❶ qpcr是否一定要有生物學重復
要的。
首先qPCR不是很准，特別是對於新手來說。
其次，三個平燃纖行以上才具有統計學皮首仿意義，三個生物學重復以上才具有生物學意義。（芹亂發表文章時需要）
❷ WGBS測序深度和生物學重復知多少
轉錄水平的研究中設置多少生物學重復和測序深度比較合適？
生物學重復可以定義為使用來自不同抽提的樣本進行實驗，例如，上圖中同一來源獨立制備的3隻老鼠。對每一個樣本制備來說，只要抽提之後的步驟是獨立進行的，那麼分析測量就是獨立的。雖然對於特定的基因，生物學重復的變異大於技術重復，但是由每一個獨立樣本引入的偏差通過取每一個測量的平均值幾乎消除，因此生物學重復的實驗結果易於廣泛概括。通常，生物學重復用於概括性結論的驗證，技術重復用於減少這些結論的變異性。這也是為啥高分文章需要更多生物學重復。具體兩個例子說明下設置生物學重復的重要性：
案例1：Sequencingtechnology does not eliminate biological variability.
圖說明：A plot of the expression for two genes COX4NB (left column, pink)and RASGRP1 (right column, blue) as measured with sequencing (top row) andmicroarrays (bottom row) versus biological sample. Mean-centered measurementsfrom the two studies are plotted as circles and triangles, respectively.
從圖上看，測序和技術的結果一致性很好（其實測序和晶元技術各有優劣勢，以後有機會再說）。COX4NB在生物學重復樣本中表達差異非常小；但在同樣情況下，RASGRP1的生物學差異很大。這結果意味著：不同實驗組間COX4NB的表達水平的變化存在研究意義；而同樣情況下RASGRP1的檢測數據可能不能說明問題。通俗點說，如果癌和癌旁的差異表達是「COX4NB」基因表達形式，那麼很容易重復做出結果，而如果三對三篩選出「RASGRP1」的基因表達形式，那麼你擴大樣本驗證就會出現和前期篩選不一致的結果。
案例2：GEO資料庫下載兩組數據的分析
下圖是兩組數據，癌（黃線左側）和正常組織（黃線右側）篩選的部分差異基因。如果選擇3個重復如上方箭頭標出的，這個基因就沒有差異。如果選擇4個重復如下方箭頭標出的，這個基因就出現相反的變化水平。
作圖軟體源自微信公眾號《實驗萬事屋》介紹的GENE-E
說了這么多，大家都知道實驗設計中重復越多越好，但是具體多少比較合適，下面幾篇文獻供參考：
文獻A. Howmany biological replicates are needed in an RNA-seq experiment and whichdifferential expression tool should you use?
數據來源：RNA was sequenced from 48 biological replicate samples ofSaccharomyces cerevisiae（釀酒酵母）in eachof two well-studied experimental conditions; wild-type (WT) and a Δsnf2mutant. Quality control and data processing steps rejectseveral replicates from each condition resulting in 42 WT and 44 Δsnf2biological replicates of 「clean」 data totaling ∼889M aligned reads.
