既然當老闆很簡單，那為什麼這個世界還是老闆少，打工的多？反而我沒有道理了。看來這也不是ICM。
如果說ICM是就是建立一個「網路」的生意。您會問是不是又是「非法傳銷」？我說「網路」是一個非常寬泛的概念。建立「營銷網路」幾乎是所有公司的一個最基本的營銷手段。ICM當然是要建立「營銷網路」的，但「營銷網路」不一定是傳銷！保險公司也在做「網路」，麥當勞也在做「網路」，三九集團也在做「醫葯連瑣網路」。
由此看來，想用一句話說明什麼是ICM恐怕不行，二句話恐怕也不行！我們把ICM的基本內涵講出來，你來總結應該怎樣正確理解ICM？首先我們應該懂得人性中的幾個真理∶
ⅰ、人人都想過美好的生活！
ⅱ、人人都渴望經濟自由！
ⅲ、人人都願意努力！
ⅳ、人人都對陌生的東西害怕！
ⅴ、人人都渴望被別人尊重！
ⅵ、人人都渴望成為傳奇式人物！
在商品經濟社會中，人們最渴望得到二種東西∶一種是經濟自由；一種是渴望成為傳奇式人物！一些人對經濟自由要求強烈一點，而成為傳奇式人物要求弱一點，這是大部份人；而一些人對成為傳奇式人物要求強烈一點，而對經濟自由要求弱一點，這是少部份人。我們知道營銷的本質在於「發現」人的需要和慾望needs and wants並且「滿足」她。那麼，怎樣去滿足人們的這二個需要和慾望呢？僅靠打工不是不可以，但是一般比較難！這是少數人的權利。那怎樣讓大多數人也擁有這個權利？就成為了ICM的基本出發點。
但問題又出來了，先說經濟自由這個問題。我們先講一個真理∶人人都可以得到經濟自由。那又為什麼多數人沒有得到經濟自由呢？我們說人人都可以得到經濟自由，這是一個真理，但是並不是人人都願意為了實現經濟自由而努力的，因為願意努力的只是一部分人，這也是一個真理。ICM是給願意實現經濟自由的人搭建的一個平台。這個平台對任何人任何消費者都是一樣的。不會因為您是明星就特別關照您，也不會因為您是普通百姓就對您不公平。用一句話來講就是∶ICM是給願意實現經濟自由的人或消費者搭建的一個可以通過其努力實現經濟自由的平台。這是它的第一層含義。
怎麼搭建呢？問題又出來了∶一是消費者沒有太多的「有形資本」，即看得見，摸得著的資本，比如貨幣、房產等。二是消費者缺乏「無形資本」，即看不見，摸不著的資本，比如知識、經驗、信息等。三是消費者從來沒有做過老闆，她害怕！她懷疑自己到底行不行？她對成功有本能的恐懼！而且，您又不可能借給消費者一筆錢；其二，您又不可能送給消費者股份，讓她成為您的股東？其三，您又不可能教消費者如何掙錢？即使教幾乎都要免費！所以，在這種情況下，在20世紀工業化為背景的條件下，您要給願意實現經濟自由的人或消費者搭建的一個通過其努力實現經濟自由的平台，幾乎難於做到！但難不等於不可能，20世紀做不到，但21世紀就有可能做到。唯一的辦法就是二個字∶創新！所以我們講21世紀是一個以創新為第一生存法則的世紀。那麼又怎樣創新呢？就是您要帶領消費者推翻「三座大山」∶ 一座是「有形資本」的大山；第二座是「無形資本」的大山；第三座是「對成功本能的恐懼」的大山！也就是講您要讓消費者起步的投資他要能夠承受；二是要把您如何實現經濟自由的知識、經驗、信息等教授給他，而且收費也要他能夠承受；三是您要教授並且協助他克服「對成功本能的恐懼」。ICM給消費者搭建了二個舞台∶一個是讓消費者起步他能夠承受得起的投資，並且經過他的努力可以獲得無限不封頂收入的舞台；另一個是教授他如何實現經濟自由的知識、經驗、信息等，並且協助他如何克服「對成功本能的恐懼」，而且收費也要他能夠承受得起的舞台。用一句話來說就是∶一個是給消費者搭建參與社會財富分配機會的舞台；另一個是不斷提升消費者分配世界財富能力的舞台！這是它的第二層含義。
那消費者如何在這二個舞台上獲得自己想要的東面呢？會不會別人白送給她？當然不會！會不會輕輕鬆鬆就獲得巨大的收入？300%更不會！否則就不符合多勞多得的原則。就是講舞台是給她搭好了，燈光、音樂也給她准備好了，導演也來了，但是她想在舞台上展示自己的歌喉，是不是最終還是靠她自己的努力？為了讓她練習唱歌，公司指定了一所很有實力的學校和老師來教她，這就是教育和培訓。其目的就是提升她的綜合素質能力。一句話，成功靠她自已去贏得。這是它的第三層含義。
居然成功靠她自已去贏得，就是說只有付出才會有收獲，但是ICM是不用專職去從事的。這是一個兼職的附帶的個人生意。做生意當然是要賺錢，那麼，這個兼職的附帶的生意可以賺多少錢呢？少了她會覺得浪費她的時間，還不如看電視；多了當然好，但太多了她又害怕！所以，我們講ICM可以讓她兼職附帶地賺到跟「她目前的收人」差不多的一份收入。比如，她目前的工資是800元/月，那麼，經過她的努力，她就可以兼職附帶地賺到800元/月左右的收入；如果她目前的工資是6000元/月，那麼，經過她的努力，她也可以兼職附帶地賺到6000元/月左右的收入。一句話ICM是一個兼職的附帶的生意。這是它的第四層含義。
21世紀是一個網路化社會，未來我們不是「自投落網」就是被合種各樣的網罩住，可以講未來幾乎所有的生意都是網路化的。ICM就是一個網路化的生意。消費者同公司合作注意不是僱傭一起共同去構建一個「營銷網路」。這個「營銷網路」屬於雙方共有，但是它是私人財產，公司無權剝奪和非法佔有，就好像您購買的私人房產一樣，您有權利繼承、轉讓和迫買，不過公司有優先購買權。一句話這個「營銷網路」是您的私人財產。這是它的第五層含義。
ICM又是一個非常簡單的生意，人人都可以來實踐操作。它是一個「全天候」的生意，就是全天24小時任何時候、任何地點、任何環境都可以做的生意。你可以在出差途中的火車上、飛機上、輪船上；也可以朋友聚會上、生日上、婚禮上；也可以在談判的間隙中、工作的間隙中、逛商場中、逛公園中；也可以在出國旅行中、朋友家串門中、業務活動中……總之，隨時隨地都可以做的生意，甚至給別人贈一張名片，讓他上網，你的生意就開始了，甚至簡單到你只須發名片，可能就有獎金發的地步。一句話ICM是一個簡單的生意。不過我們要提醒讀者，ICM這個生意雖然看起來很簡單，但簡單並不代表容易！相反可能更難，總之只有一分耕耘才有一分收獲。這是它的第六層含義。
ICM能不能滿足人們成為傳奇式人物的需求呢？當然可以！當她經過自己艱辛的努力真正成功以後，大家向她鼓掌的時候，她就已經是一個傳奇式的人物了！這是ICM的第七層含義。
