怎麼測生物指示值

1. 生物指示劑的基本信息

生物指示劑是一類特殊的活微生物製品，可用於確認滅菌設備的性能，滅菌程序的驗證，生產過程滅菌效果的監控等。
生物指示劑的定義：
對特定滅菌處理有確定的抗力，並裝在內層包裝中可供使用的染菌載體。用於確認滅菌設備的性能，滅菌程序的驗證,生產過程滅菌效果的監控等。
生物指示劑分類：
1）按結構分可分為片狀生物指示劑(strip biological indicator)和自含式生物指示劑(self-contained biological indicator)；片狀生物指示劑需要使用陽性對照和陰性對照，而自含式生物指示劑只需要陽性對照即可 。
2）根據ISO 11138 -1(2006)的分類，目前的生物指示劑有環氧乙烷滅菌用生物指示物、濕熱滅菌用生物指示物、乾熱滅菌用生物指示物、過氧化氫低溫等離子滅菌生物指示物和甲醛滅菌用生物指示物 。
3）按培養時間可分為通用型生物指示劑和快速型生物指示劑。通用型生物指示劑根據芽孢復甦後指示菌種新陳代謝引起培養液pH值改變，通過酸鹼指示劑變色來進行判讀，時間一般在24或48小時以上；而快速型生物指示劑根據芽孢復甦後的酶促反應，通過熒光進行判讀，時間一般為3-4小時。同時國外正在研發更加快速的生物指示劑，有望在1小時之內得出結果。
生物指示劑重量質量特性：
1）芽孢含量
2）D值（生存曲線法測定）
生物指示劑生產商：
1）國外專業生產商：有美國強生，3M，Raven，Steris，Namsa，SGM，ACE等；
2）國內專業生產商：有杭州富捷，北京四環等。

2. 測試微生物限度的培養基靈敏度如何測定

微生物限度檢查用培養基的靈敏度檢查方法1）
用於菌數計數的半固體瓊脂培養基的靈敏度檢查方法a．取配製好的瓊脂培養基平皿3個，在每塊平板表面上用表面塗布法接種30-100個試驗菌；同時用已確認的同型號培養基平皿3個做對照試驗。B．等待培養基表面的菌液風干後，將培養皿倒置，於培養基的使用溫度下培養48－72小時，取出培養皿點計菌落數。C．樣品培養基上微生物數量應不得低於對照培養基上微生物生長數量的70％，則該培養基靈敏度視為合格。2）
用於控制菌檢查的富集培養基的靈敏度檢查方法參照無菌檢查用培養基靈敏度檢查方法進行，每100ml培養基內分別接入試驗菌小於100個CFU，每個菌種接種兩瓶培養基，將接過種的培養基置於指定條件下培養。應在16－18小時可明顯觀察到培養基內有微生物生產，則證明此培養基靈敏度合格。

3. 生物中檢測微生物用什麼意思方法

生長量測定法

體積測量法：又稱測菌絲濃度法。
通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間（如5分鍾）和轉速（如5000 rpm），離心後，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。

稱乾重法：
可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速，進行離心，並用清水離心洗滌1-5次，進行乾燥。乾燥可用烘箱在1050C或1000C下烘乾，或採用紅外線烘乾，也可在800C或400C下真空乾燥，乾燥後稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾後用少量水洗滌，在400C下進行真空乾燥。稱乾重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常採用這種方法，如活性乾酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

比濁法：
微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可採用一種特製的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用於發酵工業菌體生長監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600nm 處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.Coli的生長及誘導時間。

菌絲長度測量法：
對於絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度，或是利用一隻一端開口並帶有刻度的細玻璃管，到入合適的培養基，卧放，在開口的一端接種微生物，一段時間後記錄其菌絲生長長度，藉此衡量絲狀微生物的生長。

微生物計數法

血球計數板法:
血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平台，兩嵴的表比兩平台的表面高0.1 mm，每個平台上刻有不同規格的格網，中央0.1 mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜於單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，並且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

染色計數法：
為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。藉助不同的染料對菌體進行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色後在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。

比例計數法：
將已知顆粒（如黴菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較粗放。並且需要配製已知顆粒濃度的懸液做標准。

液體稀釋法：
對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15隻裝培養液的試管中，經培養後記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然後查最大或然數表MPN（most probably number）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用於食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

平板菌落計數法：
這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液塗布於已凝固的固體培養基平板上。保溫培養後，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。

試劑紙法：
在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色）待蘸取測試菌液後置密封包裝袋中培養。短期培養後在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標准紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷准確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

膜過濾法：
用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。

生理指標法：
微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸鹼度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。

測定含氮量：
大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%，酵母為7.5%，黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱後產生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO2後即可測出N2的量。

測定含碳量：
將少量（乾重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鍾後冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標准樣品做標准曲線。

還原糖測定法：
還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用於大規模工業發酵生產上微生物生長的常規監測。方法是，離心發酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鍾，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點時加入澱粉溶液，繼續加Na2S2O3至終點，查表讀出還原糖的含量。

氨基氮的測定：
方法是，離心發酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應數刻，加入0.02N的使之變色，根據NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據培養液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。

其他生理物質的測定：
P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙醯胞壁酸）等含量以及產酸，產氣，產CO2（用標記葡萄糖做基質），耗氧，黏度，產熱等指標， 都可用於生長量的測定。也可以根據反應前後的基質濃度變化，最終產氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如我所在BMP-2的發酵生產上，隨時監測溶氧量的變化和酸鹼度的變化，判斷細菌的長勢。