這篇文章主要提出了2個問題：
1. 在RNA-Seq實驗中需要多少生物學重復提高差異基因鑒定工作的准確性和靈敏度？
參考答案是：至少6個重復以上，12個以上更佳。至於你糾結6個重復怎麼來的，請看下圖:
2. 在一定重復數量的RNA-Seq中，用哪種統計演算法或工具更合適？
參考答案是：.如果每組少於12個重復，相對的edgeR更優秀一些，如果超過12個重復，DESeq更佳。文章使用的統計演算法如下表：
另外值得一提的是，這篇文章中的模式生物是釀酒酵母。我「網路」（別鄙視，沒辦法用google）了下，釀酒酵母菌屬於酵母菌科，是一種單細胞生物，成卵圓形或球型，繁殖方式為出芽繁殖，孢子繁殖，接合繁殖三種，形態簡單但生理復雜，工業上用於釀酒。它的參考基因組如下:
至於你問我其他物種多少生物學重復合適，我只能說越多越好了。
文獻B.Differential expression in RNA-seq: A matter of depth
❸ 轉載---[轉錄組] 轉錄組專題——關於樣本重復性問題小技巧
目前，轉錄組測序仍是應用最廣的高通量測序技術之一，很多研究課題是關於基因表達潛在的機制，並已經發現了一些現象，但分子機制還不清楚。而做轉錄組測序特別適合用於分子機制探究，可以獲得樣本中幾乎所有的mRNA信息。關於轉錄組領域的研究，應用范圍極為廣泛。如可研究同一個體不同組織之間的基因表達差異；或者不同的外界處理條件下（病毒、光照、紫外、乾旱、高溫和高鹽脅迫等），對基因表達的影響。
在我們正式進行轉錄組數據分析之前，需要先對組內生物學重復（一般設置3個生物學重復）進行樣本關系分析，判斷組內重復性效果的好壞，是否有離群樣本。應廣大研究者之需，本期針對大家比較關心的樣本重復性問題進行探討，力爭為各位老師在科研之路上帶來幫助。
在進行問題討論之前，首先我們對可能會困擾大家的關於什麼是生物學重復和技術學重復的問題進行區分。
①生物學重復： 指同一處理下不同的生物學樣品。由於遺傳和環境等因素的影響會引起生物體的個體差異，因此需要採用生物重復的實驗設計方法來降低該差異。一般的實驗設計中，都會包括實驗組和對照組。如下圖A實驗組包含3隻小鼠，那麼這3隻小鼠，經過相同的實驗處理，分別測組織的RNA-seq，即為一組生物學重復。
②技術重復： 簡單來說就是對同一生物體樣品進行重復地檢測。如下圖B、C，都屬於技術重復。對於第一種技術重復，重點是檢測RNA-seq方法的准確度。比如當發現了一個新的檢測基因表達量的方法，就需要用這種重復來驗證（圖1 B）；第二種技術重復重點是這個小鼠本身的基因表達水平（圖1 C）。
圖1 生物學重復和技術重復
那麼接下來，我們正式切入主題，針對樣本重復性問題進行探討。
『1. 生物學重復必須要設置嗎？』
答：需要。生物學實驗中，生物體往往存在異質性，常常需要設置重復，以此確保不是個體的偶然變異對結果產生的影響[1]。若不設置組內生物學重復，在投稿時也會受到審稿人的質疑。我們無法判斷組內差異所佔的比例有多大，可能獲得的差異表達基因僅僅是少數個體差異的表現，並不能反映是真正處理效應導致的差異。設置生物學重復可以評估組內誤差，降低背景差異，檢測離群樣本，增強結果的可靠性。
Tips
組間差異是由組內差異和處理效應共同導致的[2]。組內差異包括采樣個體間的差異、實驗操作誤差等等，這些差異是我們在實驗時要盡可能降低的。而組內誤差主要由生物學誤差和技術誤差引起的。
圖2 組間差異和組內差異
『2. 每個處理推薦多少個生物學重復呢？』
答：不同的實驗樣品，由於外界因素導致的個體之間的差異或實驗操作導致的誤差可能不同。因此，針對不同的樣品所推薦的組內生物學重復也有所差別[3]。
① 對於動植物樣品，建議3~5個生物學重復，對生物學樣品之間做相關性檢驗，提高實驗結果的可信度；
② 對於細胞樣品，生物學重復之間的差異性相對較小，建議3個以上生物學重復；
③ 對於臨床樣品，由於供試者的基因型、生活方式、生活環境、年齡、性別可能存在較大差異，可能需要更多的生物學重復，一般10個生物學重復以上[4]。
Tips
在轉錄組測序時，一般不建議設置兩個重復。因為如果兩個重復樣品結果不一致，無法確定以哪個數據為參考。
『3. 用於判斷組內重復性好壞的常用工具有哪些？』
答：在實際分析過程中確認組內重復性的好壞方法有很多，可進行樣本的PCA，可計算兩兩樣本的相關系數，或者繪制樣本聚類圖、重復性散點圖多種方式綜合判斷。在實際分析中，通常結合PCA和相關性系數綜合判斷樣本是否離群。
① PCA：詳見Question 4；
② 相關系數：通常計算兩個樣品之間的Pearson或Spearman相關系數判斷組內重復性情況。相關系數越接近1，樣品間相似度越高。一般情況下，組內生物學樣本相關系數大於組間樣本，則表明組內重復性較好；