這就是ICM的基本內涵。用一二句話是不是難於講明白？您能用通俗的話把這「七個層次」的內涵讓別人聽明白，這就是ICM。為了讓讀者更好地理解ICM，我們再來談一談「營銷網路Marketing network」。ICM的最終結果就是當代市場學權威美國西北大學教授菲利普.科特勒Philip Kotler在其所著並且被世界公認為市場學「聖經」的營銷管理一書中所說的建立一個「營銷網路」。他講∶「關系營銷的最終結果是建立起公司的獨特資產，即一個營銷網路Marketing network。營銷網路由公司與所有它的利益關系方（顧客、員工、供應商、科學家、廣告代理人和其它人建立互利的業務關系。這樣競爭不是在公司之間進行，而是在整過網路之間進行。一個建立了更好營銷網路的公司將獲勝。該操作原則是簡單的∶與關鍵的利益關系者建立良好的關系後，利潤就會滾滾而來」。
ICM的營銷網路Marketing network由五大部分組成∶
第一部分∶超級消費終端網路；
第二部分∶顧客消費網路；
第三部分∶電子商務網路；
第四部分∶物流配送網路；
第五部分∶電腦資料庫及信息交換網路。
這五個網路是一而不是五，它是「五網合一」的，不是分開的，而是相互疊加、相互融合的。工業化時代，「消費含零售終端」就像一座座「孤島」，不會成為網路；消費者與消費者之間、顧客與顧客之間是「隔斷」的，也不會自動形成一個網路；公司與企業之間，公司與顧客之間更不會自動形成一個網路。電子商務就根本沒有。信息化社會的共同特徵是要求信息的迅速傳播和共享。這就要求個體與個體之間必須連接起來，而且還要高效，就像一台一台電腦相互連接起來一樣。網路化是21世紀社會一個最基本的特徵，所以，在21世紀您如果不會做網路，恐怕難於生存，更不用說競爭。ICM的立足點就是網路，可以講它是一個「織網」的營銷。完全可以講，未來任何一個企業，只要具有一個強大的營銷網路，就會產生巨大的附加值。「附加值」就是額外增加的收入。任何一種商業模式，如果不能帶來附加值就算不上是一個好的商業模式。
什麼是ICM的附加值？這里我們舉幾個例子∶
例一∶ICM不僅僅局限在商品分銷和零售領域。它是一個很寬泛意義上的營銷模式和盈利系統。它可以用零售終端商場和店鋪作為平台向其它領域或行業延伸。比如公司可以跟全國某連瑣的加油站合作，使加油站也成為一個「零售終端」。這樣出租汽車司機再去加油時，他就會去這樣一個「互動式加油站」零售終端加油！為什麼？因為司機已經從一名純消費者變成了自己生意的老闆。他再去加油，已經不再是像過去那樣去「買」油了，而是在做他自己的「生意」了。在過去傳統思維模式下，他是不會主動介紹其它的司機也去「互動式加油站」這個零售終端加油的，而今天，他卻可以在休閑聊天的時候這樣做，因為他是經營自己的生意，而不是再去「買」油。
又比如公司可以跟某航空公司合作，在公司的「超級專營店」增設機票代理處或者把航空公司售票處變成一個「零售終端」。這樣消費者在購買機票時就會進「超級專營店」機票代理處購買或者只去這家航空公司售票處購買。為什麼？一樣的道理，因為她已經從一名純消費者變成了自己生意的老闆。她再去購買機票，就不再是像過去那樣隨意購買了，而是懂得在經營她自己的「生意」。在過去傳統思維模式下，他是不會主動介紹其它的消費者也去這家航空公司售票處購票的，而今天，他卻可以在坐飛機的旅途中向別人推薦這種既消費又做生意的方式，因為他是在經營自己的生意。
又比如公司可以跟某城市的優秀連瑣餐館不連瑣也可以合作，把連瑣餐館也變成為一個「零售終端」，變成為一個「互動式餐館」。這樣顧客在就餐時，就會主動選擇進這家連瑣餐館就餐，並且還會主動介紹其它顧客也去這家連瑣餐館就餐。還是一樣的道理，因為她已經從一名純消費者變成了自己生意的老闆。他再去就餐時，就不再是像過去那樣隨意了，而是懂得在經營她自己的「生意」。在過去傳統思維模式下，她是不會主動介紹其它的消費者也去這家互動式連瑣餐館就餐的，而今天，他卻可以在任何時候向別人推薦這種就餐既消費又做自己生意的方式，因為他是在經營自己的生意。
又比如公司可以跟某保險公司合作，把其保險代理公司或分公司變成一個「零售終端」，變成為一個「互動式保險公司」。這樣顧客在購買保險時，就會主動選擇進這家保險公司，並且還會主動介紹其它顧客也選擇進這家保險公司。還是一樣的道理，因為她已經從一名純顧客變成了自己的老闆。他在購買保險時，就不再是像過去那樣隨意了，而是懂得在經營她自己的「生意」。在過去傳統思維模式下，他是不會主動介紹其它的顧客也去這家保險公司購買保險的，而今天，他卻可以在任何時候向別人推薦這種購買保險就是做自己生意的方式，因為他是在經營自己的生意。
又比如公司可以跟某電話公司合作，把電話公司變成一個「零售終端」，變成為一個「互動式電話公司」。這樣顧客在選擇安裝電話時，就會主動選擇這家電話公司，並且還會主動介紹其它顧客也選擇這家電話公司。還是一樣的道理，因為她已經從一名純顧客變成了自己的老闆。他在選擇安裝電話時，就不再是像過去那樣隨意了，而是懂得在經營她自己的「生意」。在過去傳統思維模式下，他是不會主動介紹其它的顧客也選擇這家電話公司安裝電話的，而今天，他卻可以在任何時候向別人推薦這種裝電話打電話就是做自己生意的方式，因為他是在經營自己的生意！例如可以造擇跟「網通公司合作」。讓顧客購買網通IP卡打電話或者推薦別人也購買網通IP卡打電話，他還能為自己賺錢。
例二∶ICM的顧客消費網路比零售終端網路還要大，顧客的本來面目是人。（公司）巨大的顧客群，需要對他們做大量的培訓，這種培訓可能是免費的，因而它會給公司帶來巨大的潛在顧客。這個效益是無法用金錢來衡量的，因而未來培訓你的顧客、培訓你的消費者將成為流行時尚。
例三∶21世紀是網路為王的時代。有了遍及全國乃至全球的「超級專營店」這個實實在在的看得見、摸得著的，長在地上的，能吸引周圍忠誠顧客的，又緊密相連的，沖不斷、打不垮的網路終端，其本身就是財富。現很多國外大型企業，看中的就是你手中的網路終端這個王牌，所以，這個附加值也是很大的。如公司可以跟國外某葯業或某保健品公司合作，讓他們的非處方葯和保健品進入「超級專營店」。讓顧客購買非處方葯品和保健品或者推薦別人也購買非處方葯品和保健品，他還能為自己賺錢。