③ 樣本聚類樹：可用於判斷在不同實驗條件下的表達模式。依據樣品的表達譜進行聚類，樣品之間重復性較好時通常會聚在同一分支下。如果組內樣本重復性較差可能會呈現無規則的聚類形式；
④ 重復性散點圖：展示組內樣本的重復性情況。圖中偏離對角線的點越少，樣品間的相關性越高，重復性越好。
圖3 Omicsmart中樣本關系分析圖形
『4. PCA是什麼？怎麼看？』
答：主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是一種線性降維演算法。用方差（Variance）來衡量數據的差異性，將高維數據用某幾個綜合指標來表示。將原本鑒定到的所有基因的表達量重新線性組合，形成一組新的綜合變數，同時根據所分析的問題從中選取2-3個綜合變數，使它們盡可能多地反映原有變數的信息，從而達到降維的目的。如PC1（Principal Component 1）和PC2（Principal Component 2）為降維後獲得的兩個主成分因子，可分別從數據差異性最大和次大的方向提取出來。
在樣本關系分析過程中，PCA可以讓我們非常直觀地看出各個樣本之間的相似性。關於轉錄組測序，我們可能獲得上萬個基因的表達信息，那麼利用PCA可將樣本所包含的上萬個維度的信息（上萬個基因的表達量），降維至某些維度的綜合指標（主成分）表示。一般選取PC1和PC2，來解釋樣本間的重復性好壞與組間樣本的差異度。如下圖PCA散點圖，組內樣本呈現相互聚集，說明組內的重復性比較好。
圖4 Omicsmart在線報告PCA圖
Tips
在文章中，也會看到三維的PCA圖。這時選取了PC1，PC2，PC3去解釋樣本間的距離。PC1+PC2（+PC3）越大，對方差解釋度越大，越具有說服力。
『5. 相關性系數分析時，相關系數達到多少可認為組內重復性效果好？』
答：一般情況下，計算相關性系數時，對於生物學重復（如采樣時個體差異）之間的相關系數依據經驗建議在0.7以上較好；對於技術重復（實驗操作、實驗儀器等）之間的相關系數依據項目經驗來說在0.85以上比較合理。
Tips
關於相關系數如何計算，可能還存在不少的困惑。我們在這里也解釋一下。對於轉錄組數據，可以利用樣本的表達譜來計算樣本間的相關性，通過計算相關系數r來評估每組樣本的生物重復性。最常用的度量是Pearson和Spearman相關系數。
那麼在實際分析中，這兩種計算方式應該如何選擇呢？
我們首先簡單了解二者的區別。對於Pearson相關系數很簡單，主要用來衡量兩個數據集的線性相關程度。而Spearman相關系數它不關心兩個數據集是否線性相關，所關注的是單調相關。所以Spearman相關系數也稱為等級相關或者秩相關（即rank）。從下圖中我們可以更好的理解，如果對數據進行線性變換（y=ax+b；a≠0），兩者相關系數的絕對值都不會發生變化（圖5 A）；如果對數據進行單調但不是線性的變換，比如最常見的log scale，Spearman相關系數的絕對值也不會發生變化[5]（圖5 B）。這時我們就可以知道，兩者的前提假設就不同，Pearson相關假設數據集在同一條直線上，而Spearman只要求單調遞增或者遞減，所以Pearson的統計效力一般情況下比Spearman要高。但是更重要的是，我們需要根據實際情況選擇正確的假設。比如，某個實驗做了3次生物學重復，那有理由假設這3次重復線性相關。而如果是一個基因和另一個受到調控的基因的表達水平，或者某個基因順式作用元件的染色質開放程度，和這個基因表達水平之間的關系就可能需要假設單調相關。
圖5 Pearson和Spearman相關系數
關於兩者的特點也有所不同，若想要深入學習二者的演算法特徵，可回顧往期文章 《相關系數第一彈：哪哪都能看到的皮爾森相關》 和 《相關系數第二彈：斯皮爾曼相關》 ，都有詳細的解釋喲。
『 6. PCA和相關系數的演算法，哪個更能判斷樣本的重復性？為什麼？』
答：相關系數。因為PCA為把對樣品貢獻大的信息保留，所描述的是整體所有組的特徵；而相關系數直接呈現的是兩組樣品之間的相關程度。若相關系數越高，表明兩組樣品之間的相關程度越高，即重復性越好。
『7. 樣本離群了，還能用於分析嗎？』
答：首先判斷離群程度，若離群程度較小，則可以嘗試設置閾值，縮小基因范圍，再次重新進行相關性分析判斷樣本是否離群。若離群程度很大，對後續差異分析的結果造成了很大的影響，那麼可以考慮將該樣本剔除，再進行後續差異分析等等。
Tips
轉錄組測序通常要求設置3個生物學重復樣本，如果樣本足夠多，建議比預期實驗設計多送1~2個樣本測序，以便後續某個樣品與組內其它樣本出現離群情況，直接剔除離群樣本，省時省力。若測序樣本較少，無法剔除樣本，也可以考慮對同一批次的備份樣本再次測序，後續再重新分析。
以上就是今天的關於樣本關系分析問題，在此也向廣大研究者徵集相關問題，如有疑問，歡迎下方留言。或者也可登錄基迪奧OmicShare論壇，搜索和討論更多相關知識。
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▼參考文獻▼
[1] Robles, José A et al. Efficient experimental design and analysis strategies for the detection of differential expression using RNA-Sequencing. BMC genomics vol, 13 484. 17 Sep. 2012, doi:10.1186/1471-2164-13-484
[2] Hansen, K., Wu, Z., Irizarry, R. et al. Sequencing technology does not eliminate biological variability. Nat Biotechnol. 29, 572–573. 2011, https://doi.org/10.1038/nbt.1910
[3] Todd E V, Black M A, Gemmell N J. The power and promise of RNA-seq in ecology and evolution[J]. Molecular ecology, 2016, 25(6): 1224-1241
[4] Liu Y, Zhou J, White K P. RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication?[J]. Bioinformatics, 2013, 30(3): 301-304
[5] Trost B, Moir CA, Gillespie ZE, et al. Concordance between RNA-sequencing data and DNA microarray data in transcriptome analysis of proliferative and quiescent fibroblasts. R Soc Open Sci. 2015, 2(9):150402. doi:10.1098/rsos.150402
❹ 轉錄組數據繪制PCA圖以及生物學重復的相關問題
很久沒有跟新啦~~~忙著基金。。基金。。還是基金，然後就是文章。。文章。。還是文章。
終於有空整理之前的東西。
說繪圖方法之前先要了解，轉錄組的PCA圖的意義是什麼？
為了檢測樣本之間的離散程度，也就是重復之間差的大不大。
1、繪圖之前先解答樣本重復的問題。
轉錄組測序一般情況下需要是三個重復。但是對於完全沒有接觸過測序的人來講，就很疑惑：轉錄組測序為啥一定要生物學重復呢？我不要行不行？為啥大部分要3個重復？4個、5個、666個重復行不行呢？怎麼樣算重復？3隻老鼠各測一次算3個重復，還是1隻老鼠測三次算3個重復？一堆問題就很糾結，著實讓人頭大呀~~~
第一個問題：一定要生物學重復嗎？
回答：最好要。
那什麼情況下可以沒有生物學重復呢？
1）科研經費太少，沒錢測序。（這種情況就乾脆不要測了，測1個就很雞肋。）
2）實驗證據絕對充分，然後想裝點一下門面，看起來花哨一些。（那實驗都做那麼好了，那就多測幾個嘛~要不就乾脆不要測了。要不然本來能發nature，結果你「貂尾續狗」只能發個plosone，就很沒必要。）
第二個問題：一定要3個重復嗎？那我測2個或者4個行不行？
回答：重復的數量一定要≥3。
1）先回答設置重復的目的是什麼？是為了：消除組內誤差；增強結果的可靠性；檢測離群樣本。
1.1） 假如你給小鼠餵了一種葯，不同小鼠對葯的反應肯定不同，那麼多個樣本就可以消除小鼠之間本身的差異。
1.2）再假如，你給3隻小鼠餵了葯，但是其中一隻就是天生免疫力極強，葯物對它的影響極小。另外兩只就比較相似，那後面分析的時候你就要把免疫力極強的那一隻刪掉，汪純蘆因為它的數據會對分析結果造成極大的偏差。
1.3）但是，如果你只有2隻老鼠，其中一隻天生免疫力極強，葯物對它的影響極小。拿到測序數據一分析發現兩只差別很大，那你選哪一隻呢？有人說，那我肯定選免疫力正常的那一隻呀。 哎呀 這個問題，真的是。。。只有測序了之後你才能知道免疫力到底強不強，你給老鼠喂葯之前你是不知道人家身體到底好不好的。這就是為褲納啥不要選2個的原因。
2）理論上來說重復越多越好，但是考慮實際情況，設置3個重復還是比較普適的方法。
具體原因參見以下文獻：RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication?