這樣的例子可以舉無數個，也就是講理論上任何一家企業都可以進行ICM，而不僅僅是生產企業或零售企業，所以，我們可以肯定講，ICM模式將成為21世紀一個最普遍應用的留住顧客並使顧客忠誠於公司的常用營銷手段。ICM雖然在世界上是我們首先在世紀之初提出來，但10年後、20年後它將成為一種流行方式。盡管我們有此信心，但並不意味著它很快會被人們接受，相反，它首先會被人們反對、懷疑甚至攻擊！道理很簡單∶人性的弱點是對陌生事物心存恐懼！對陌生環境心存恐懼！人的本能是排斥新生事物，而喜好舊有事物。這就很好理解中國改革開放之初觀念的變革國人所遭遇到的巨大阻礙和痛苦！但是，舊有的東西畢竟會消失，新生的東西畢竟會降臨，就在於它代表著歷史發展的必然，代表著人們的希望和夢想。
㈤ 我想知道「多物種非人獸混合胚胎」發育後會出現什麼現象新個體是否會融合多物種的特徵
你所說的就飢悉芹是生命科學研究上的嵌合體
嵌合體研究進展
1 嵌合體的概念
嵌合體(Chimera)一詞源於希臘文,古希臘神話中用它
代表羊頭、獅身、蛇尾這樣一些由不同種類的動物所拼湊成
的怪物,這意味著人們改造自然的願望。20世紀60年代中
期,在高等哺乳動物上得到了由兩個或兩個以上不同遺傳性
狀組成的胚胎發育成的個體,這種個體的組織器官是由基因
型不同的細胞群所組成,故稱之為嵌合體。有的學者用非自
主表型(Allophene)一詞代表這種個體,意指不同的表型是由
於有不同基因型的緣故。為了方便起見,Ford(1969)把在發
育的很早期,如卵裂期甚至受精卵期所形成的嵌合體,稱為
原發性嵌合體(Primary Chimera);把在發育的晚期,如胚層
已分化,或器官開始形成後通過組織移植或嫁接等方法所形
成的部分組織或器官的嵌合,稱為次生型嵌合體(Secondary
himera)。通常所說的嵌合體指原發性嵌合體,即人工地將
兩個或兩個以上具有不同陸碧遺傳性狀的早期胚胎,或者把具有
特種遺傳性狀的細胞和早期胚胎聚合或顯微注射所產生的
嵌合體〔1〕。嵌合胚內不同來源的細胞相互調節、相互作用以
至共同完成胚胎發育。由於嵌合體能攜帶適當的遺傳標記
並能在個體發育中表現出來,因而它成為研究所有動物個體
發育最為理想的實驗材料和遺傳研究模型。
2 嵌合體研究概況
2.1 小鼠嵌合體的研究進展
嵌合體研究至今已有80多年的歷史。1942年,Nicholas
和Hall就曾試圖用不同品系的大鼠,將其早期分裂球進行聚
合製作嵌合體,結果只得到一個死胎,未能證明為嵌合體。
之後,Tarkowski(1961,1963)〔2〕將具有不同毛色和葡萄糖磷
酸異構酶(Glucose Phosphate Isomerase,GPI)遷移率不同的兩
種小鼠的胚胎,在卵裂的不同時期,如8-細胞期、16-細胞
期,甚至桑葚胚進行聚集,成功地製作了世界上第一隻嵌合
體小鼠。通過毛色和同工酶的測定,證明這些嵌合體的各種
組織中都有來自兩種胚胎的細胞。至此以後,嵌合體技術受
到了國內外哺乳動物發育生物學工作者們的極大重視。
Gardner在1968年又創建了囊胚注射法,並用這種方法
成功地獲得嵌合體,因此法具有許多優點,可將不同類型的
細胞直接注射到囊胚腔內,所以成為目前獲得嵌合體的主要
研究手段〔3〕。1981年,Evans和Kaufman〔4〕及Martin〔5〕首次
報道了從正常小鼠胚胎中分離建立了胚胎多能幹細胞系,簡
稱ES細胞(Embryonic Stem Cells)。由於這種細胞來源於正
常胚胎,在細胞形態、生化特性、細胞表面抗原組成、體內外
分化能力等方面與分離的胚胎內細胞團(Inner Cell Mass,
ICM)十分相似,多數具有完整二倍體核型,可以有較高的頻
率形成嵌合體。1984年,Bradley等〔6~8〕通過囊胚注射法獲
得了首例小鼠ES細胞種系嵌合體,種系嵌合體的獲得是實
現ES細胞介導的轉基因途徑的決定步驟。ES細胞種系分
化能力的保持是決定種系嵌合的前提條件,盡管可通過體內
外分化實驗及全能性細胞分子標記推測ES細胞系是否具有
多方向的發育潛能,但嵌合體的製作及種系嵌合體的獲得則
是判定ES細胞系是否具有種系分化能力的唯一方法。
Robertson等〔9〕及Gossler等〔10〕在1986年,分別以
PSVmos-1neo和pSVtkneoβ融合基因轉化小鼠ES細胞
並成功實現種系傳遞,宣告了ES細胞途徑的誕生。與原核
注射及逆轉錄病毒感染等其他轉基因途徑相比,ES細胞途
*為通訊作者。
徑的優點在於ES細胞可在體外連續培養並保持發育全能
性,使得目的突變的篩選可在細胞水平而非爛畢個體水平進行。
尤為重要的是,利用基因組同源序列及合適的選擇標記基因
可構建基因打靶(gene targeting)載體轉化ES細胞獲得小概
率的同源重組事件,進而經由種系嵌合體得到內源基因定位
致變(knock—out)或外源基因定點整合(knock—in)的突變品
系,這是迄今為止任何其他轉基因途徑所無法實現的。
1987年,Thomas和Capecchi將基因定位整合技術與ES
細胞途徑相結合,首次獲得了內源基因(Hprt)定位失活的轉
基因小鼠。隨後,人們以同樣的方法成功地定位改變了一系
列的內源基因,例如:通過ES細胞對MT基因和對tPA基因
的研究,在分子和個體水平上使人們對這些基因有了更深的
了解,同時,也充分顯示了ES細胞途徑的潛力所在。宋震濤
等〔11〕在1993年,用囊胚注射法將小鼠胚胎多能幹細胞—
CCE細胞注射到發育3.5 d的昆明和C57BL/6J小鼠受體囊
胚腔內,經假孕鼠借腹懷胎,獲3隻CCE細胞毛色嵌合鼠。
實驗共注射胚胎654個,經培養其恢復成活率73.8%,胚胎
移植後,假母受孕率及產仔率分別為32.9%和53%。在所
獲3隻嵌合鼠中,2隻為CCE—昆明毛色嵌合鼠,1隻為
CCE—C57BL/6J毛色嵌合鼠,這是國內首次利用胚胎多能
幹細胞獲得嵌合鼠。同年,Wood等人報道了用ES細胞
R—1進行囊胚注射,注射後移胚631個,出生250隻(40%),
嵌合體95隻(15%)。Stewart等(1994)〔12〕按照Resnick〔13〕
的方法從7枚9dpc129/SV系小鼠胚胎PGCs分離並建立了
3個EG細胞系。待其觀察到幹細胞克隆時,將其轉移到無
bFGF的PMEF上維持培養。對傳至4代的EG細胞系做核
型分析及嵌合體實驗,3個細胞系核型分別為40∶XY(EG1)、
40∶XX(EG3)、39∶XO(EG2)。將PGCs注射C57BL/6J小鼠
囊胚99枚,出生仔鼠62隻,其中20隻為皮毛嵌合體,嵌合
面積10%~90%,嵌合體正常。12隻(5♀7♂)嵌合體小鼠
與C57BL/6J小鼠交配,出生539隻後代,其中6隻(4♀2♂)
嵌合體小鼠的169隻後代為刺鼠型,證明這6隻小鼠為生殖
系嵌合體。研究結果證實EG細胞與ES細胞同樣具有形成
功能性配子和實現生殖系嵌合,產生嵌合體的能力。
1996年,吳白燕等〔14〕用北京大學生命科學學院所建立
的ES細胞系MESPU13通過囊胚顯微注射到C57BL/6J小
鼠的囊胚中構建嵌合體小鼠。在注射了2~9個ES細胞的
136個囊胚中,127個囊胚(93%)經過3 h的培養後重新出現
囊胚腔。當把119個恢復的囊胚移植到假孕雌鼠的子宮時,
獲得63隻(52.9%)出生鼠。在59隻存活到可以判定毛色
階段的小鼠中,有21隻(35.6%)被判定為嵌合鼠,顯示了該
ES細胞系具有較高的嵌合能力。同年,何維等〔15〕採用源於
Swiss小鼠遠交群的昆明品系小鼠囊胚成功建成了三個遠交
系小鼠ES細胞系,核型正常率均達到70%以上,自第八代
起分批凍存。復甦後,培養至第12代,消化成單細胞,通過
囊胚顯微注射,將其注射到615品系小鼠胚胎獲得嵌合體,
這是首例用遠交系小鼠胚胎幹細胞系培育成功嵌合體小鼠。
在1999年,陳偉勝等〔16〕選用近交系C57BL/6J及遠交系
KMW和ICR為受體胚胎提供者,分別通過囊胚注射法和
8—細胞期桑葚胚注射法進行了嵌合體構建實驗。共獲得嵌
合體81隻,經毛色分析確定在進行測交的42隻嵌合體中有
19隻是種系傳遞者,為國內小鼠ES細胞種系嵌合體的首例
報道。通過對小鼠ES細胞囊胚注射後形成嵌合體,進一步
培育出整合於生殖系的小鼠品系。囊胚注射法製作嵌合體
這一套技術路線在制備基因剔除小鼠時已成功運用,該技
的優點是可以對每個單克隆細胞進行分析,並由此培育出
克隆細胞發育出來的小鼠。由於首先在ES細胞水平進行
操作,獲得表達目的基因的單克隆細胞,經囊胚顯微注射得
到表達目的基因的嵌合體小鼠,再由此培育出純系小鼠,所
以在整個過程中ES細胞的分化潛能直接關繫到小鼠的正常
發育。姚玉成等(2001)〔17〕為了探討小鼠ES細胞參與早期
胚胎發育的潛能,以neo基因作為目的基因進行了ES細胞
的轉染,經G418的篩選,獲得表達neo基因的單克隆細胞,
然後進行囊胚注射60枚受體小鼠囊胚,恢復培養後移植到5
只假孕小鼠,得到了攜帶有neo基因的嵌合體小鼠,通過對
嵌合體小鼠各組織PCR分析發現,neo基因可以在皮膚、肝
臟、血液等多種組織中存在。
除了種內嵌合體,小鼠種間嵌合體早已有成功的報道。
雖然大小鼠嵌合胚、田鼠和小鼠嵌合胚能成功地附植,但沒
有成活的嵌合體出生。Rossant用ICM注入法,首次獲得了
小鼠種間嵌合體(Mus musculus←→Mus caroli)。在嵌合體內
沒有發現細胞系之間的選擇性排斥關系。用GPI酶分析,顯
示骨骼肌中有雜交的GPI酶,說明兩種不同來源的成肌細胞
融合為正常功能的肌纖維。正常小鼠胚胎與多倍體胚胎、雌
核發育胚胎所製作的聚合胚也分別被用來進行了大量嵌合
體的研究〔18~20〕:正常胚胎在細胞鬆弛素B作用下,染色體
加倍形成三倍體或四倍體胚胎。這種多倍體胚胎發育遲緩、
組織畸形,即使出生也不能存活。與正常胚胎嵌合後,3n或
n細胞雖參與各種組織形成,但仍影響正常胚胎發育。Lu
1980)和Azuma(1991)分別獲得了成活的4n←→2n、3n←→
n嵌合小鼠,並具有正常生殖能力,繁殖實驗證明,所有的後
代均為2n細胞來源。這種多倍體胚胎嵌合體在研究性染色
體及劑量補償作用、多倍染色體對個體發育的影響方面具有
重要價值,是研究染色體功能、基因平衡、基因定位的良好模
型。單性生殖胚胎(Parthenogenetic Embryo)是將受精卵中
的雄原核或雌原核挑去,在用細胞鬆弛素B使其染色體加
倍,從而得到正常胚胎數目的染色體。由於XY型為致死
型,因而這種加倍後的胚胎皆為XX型。這種雌核發育胚胎
在附植後很快死亡。Stevens(1978)〔18〕將1枚正常受精的小
鼠胚胎與2枚孤雌發育的桑葚胚,去除透明帶後在Whitten
氏液中聚合培養,形成3胚聚合的胚胎;將55枚3胚聚合胚
移植至6隻假孕雌鼠,產出兩窩共7隻仔鼠,經檢測其中1
雌性和1雄性仔鼠為嵌合體。證明源於孤雌胚的細胞能存
活並參與形成正常的器官。雌核發育胚胎能廣泛形成嵌合
體各種組織。但成活個體在體型上均小於正常小鼠。與多
倍體胚胎不同,雌核發育胚胎能參與嵌合體生殖系形成,並
產生有功能的卵子。Market等( 1978 )〔21〕和Petters
1980)〔22〕還得到了由3個或4個胚胎聚合而成的6個雙親
和8個雙親的小鼠嵌合體及其後代,不過這種6個以上雙親
的嵌合小鼠,選擇遺傳標記更加困難。這類嵌合體對研究
巨型」胚胎的生長和調節等具有一定的價值。
上述研究結果表明,雖然迄今還沒有完全由孤雌胚發育
而成的後代,但因孤雌胚細胞可參與形成各種組織包括生殖
細胞,故可能通過缺少父源遺傳結構的生殖系僅將母源的遺
傳信息傳給後代。換句話說,通過嵌合體技術可能產生孤雌
發育的個體。因此,有必要深入研究。
2.2 其它哺乳動物嵌合體的研究進展
由於家畜胚胎的發育特點,體外培養條件與小鼠相比差
異較大,有關家畜嵌合體方面的報道比較少。
.2.1 羊:Pighills曾首先嘗試用桑葚胚聚合法製作嵌合體
綿羊。最初用ICM注入法製作嵌合體的成功率不及3%。
utler(1985)發現ICM注入法同樣得到較高比例的嵌合體綿
羊。且在製作聚合胚時發現,當細胞數量比正常胚胎多時則
易形成嵌合體,而細胞數量少於正常胚胎時則產生嵌合體的
比例明顯下降,其原因可能是細胞數量多時,參與ICM的機
會增加。1998年有人成功地報道了把從山羊胎兒採取的原
始生殖細胞在STO細胞上繼代培養,這些細胞從形態特徵,
對AKP陽性的反應及在體外分化成各種細胞的全能性來
看,確定是山羊EG細胞。但是,關於嵌合體形成沒有得到
驗證。嵌合體顯示對兩個細胞系的免疫耐受性,這同樣適用
於種間嵌合體,因而種間嵌合體成為母體與胎兒免疫識別機
制及研究妊娠失敗的良好模型。Fehilly(1984)分別用聚合法