3）動物或者植物之間樣本的差異還是比較大的，所以可以多測一點，例如可以做5-10個重復之類的。土豪的話你可以測任何你覺得吉利的數字，譬如66、88、996甚至2333等等。（玩笑話哈 ）
第三個問題：3隻老鼠分別測序算重復，還是1隻老鼠測3次算重復？
回答：3隻老鼠各測一次。
搞清楚生物困帶學重復和技術重復。（自行網路）
2，繪制PCA圖
載入繪圖的包
設置運行路徑並且導入你之前已經計算完的FPKM數據。
計算每個PCA的各項指數。
利用ggscatter對PC進行繪圖
或者可以試試3D繪制散點圖
3D繪圖的不好的地方就是，scatterplot3d裡面沒有參數讓你展示每個點的名字，就很郁悶。
如果想實現就試試下面的方法，我也是google出來的。
❺ 【轉載】生物學重復與技術重復
生物重復和技術重復分別是什麼？在一個實驗中應該如何安排生物重復和技術重復？
重復是實驗設計的重要原則之一，實驗重復無論對於實驗結果的可重復性，還是對於最終實驗結論的可靠性，都起著起決定性的作用。
實驗重復還可以進一步細分為生物重復(biological replicates)和技術重復(technical replicates)，那麼生物重復和技術重復分別是什麼？在一個實驗中應該如何安排生物重復和技術重復？
生物重復和技術重復分別是什麼？
生物重復：指對同一個處理組中獨立來源的重復樣本分別進行獨立分析，是整個實驗的完全重復，如將具有同一基因型的多個細胞株進行獨立地測定。由於遺傳和環境等因素的影響會引起有機體的個體差異，因此需要採用生物重復的實驗設計方法來消除該差異。目前都以3次生物學重復實驗設計為主，要求嚴格的實驗可以做5次重復。
技術重復：指對同一樣本進行重復地檢測分析，例如同一份細胞中抽提的蛋白質進行三次質譜檢測，或者對同一RNA-seq樣本測序3次。與生物學重復相比，技術重復的測量變異程度較小，從而可以減少實驗中的分析變異，將對同一份樣本產生高重復性的測量結果 。
簡單來講，生物重復是生物級別的重復，一般都是生物樣本的重復。而技術重復，更多的是參數測定環節的重復，一般是對同一生物樣本進行多次測定。
進一步分析，其實可以發現生物重復是衡量實驗的總波動的（處理組間的差異不列入此處的波動，他們應該稱為效應），它包括樣本個體間差異和技術重復差異，而技術重復更多的是單純的衡量參數測量時的波動，如實驗操作嫻熟程度、儀器穩定性等等。
在一個實驗中應該如何安排生物重復和技術重復？
如此說來，對於一個實驗來說，如果條件允許的話，最好把生物重復和技術重復做全了？
然而StatQuest推薦的策略是只需要生物重復即可，不需要技術重復。為什麼？
只做生物重復
以小鼠的RNA-seq實驗為例，先看一下生物偏差（biological variation）和技術偏差（technical variation ）。
下圖代表小鼠的RNA-seq數據，虛線μ是總體小鼠的Read Counts，藍色條代表5個樣本小鼠的Read Counts。那那麼樣本小鼠的Read和總體μ是存在一定的差異的，我們將5個樣本小鼠的Read取平均：
average = [(μ+5)+(μ-1)+(μ+4)+(μ+2)+(μ-5)] / 5 = μ + (5-1+4+2-5)/5
隨著生物重復的增多，(5-1+4+2-5)/5會逐漸趨向於0，這個平均數也會趨近於總體搜咐均值μ。
剛才只考慮了生物生物偏差，沒有考慮技術偏差，下圖中添加悄灶了技術偏差，棕色條為生物偏差，綠色箭頭為技術偏差，那麼此時依然可以取5個樣本小鼠的Read平均：
average = μ + (5-1+4+2-5)/5 + (-2+5+2-2-1)/5
隨著生物重復的增多，生物偏差(5-1+4+2-5)/5 逐漸趨向於0，技術偏差也會逐漸趨向於0，這個平均數也會趨近於總體均值μ。
所以只做生物重復就可以很好的使用樣本代表總體。
只做技術重復
繼續進行實驗，下圖代表對1#小鼠測定了5次RNA-seq數據。那麼同樣方法取5個RNA-seq數據的平均：
average = μ + 5 + (-2+5+2-2-1)/5
隨著技術重復數的增加，技術偏差(-2+5+2-2-1)/5會逐漸趨近於0，而這個平均數會逐漸趨近於μ + 5，永遠也不會等於總體均值μ，因此做再多的技術重復，最終的RNA-seq數據也無法很好的代表總體。
同時做生物重復和技術重復
以下圖為例，1#小鼠做了2個技術重復，2#小鼠做了3個技術重復，此時的生物偏差為5、5、-1、-1、-1，而技術偏差不變（技術偏差是參數測定時的偏差，不會因樣本而異，而且因樣本而已的偏差肯定是樣本偏差），所以樣本均值為：
average = μ + (5+5-1-1-1)/5 + (-2+5+2-2-1)/5
隨著樣本量啟漏扮的增加，技術偏差(-2+5+2-2-1)/5會逐漸趨向於零。
但生物偏差(5+5-1-1-1)/5雖然也會收斂到0，但是此時所需要的樣本量比『只做生物重復』時大大增加，也就是說生物偏差的收斂速度變慢了。
這個生物偏差收斂變慢的速度有多慢呢？
假如多了3個技術重復，那麼就需要3倍的樣本量才能抵得上『只做生物重復』時的收斂速度。說白了，就是多做的技術重復最多不過和『只做生物重復』的效果持平而已。
做一下總結：
只做生物重復：最佳的實驗設計，可以很好的代表總體；
只做技術重復，沒有生物重復：不要使用這種實驗設計，永遠只會得到總體的有偏估計。
生物重復和技術重復：不推薦做，並不能很好的提高樣本的代表性，要麼獲得一個有偏的估計，要麼需要更多的樣本。
❻ 生物學重復必須同一時間去做嗎
實驗設計原則的正確把握：重復原則及其作用
重復原則通常有三層含義，即「重復取樣」、「重復測量」和「重復實驗」，實驗設計中所講的重復原則指的是「重復實驗」。本文本文以實例的方式說明一下臨床實驗中違背重復原則和重復原則使用不當的常見情況。
重復原則及作用
重復原則的概念
重復通常有三層含義，即「重復取樣」、「重復測量」和「重復實驗」。從同一個樣品中多次取樣，測量某定量指標的數值，稱為「重復取樣」；對接受某種處理的個體，隨著時間的推移，對其進行多次觀測稱為「重復測量」。實驗設計中所講的重復原則指的是「重復實驗」，即在相同的實驗條件下，做兩次或兩次以上的獨立實驗。這里的「獨立」是指要用不同的個體或樣品做實驗，而不是在同一個體或樣品上做多次實驗。整個實驗設計所包括的各組內重復實驗次數之和，稱為樣本大小或樣本含量。
重復原則的作用
同一個實驗條件下為何要做多次獨立的重復實驗呢？只做一次不更節省時間柏費用嗎？
關鍵在於觀測的結果是否具有變異性，若對每一個正常人觀測其有多少個手指，只需觀測一個人即可，因為每個正常人的手指都有10個，它是一個不具有變異性的定量指標。若對每一個正常入觀測其血小板的含量是多少，僅觀測一個人就作出關於正常人血小板含量為多少的結論顯然是可笑的，因為每個正常人血小板含量是不盡相同的。只有觀測了大量正常人血小板的含量後，其取值規律性才有可能表現出來，初步的印象是取值接近該組被觀測的全部受試者算術平均值的人較多，取值偏離此均值較遠的人較少，取值特別小和特別大的人就吏少了。即便這樣一種非常簡單的規律，也只有在進行了大量重復實驗之後才能夠表現出來。