和注射法製作綿山羊嵌合胚,然後移植到與受體胚泡同種的
假孕受體,結果綿羊和山羊能分別產下正常的種間嵌合體。
盡管雌性綿山羊等嵌合體能生產正常綿羊胎兒,但卻不能懷
孕山羊和雜交種胎兒。其失敗的原因可能是一種母體的細
胞毒性抗體對種特異性抗原的反應引起的。
2.2.2 牛:牛嵌合體的報道也有幾例。最初用ICM注入法
製作種間嵌合體(Bos indicus←→Bos taurus),盡管沒有產生
外觀可見的嵌合牛,但生化檢測表明內臟器官存在嵌合
性〔23〕。Brem(1984)〔24〕獲得一頭嵌合牛,此牛是由4個半胚
組成的聚合胚發育而成的,與綿羊嵌合體的發現相同,可能
聚合胚中細胞數量越多時,不同細胞系參與形成ICM的機
率相應提高。Picard(1990)〔25〕將8 d ICM與5.5 d桑葚胚聚
合後得到5頭嵌合牛,說明8 d ICM仍能參入嵌合牛中ICM
的形成,同時發現10 d的ICM與5.5 d胚胎能形成聚合胚,
但不能參與成體發育。Cibelli〔26〕利用轉基因技術得到了生
殖系嵌合牛,在1998年,用顯微注射法把將囊胚建立的細胞
系導入基因後的基因轉移細胞系注入受體胚,製作了轉基因
嵌合體牛。另外,基因導入後的胎兒成纖維細胞,注入去核
的卵母細胞,所形成的囊胚建立起的轉基因細胞系,同樣具
有形成嵌合體的能力。結果表明,判定這些細胞株為牛ES
細胞。但是,牛生殖系製作嵌合體未見報道。
2.2.3 豬:在1990~1991年豬ES細胞的建立有許多報道,
但是,所有形式的判定標准,形態特徵,未能測出在體外的分
化能力,胚體形成或者細胞標記物臘丁18(細胞分化標記
物),沒做獲得的細胞嵌合體形成能力的實驗。在1992年,
Kashiwazeki採用ICM注入法將白化品系ICM注入褐色被
毛受體囊胚中,產生了2頭嵌合豬。Mueller等(1999)自30
個25~28 dpc WAPhGH轉基因豬胎兒生殖嵴分離PGCs,將
其注射到209枚6日齡豬囊胚,重組胚移入11頭受體豬,用
轉基因標志作PCR試驗,分析49個胎兒和8頭仔豬PGCs
是否參與嵌合,檢測結果32個胎兒呈現5/12種組織嵌合,8
頭仔豬為皮膚基因轉染,其中4頭表現皮色嵌合。
3 嵌合體的製作方法
迄今為止,製作嵌合體的方法有兩種,即聚合法和囊胚
注射法,可根據實驗目的而選用。
3.1 聚合法〔27~34〕
聚合法是用胚梁將除去透明帶的兩枚8細胞至桑葚期
胚胎或來自兩個胚胎的分裂球與ES細胞聚合在一起,稱為
聚合法。聚合法適用於同種,發育階段處於同步或者差距不
大的胚胎。其方法是在2個8細胞胚胎中間夾幾個ES細
胞;1993年,Wood等〔27〕人報告了一種簡單、有效的產生嵌合
鼠(包括種系嵌合鼠)的方法,該方法僅需要將ES細胞同8
細胞時期的胚胎進行簡單的共培養即可完成。1997年,何維
等〔28〕以MC15為供體ES細胞,用KMW品系小鼠8細胞期
的胚胎為受體胚胎,採用聚合法共植入8細胞期胚胎35個,
產仔18隻,產仔率51.4%,獲得嵌合鼠2隻。用聚合法製作
嵌合體,操作簡便,不需要特殊的儀器設備,是製作嵌合胚和
嵌合體動物的有效方法。
3.2 囊胚注射法〔25~44〕
囊胚注射法技術難度較大,但適用范圍較廣,可用於種
·3·《上海畜牧獸醫通訊》 2008年第3期
或種間,供體和受體的發育階段可同步,也可以是不同步
,它還適用於不能去透明帶的動物,如兔等。該法是將幾
個ES細胞(一般5~15個左右)注入囊胚腔中。但囊胚注射
法需要購買昂貴的儀器,而且技術難度較大,需要一定的時
間才能掌握。
4 嵌合體鑒定〔45〕
嵌合體鑒定也稱嵌合體標記(Markers of chimera)或嵌合
體分析(Analysis of chimea),通過鑒定所選擇的不同細胞系
的遺傳標志在嵌合體中的出現,即可判定是否不同培養細胞
參與了嵌合胚的發育。迄今所用的嵌合體鑒定方法可分為
人工標記和遺傳標記兩種方法。
4.1 人工標記
此種方法多用於蛙類嵌合體的鑒別,哺乳動物中較少應
用。其最典型的標記物為活體染色色素和油滴。此外使用
的標記物還有0.1~0.2μM的珠狀物,放射性物質、熒光膠
質金、黑色素顆粒、山葵過氧化物等。
4.2 遺傳標記
它是根據嵌合體在嵌合前兩個胚胎本身所具有的特性
作為標記來進行鑒定,如由遺傳所決定的黑色素以及通過生
物化學、染色體、細胞學、組織學、組織化學、免疫組織化學等
方法能夠鑒別的物質等。為了檢測ES細胞的嵌合程度,目
前通常是採用兩個遺傳標記。
.2.1 色素分析法:這是最簡單且直觀的分析方法,一般選
擇皮膚顏色、毛色差異的動物胚胎來製作嵌合體。由於供體
ES細胞與受體胚胎來源品系有明顯的毛色區別,故可根據
移植後代是否具有ES細胞來源的毛色明確判定嵌合體。嵌
合體的毛色嵌合程度按ES細胞來源毛皮所佔大致比例估
算,結果以百分率表示,外觀無受體品系毛色摻雜的嵌合體
毛色嵌合程度計為100%。在嵌合體構建實驗中,通常以嵌
合體的毛色嵌合程度推測內臟(尤其是種系)的嵌合程度。
在毛色嵌合程度較高的嵌合體中,種系嵌合的發生及種系嵌
合程度似乎是隨機的,與毛色嵌合程度無明顯的相關性,這
說明毛色嵌合程度與臟器嵌合程度並不完全平行。因此,有
必要對毛色嵌合程度較低的嵌合體也進行測交分析。
.2.2 生物化學法:主要通過測定嵌合體血液或組織中的
特定酶(同工酶),如磷酸葡萄糖異構酶(GPI)、磷酸葡萄糖變
位酶(PGM-1)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-PGDi)等,也可
以根據細胞抗原、血清運鐵蛋白和白蛋白類型來確定是否有
親緣關系,以鑒定是否是嵌合體。GPI同工酶分析方法相當
靈敏,其靈敏度約為2%〔46〕,用很微量的樣品就可以達到分
析目的。雖然目前已有了一些更為靈敏的方法,如使用PCR
法〔47〕或利用小衛星DNA〔48〕的方法。但由於GPI方法的快
速、簡便和價格適中的優點,仍是目前廣泛使用的方法。GPI
廣泛存在於動物體內的所有組織細胞內,非常穩定,主要催
化六磷酸葡萄糖和六磷酸果糖的互變反應。在小鼠中,GPI
-1基因位於第7染色體上,絕大多數近交系小鼠的基因型
為純合的GPI-1a或GPI-1b,a和b為兩個共顯性的等位