由此可如重復原則的作用就在於它有利於使隨機變數的統計規律性充分地顯露出來。
96孔板的實驗，比如MTT，luciferase reporter等實驗室，單次至少3個復孔，需要至少3次獨立重復實驗（肯定不是一天做的）。
WB實驗，收樣的時候可以不用做復孔，分裝蛋白的時候可以分幾份跑膠，也可以就跑一次。但是結果至少重復3次（三批的樣本）保證重現性。
PCR實驗，收樣的時候不需要復孔，但是p的時候至少設置3個復孔，且至少3次獨立重復實驗，也就是說你等收三批以上的RNA樣本。
染色實驗，組織樣本，至少來源於3隻以上的動物，這個具體看你用什麼模式生物，小鼠得6隻，大鼠3隻。每個組織至少有3-5張切片進行染色。最後分析的時候如果是掃描圖片可以是一張整圖，如果是放大的截取的圖片，那至少觀察5個以上的視野。細胞樣本染色，6孔板或者比6孔板大的染色，我一般做1-2個復孔，其實一個也可以。96孔這種，至少也需要3個復孔.且都需要做3批以上。
CoIP, IP pulldown因為最後處理相當於WB,參考WB即可。
ChIP參考PCR即可。
RNA-seq, ChIP-seq,>3個重復樣本。
注意：文章中的n=5，動物實驗的話是指有5隻動物，細胞實驗是指5個獨立實驗，也就是5批實驗的結果，不是5個復孔的意思。
❼ 生物學重復是什麼應該怎麼設置
"生物學重消蔽唯復"指的是經過相同方式處理的相同樣品。
對照組A、B、C三隻小鼠 (control A, B and C) 互為生物學重復。實驗組A、B、C三隻小鼠(Treated A)同樣互為生物學重復。
"生物學重復"的概念容易與"技術重復"相混淆。一般來說，技術重復指的是同一樣品多次測量。並銷如圖所示，拿培任一小鼠在板A、B、C中被重復測量了三次，即技術重復了三次。
❽ 技術重復實驗一般幾次
技術重復：通俗講就是操作重復，簡
單理解一般就是三次實驗，比如洞猛對一
塊組織，提了三次RNA，做三局顫次real
time。 2、為什麼設置生物學重復納臘橋。
❾ [轉錄組] 生物學重復到底設定多少個合適
我打算做一個RNA-seq項目，研究一株細菌在兩個環境條件下的表達差異。現在，我打算確定生物學重復的個數，以便可以得到統計學上有意義的結果。我打算每個環境的樣本設置兩個生物學重復，而不打算測更多重復。請問，兩個重復的設置是否合理？
1.如果是我的話，我會選擇設置三個生物學重復。要知道兩個生物學重復意味著雙倍的工作量但沒有雙倍的效果。如果做兩個生物學重復，你會引入無法校正的噪音。如果兩個重復結果一樣，那能說明問題，但如果不一樣，你就解釋不了了。如果樣品制備不是非常難，經費不是非常有限，我建議還是設置3個生物學重復吧{:4_239:}
2.這是個有意思的問題，從統計學的角度來說
排除生物學意義，從統計學的角度來說，不同的統計方法，對生物學重復的個數的要求並不相同。
如果使用T檢驗，你應該設置盡可能多的生物學重復，建議至少3個重復。當然T檢驗的方法，在RNA-seq的差異分析里不是很合理。因為RNA-seq的誤差分布，並不符合正態分布。
如果你選擇的統計模型是Fisher 精確檢驗類的統計模型（包括超幾何分布或泊松分布），即使沒有生物重復也是可以進行統計的。當然，沒有生物學重復只是在統計學上可行，但實際上無算估算生物差異或實驗誤差帶來的系統誤差。所以，這樣的策略現在發表論文的話，可能會被質疑的。