基因。在進行電泳時,根據等位基因a和b的不同,可以得
到A型和B型的條帶〔49〕。通常在構建嵌合體鼠的實驗中,
選擇帶有與供體細胞不同的等位基因的胚胎作為受體,有利
於對嵌合鼠體內組織器官中的嵌合情況進行分析。
5 嵌合體的應用前景
對哺乳動物基因組進行人工改造,最終是為了獲得帶有
人們所期望的目的性狀的轉基因動物,這是哺乳動物遺傳工
程研究的一項重大課題。哺乳動物發育的基因調控在過去
由於種種原因(如哺乳動物突變種很少,生命周期長,胚胎是
在母體子宮中發育,數量少等)難以有很大進展。隨著ES細
胞的建立,可以在培養瓶中進行突變和篩選,並且篩選出來
的突變細胞株可以經受反復的凍存和復甦,還可以進行嵌合
體分析和分子遺傳學分析。或運用體細胞遺傳操作技術,在
細胞水平上對帶有遺傳修飾的轉化ES細胞進行有效的篩
選,最終使目的基因整合到生殖細胞中,並傳入後代成為種
系嵌合體。由於嵌合體動物在胚胎發育過程中的特殊性,它
不僅是遺傳工程的重要組成部分,而且可以作為發育生物
學、細胞生物學、胚胎學、免疫學、醫學、畜牧學等方面均具有
廣泛應用價值。它既為這些研究提供特殊的動物模型,也可
用於人工創造特殊的動物。
5.1 研究染色體畸變
在對許多遺傳病的研究中,發現許多體細胞核的染色體
是非整倍體(Aneuploid),其中單體和三體(Trisome,Ts)最常
見。非整倍體←→2n嵌合體是研究染色體功能、基因平衡、
基因定位的良好模型。在哺乳動物含有非整倍體的個體往
往伴有嚴重的遺傳障礙,一般不能存活。目前人們藉助EC
細胞或生化手段已經構建出含有單體或三體染色體的小鼠
嵌合體。
5.2 研究基因突變
在20世紀80年代獲得小鼠ES細胞以來,ES細胞在基
因工程領域受到普遍重視,將ES細胞注入受體囊胚是其完
成個體發育的唯一途徑。通過基因的同源重組技術可將突
變基因導入ES細胞,當攜帶突變基因的ES細胞參與嵌合體
生殖系組成後,即可在繁殖後代中研究突變基因的作用。
Goldstein等(1979)證明EC細胞具有高度親合低密度脂蛋白
的受體,並進一步准備誘發低密度脂蛋白受體缺損株,把這
種細胞注射到囊胚中,從而有望獲得與人類高膽固醇血管症
相同的動物模型。1987年Hooper等〔50〕人(英國愛丁堡大
學)以及同年Kuehn(英國劍橋大學)分別從ES細胞中通過
自發突變或誘發突變得到了HPRT-的ES細胞,並通過嵌
合體和嵌合體的繁育得到了HPRT缺陷型的小鼠模型,為研
究人類遺傳病Lesch-Nyhan綜合征(是由於不能合成雌黃
嘌呤轉磷酸核糖激酶而引起)提供了良好的遺傳研究模型。
5.3 轉基因動物生產方面的應用
從20世紀60年代開始,經過體細胞遺傳學家和病毒學
家的長期努力,已經建立起許多成熟的技術可以將外源基因
導入體外培養的細胞並得到穩定表達的轉化細胞系。但是,
由已經分化的在體外培養的體細胞無法產生哺乳動物,而哺
乳動物的受精卵或早期胚胎細胞又受到數量和可培育時間
與條件的限制也無法使用這些成功的方法。ES細胞系的建
立將體細胞轉化技術和嵌合體技術結合起來,建立了轉基因
動物的新途徑。Gosseler(1986)、Tokunaga等(1992)利用磷
酸鈣方法將neo基因導入ES細胞,並獲得了能穩定傳遞neo
基因的轉基因小鼠,顯示用ES細胞作為轉基因工具與DNA
原核注入法、逆轉錄酶病毒感染方法相比具有一定的優越
性。主要是可以在細胞水平獲得明確的轉入基因是否整合
或表達,再由這種明確的細胞發育成個體,避免了對子代小
鼠既要進行DNA水平檢測篩選,又要進行RNA或蛋白水平
檢測篩選,從中才能獲得轉基因小鼠的過程,直接就可以獲
得整合或表達目的基因的嵌合體小鼠,爾後通過培育獲得轉
基因小鼠,這為將來進一步探討該技術的廣泛應用奠定了基礎。
5.4 嵌合體在胚胎種間移植方面的應用前景
胚胎種間移植,對保存瀕臨滅亡的動物、克服雜交不育
等方面具有重要意義,但是由於種特異性抗原的相互作用關
系使胚胎種間移植受到極大限制。迄今有關胚胎種間移植
獲得成功的報道有:家牛與水牛的交互移植、馬與驢的交互
移植、歐洲盤羊移植到家綿羊、野牛胚胎移植到Holstein母
牛、斑馬胚胎移植到馬等。雜交胚胎細胞能參與正常胚胎發
育,其原因可能是因為胚胎滋胚層與假孕母體屬於同一種
類,從而屏蔽母體的種特異性抗原對異種胚胎的ICM的免
疫識別,使異種胚胎能夠存活。在製作的綿山羊嵌合體中,
綿羊和山羊能分別產下山羊和綿羊羔,如果這種方法在瀕危
動物種類上有可行性的話,有可能為「挽救」瀕危動物開辟了一
·4·《上海畜牧獸醫通訊》 2008年第3期
全新的途徑,可望在實際應用中不斷擴大珍稀動物數量。
5.5 嵌合體在繁育純系動物中的發展前景
在哺乳動物純系繁育過程中,培育良種的時間是重要的
因素。例如,培育純系小鼠需要進行20代近交繁殖(約5年
時間),並且最多產生98%的純合體,此外由於近交衰退導致
生命力和繁殖力降低,因而大多數動物近交繁殖均告失敗。
arkert等(1977)報道用顯微外科方法製作雌核發育胚胎以
來,為繁育純系動物提供了最簡捷的方法。Stevens、
ndregg、Paldi分別獲得了含有雌核發育胚胎的嵌合小鼠,並
得到了含生殖細胞嵌合的個體。這種個體的卵巢有雌核發
育胚胎來源的完全一致的卵子,從而大大縮短了培育純系小
鼠的時間(約3個星期)。
6 目前研究存在的問題
如上所述,嵌合體在發生學、醫學、產業的各個領域有著
無限廣闊的利用前景。但目前需研究和解決的問題有:
高效培育嵌合體的方法,特別是通過種間或各種細胞的
組合獲得嵌合體;培育各組織、器官的特異性部分嵌合體個
體;消除種間的胚胎著床後發育與受體間的免疫排斥性;研
究更適合的標記。
㈥ 轉基因技術和基因敲除技術的主要區別有哪些
轉基因技術是將人工分離和修飾過的基因導入到生物體基因組中，由於導入基因的表達，引起生物體的性悄悔狀的可遺傳的修飾，這一技術稱神運做之為轉基因技術（Transgenic
technology）。人們常說的"遺傳工程"、"基因工程"、"遺傳轉化"均為轉基因的同義詞。經轉基因技術修飾的生物體在媒體上常被稱為"遺傳修飾過的生物體"（Genetically
modified organism，簡稱GMO）。
Genetically
Modified--轉基因，簡稱GM。是指運用科學手段從某種生物中提取所需要的基因，將其轉入另一種生物中，使與另一種生物的基因進行重組，從而產生特定的具有變異遺傳性狀的物質。利用轉基因技術可以改變動植物性狀，培育新品種。也可以利用其它生物體培育出期望的生物製品，用於醫葯、食品等方面。
基因敲除技術是20世紀80年代發展起來的，是建立在基因同源重組技術基礎以及胚胎幹細胞技術基礎上的一種新分子生物學技術。所謂胚胎幹細胞(EmbryonicStem
cell，ES)是從著床前胚胎(孕3-5天)分離出的內細胞團(Inner
cellmass，ICM)細胞，它具有向各種組織細胞分化的多分化潛能，能在體外培養並保留發育的全能性。在體外進行遺傳操作後，將它重新植回小鼠胚胎，它能發育成胚胎的各種組織。而基因同源重組是指當外源DNA片段大且與宿主基因片段同源性強者並互補結合時，游衡結合區的任何部分都有與宿主的相應片段發生交換(即重組)的可能，這種重組稱為同源重組。
基因敲除就是通過同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的的一種技術。它克服了隨機整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質的方法。這項技術的誕生可以說是分子生物學技術上繼轉基因技術後的又一革命。尤其是條件性、誘導性基因打靶系統的建立，使得對基因靶位時間和空間上的操作更加明確、效果更加精確、可靠，它的發展將為發育生物學、分子遺傳學、免疫學及醫學等學科提供了一個全新的、強有力的研究、治療手段，具有廣泛的應用前景和商業價值。現在基因敲除技術主要應用於動物模型的建立，而最成熟的實驗動物是小鼠，對於大型哺乳動物的基因敲除模型還處於探索階段。
㈦ 幹細胞培養的幾個概念
金仁桃 章孝榮（ 安徽農業大學畜牧水產學院 合肥230036 ） �� 自Evans和Kaufman(1981)從延遲著床的胚胎中分離出小鼠胚胎幹細胞（embryonic stem cells, ES細胞）以來，ES細胞一直備受人們的關注��〔1〕�。1998年，由基隆公司資助的湯姆森研究小組在《科學》雜志上發表了關於人的ES細胞建立等一系列工作之後，基隆公司的股票更是狂升了6倍；1999年、2000年，幹細胞研究兩度被美國《科學》雜志推銷彎舉為21世紀最重要的研究領域；1999年，美國《科學》雜志還將幹細胞研究評為當年世界十大科學成就之首。由此足以顯示幹細胞的魅力，而幹細胞之所以如此吸引人們的注意，主要是因為幹細胞是一種全能性的細胞，可以自發分化形成多細胞結構，即胚胎小體（embryonic body，EB）。EB含外胚層、內胚層、中胚層三個胚層，胚胎小體繼續分化可以形成多種細胞類型，包括血細胞、內皮細胞、肌細胞及神經元等。另外ES細胞在動物克隆生產、轉基因動物生產、疾病研究模型及葯物生產等諸多方面有著誘人的前景。本文主要就ES細胞在克隆動物生產的應用加以闡述。 �1 ES細胞克隆的理論依據 � ES細胞是從早期胚胎內細胞團（inner cell mass, ICM）和附植後原始生殖細胞（Primordial germ cells, PGCs）分離出來的一種細胞，它具有全能性(totipotenty)或多能性(pluripotency)，可以發育為任何一種組織或器官的前體細胞，再由該前體細胞發育成功能細胞。正常的ES細胞可分化為兩個子代幹細胞，也可以分化一個子代幹細胞和一個功能細胞。 這種分化是由幹細胞內源性調控（主要是受幹細胞內結構蛋白和多肽因子調控）和外源性調控（主要是由周圍組織細胞及細胞外基質等調控）所影響。而最近Amato Giaccia 發現氧含量操縱幹細胞的分化，為人們進一步利用幹細胞提供了有益的提示。另一個重要發現就是Andrew E. Wurmser等發現成熟組織的幹細胞僅僅是通過與現存細胞融合而形成其他組織，而非製造新細胞，那麼對成熟組織的幹細胞利用，將趨於更加謹慎��〔2〕�。這也更加提升了ES細胞的作用。 �ES細胞另外一個特點是它像正常的體細胞一樣可以在體外進行增殖、克隆、冷凍、保存而保持不分化。這樣就可以為人們提供大量的可利用的ES細胞。如每隻實驗動物一次可提供5000～6500個PGCs，然後在體外可培養成類ES細胞。現在人們可將ES細胞體外培養傳至40～60代而不分化，而這樣大量的細胞就為我們利用它奠定了基礎。 �ES細胞具有可操作性。在體外人們可以對其進行遺傳操作選擇，如轉基因、基因打靶、配合基因誘捕等一系列技術，再結合核移植技術，生產出人們所希望的動物。 �2 ES細胞克隆的可行性 � 克隆技術的原理是將供體細胞核移入去核的卵母細胞中，通過激活使其重新編程發育，從而產生新個體。目前體細胞克隆相對於ES細胞來說，存在有兩個問題：一是體細胞在體外培養易變異。為避免這一缺點，目前較多使用新分離或傳代較少的細胞。二是關於選用何部位的細胞。目前人們已使用了乳腺細胞、卵丘細胞、輸卵管細胞、皮膚成纖維細胞、子宮上皮細胞、肌肉細胞、支持細胞、肝臟細胞、耳成纖維細胞、初乳中乳腺上皮細胞等。但到目前為止，還沒有發現何種體細胞是最適合於核移植的，所用作核移植的細胞有的來自於胎兒，一般是成纖維細胞，也有來源於成體動物的。這主要是因為雖然從理論上講，機體中的每一個細胞都是從受精卵分裂分化而來，而在機體內通過半保留復制方式，DNA信息被完整的傳遞下來，但從一個受精卵到機體的億萬個細胞，有些細胞的個別基因可能發生不可逆的丟失或重排，使用這樣的細胞作核供體，就無法保證信息的完整性，這也可能是目前細胞克隆中普遍存在的克隆效率低，出生後的死亡或異常的原因之一。ES細胞的核移植雖然也同樣需要在去核的卵細胞內重新編程，但是相對於體細胞克隆效率低、妊娠期間易流產來說，ES細胞的克隆效率要高得多，而且ES細胞的重新編程要容易得多。這也正如人們所假設的目前存活的克隆頌世個體所用的供體核大多是源於動物組織的成體幹細胞的核而非最終分化的細胞的核〔3〕�。 �隨著對ES細胞研究的深入，人們已經在多種動物得到了ES細胞核移植的後代。Teruhiko Wakayama等採用長期傳代虧櫻悶（30代以上）的小鼠ES細胞克隆出了31隻小鼠，其中14隻存活〔4〕�； Campbell （1996、1995）分別將綿羊、山羊的類ES注射入去核卵母細胞，獲重構胚，經核移植有活羊出生��〔5〕�。