如果你選擇一些軟體，例如Deseq這樣的軟體，一般也要求2個以上的生物學重復。
這個是非常有意思的問題，我提供的建議非常有限，期望其他人有更好的回答。
「虎式坦克」的回答不錯。關於生物學重復與統計的關系，我補充一下。在我們的測序樣本中，每一個基因表達量的方差包含兩個方面的內容：
1）處理方差，就是我們的實驗處理導致的差異，這些差異當然就是我們關注的；
2）誤差方差，就是與我們實驗處理無關的差異，例如，生物個體間的差異，實驗技術不穩定導致的偏差等。誤差方差並非我們關注的，但這些差異會引入假陽性。
所以生物學重復的價值在於幫助我們估算誤差方差的大小，從而我們可以從總體方差中剔除誤差方差的影響。
以上的內容，就是生物統計學中「方差分析」所講的內容。其實RNA-seq差異分析的主體思路和方差分析基本相同，只是把誤差分布的假設從方差分析的正態分布，替換為了其他更合理的分布，例如負二項分布。 那麼，生物學重復在這里的意義就是用於計算誤差方差的大小。因為生物學重復間不存在處理效應，任何差異都屬於誤差方差的范疇。
但還需要補充一點，由於我們大部分二代測序只有2~3個生物學重復。這么少的重復數，正確預估每個基因誤差方差其實是不夠的（也就是單個基因的方差估計很不穩定）。所以，一般的差異表達分析軟體（例如，Deseq，edgerR）使用了一個代償的方法。這個方法假設：對於表達量相似的基因，其誤差方差也應該是相似的。所以在Deseq裡面，會使用所有基因的方差獲得擬合曲線，來獲得不同表達量的基因的期望方差（如下圖）。在重復數比較少的情況下，擬合得到的期望方差理論上會比單個基因的估算更准。攜擾
回答完統計學角度的問題，我們再從生物學試驗設計的角度來考慮重復數設置的問題。我們一般會建議老師測3個生物學重復，除了統計角度的考慮，還有考慮試驗的意外因素。如果測兩個重復，而其中一個樣本發現有問題而需要被剔除，辯鉛旦就會導致這組數據將非常不可信。但如果我們有三個重復，剔除一個樣本後，依然留有兩個樣本，保證這組數據依然是有重復的。
我認為從統計的角度，4個重復是理想的。當然，從費用的角度來說，目前依然是太貴了。隨著測序價格不斷下降，重復的設置應該會慢慢提高激宴的。
關於實驗重復對RNA-seq的影響，可以閱讀以下兩篇論文。第二篇論文尤其值得看看。
Statistical Design and Analysis of RNASequencing Data.Genetics, Vol. 185, No. 2. (1 June 2010), pp. 405-416.
Efficient experimental design and analysis strategies forthe detection of differential expression using RNA-Sequencing.Robles et al. BMCGenomics 2012, 13:484
❿ 物理重復和生物學重復都必須要嗎
可以都要
如果你的高通量的數據是要放到文章裡面去的，甚至有人僅僅晶元的數據就發一篇文章，那一定要有n>=3的生物學重復。如果只是自己看一看，找個方向，那可以不做重復。但是，問題來了，如果是組織樣，組內差異很大，不做重復也沒意義。如果是細胞株，可能好一些。生物學重復是必要的，就是樣本和總體的關系，樣本越大越能代表總體