Michelle Sims和N．L First（1993）將培養6～101d牛的ICM細胞核移植到去核卵母細胞，卵裂率為70%，囊胚率為24%，經胚胎移植有13頭妊娠，出生了4頭牛犢��〔6〕�； Stice（1996）將牛的類ES細胞進行核移植，得到重構胚並移入受體牛子宮，發育至45天��〔7〕�；Cibelli利用轉基因技術得到生殖系嵌合的牛；Shim（1997）和Piedrahita（1998），利用豬的PGCs建立多能幹細胞系，並得到嵌合體豬。 �3 ES細胞克隆的意義 � ES細胞的核移植最基本的意義就在於，如果通過核移植能夠產生完整的後代，而且具有和親代一樣的遺傳特性，那麼它就恰恰證實了ES細胞是具有全能性的一種細胞。ES細胞克隆和體細胞克隆一樣，通過得到的大量具有親代一樣遺傳特性的供體細胞，再利用核移植技術，可以提高優秀個體的繁殖效率，迅速擴充優秀個體的種群，為畜牧生產作出極大的貢獻。 對於珍稀品種或瀕臨滅絕的物種來說，該項技術提供了一種可以挽救珍稀或瀕危物種的機會。利用ES細胞水平上的基因操作相對於受精卵水平上的轉基因更加容易，可以得出人們所需求的轉基因動物，然後再運用核移植技術，即可得到大量的具有此基因表達的個體，同時這也是創造新物種的絕好機會。由於ES細胞具有自發融合的性質，由此可在細胞水平上操作， 完成新物種的創造，而這種新物種可能是自然交配無法得到的。人們曾將牛、綿羊及人的GH基因先後導入小鼠基因組，得到的轉基因小鼠在快速生長期生長速度為對照組的4倍。另外，利用ES細胞核移植還可以一次得到大量同質的後代，為生物學研究提供了很好的模型。 4 目前存在的問題 � 由於ES細胞的發現至今也只有20多年的歷史，因此人們對它的了解有限，限制了對它的利用，目前就幹細胞的核移植來說，主要存在以下問題： �4.1 核移植技術本身還有許多理論有待完善，目前核移植的效率還很低，而對於像重構胚的發育與著床，核質互作與協調等理論還需要人們作進一步的深入研究。 �4.2 ES細胞建系的技術還不成熟。目前廣泛使用的飼養層是小鼠成纖維細胞無限系（STO）或小鼠胚胎成纖維細胞（Primary Mouse Embryo Firbroblasts, PMEF）制備而成，主要是利用其細胞分泌的生長因子FGF和抑制細胞分化的因子LIF共同作用，保持幹細胞在體外克隆而不分化，然後加入一些其它的物質。即便如此，目前其建系的效率仍不是很高，特別在國內，能夠得到大家畜的類ES的都不是很多，而且得到傳代次數較少。人們目前嘗試了使用其它的培養基，如大鼠成纖維細胞條件培養基、山羊輸卵管上皮培養基、綿羊輸卵管上皮培養基、綿羊子宮上皮培養基、山羊子宮上皮培養基、牛的顆粒細胞培養基、牛子宮成纖維細胞培養基、胎牛的睾丸、腎、肝成纖維細胞培養基。Meinecke Tillmann(1996)發現胎牛的成纖維細胞對綿羊的ICM和ES細胞增殖有利。而Piedrahitat等採用豬胎兒成纖維細胞和上皮細胞作為飼養層，結果失敗。Strojek等（1990）認為，初步培養囊胚時，使用豬子宮成纖維細胞飼養層可以促進囊胚的貼壁和ICM克隆的形成。此時若用STO作飼養層，盡管豬囊胚可以附著在STO上，但ICM不增殖，但以後的傳代只需要STO進行。可見對於飼養層的選擇，目前仍有待人們的進一步發現。對於ES細胞的建系，人們還發現，ES細胞必須保持一定的濃度，這是因為ES細胞能夠從培養基中攝取營養的同時，也要向培養基中排出自己的分泌和代謝產物和其它一些物質，這些分泌物中，有促進細胞生長的物質，有人就稱之為促克隆生長物質。 �ES細胞應用范圍是很廣的，對於核移植的應用僅是其一部分。例如，利用ES細胞的全能性，進行定向誘導分化，再在細胞水平上進行葯物的測試，可以極大提高葯物的檢測進度；利用ES細胞可建立人類遺傳病研究的動物模型等。可以說，對於幹細胞的研究方興未艾。 � 參考文獻 �〔1〕Evans M J, Kaufman M H. Establishment in Culture of Pluripotential Cells from mouse embryos〔J〕. Nature, 1981, 292(9): 154～156 �〔2〕Andrew E. Wurmser, Fred H.Gage. Cell fusion causes confusion〔J〕. Nature, 2002，416,485～491 �〔3〕Konrad Hochedlinger, Rudolf Jaenisch. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature B and T doner cells〔J〕. Nature, 2002,415,1035～1038 �〔4〕Wakayama T, Rodriguez I, Perry AC, et al. Mice cloned from embryonic stem cells〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA, 1990，96(26):14984～14989 �〔5〕Campbell.K.H.S, Mc whiir,J, Riechie.W.A, et al. Sheep cloned by nuclear transfer from a cuctured cell line〔J〕. Natrue,1996,38(7):64～66 �〔6〕Sims M.M, FirsA NI. Proction of fetuses from totipotent cultured bovine inner cell mass cells〔J〕. Theriogenology, 1993,39:313 �〔7〕Stice SL, strolchonko NS.Pluriopotent bovine embryonic cell lines directed embryonic development following nuclear transfer biology of Reproction〔J〕. Theriogenology, 1996,54:100～110