商業化快速微生物檢測法：
微生物的檢測，其發展方向是快速，准確，簡便，自動化，當前很多生物製品公司利用傳統微生物檢測原理，結合不同的檢測方法，設計了形式各異的微生物檢測儀器設備，正逐步廣泛應用於醫學微生物檢測和科學研究領域。例如：
1、抗干擾培養基和微生物數量快速檢測技術結合解決了傳統微生物檢測手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測系統奠定了堅實的基礎。中科院廣州分院合作產業處提供的抗干擾微生物培養基，新型生化鑒定管，微生物計數卡，環境質量檢測試劑盒等，可方便的用於多項檢測。
2、BACTOMETER 全自動各類總菌數及快速細菌檢測系統可以數小時內獲得監測結果，樣本顏色及光學特徵都不影響讀數，對酵母和黴菌檢測同樣高度敏感原理是利用電阻抗法（IMPEDANCE TECHNOLOGY）將待測樣本與培養基置於反應試劑盒內，底部有一對不銹鋼電極，測定因微生物生長而產生阻抗改變。如微生物生長時可將培養基中的大分子營養物經代謝轉變為活躍小分子，電阻抗法可測試這種微弱變化，從而比傳統平板法更快速監測微生物的存在及數量。測定項目包括總生菌數，酵母菌，大腸桿菌群，黴菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌等。

4. 生物指示劑的生物指示劑的應用

在滅菌程序驗證中，盡管可通過滅菌過程某些參數的監控來評估滅菌效果，但生物指示劑的被滅殺程度，則是評價一個滅菌程序有效性最直觀的的指標。可使用市售的標准生物指示劑，也可使用有日常生產污染菌監控中分離的耐受性最強的微生物制備的孢子。在生物指示劑驗證試驗中，需確定孢子在實際滅菌條件下的D值，並測定孢子的純度和數量。驗證時，生物指示劑的微生物用量應比日常檢出的微生物污染量大，耐受性強，以保證滅菌程序有更大的安全性。在最終滅菌法中，生物指示劑應放在滅菌櫃的不同部位。並避免指示劑直接接觸到被滅菌物品。生物指示劑按設定的條件滅菌後取出，分別置培養基中培養，確定生物指示劑中的孢子是否被完全殺滅。
過度殺滅產品滅菌驗證一般不考慮微生物污染水平，可採用市售的生物指示劑。對滅菌手段耐受性差的產品，設計滅菌程序時，根據經驗預計在該生產工藝中產品微生物污染的水平，選擇生物指示劑的菌種和孢子書數量。這類產品的無菌保證應通過監控每批滅菌前的微生物污染的數量、耐受性和滅菌程序驗證所獲得的數據進行評估。
在醫療機構的滅菌生物監測中，WS310國家標准已明確規定：1、壓力蒸汽滅菌過程為每周一次，使用壓力蒸汽滅菌生物指示劑；2、環氧乙烷氣體滅菌為每批次都要監測，使用環氧乙烷滅菌生物指示劑；3、低溫等離子體滅菌為每日監測一次，使用低溫等離子體滅菌生物指示劑。以上三種滅菌方式，。也是2012年醫療機構的主要滅菌方式，其中，壓力蒸汽滅菌使用最為廣泛。

5. 脈動真空壓力蒸汽滅菌器空鍋做生物監測怎麼操作

如果是做滅菌效果檢測的話，常用下面兩種方法：

一、化學指示卡測試法

將化學指示卡放置擬滅菌物品包中央。滅菌後，將包裹取出，觀察指示卡，如果指示卡色塊顏色達到或深於卡面標准色，說明物品包中心已達到滅菌溫度和時間；如果指示劑顏色無變化或變色淺於標准色，則表明未達到規定的滅菌溫度和時間。

二、生物監測法。通常採用國際通用的熱力滅菌試驗菌株為嗜熱脂肪芽胞桿菌。將生物指示劑放入標准試驗包中心部位。試驗包大小為25 cm×30 cm×30 cm。測試設5個點,分別為滅菌櫃（上層中心,中層左前,右後,下層左後,排氣口附近）。按滅菌操作程序好核,滅菌結束後，壓碎安瓿培養基與菌片混合一起置於56°C培養箱內,24 h～48 h之間觀察結果。如培養基的滅菌管，說明無嗜熱脂肪芽胞桿菌生長繁殖，表示滅菌徹底；如由紫紅色變為黃色，說明有嗜熱脂肪芽胞桿菌坦鉛生長繁殖，表示滅菌失敗。

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滅菌原理：利用機械抽真空的方法，使滅菌室內形成負壓，蒸汽得以迅速穿透到物品內部，與器械接觸後飽和蒸汽釋放出大量的潛熱（2250KJ），當蒸汽遇到冷的滅菌物品時即冷凝成水，釋放全部潛熱，使滅菌物品的溫度快速的升高，迅速升高的溫度使細菌中的蛋白質凝固變性，從而將所有微生物包括細菌芽孢全部殺死。

滅菌過程：待滅菌器械由消毒員放置到專用滅菌架內，推入滅菌器，關閉前門，操作人員運行滅菌器已預先設定好的滅菌程序進行滅菌處理。程序運行過程如下：脈動——升溫——滅菌——排汽——乾燥——結束。

a．脈動：對滅菌器內室進行抽真空、進蒸汽操作，反復進行三次，然後再次抽真空，待內室壓力到達脈動下限後，程序轉入升溫階段。經過該階段後，內室的冷空氣排除率可達到99%以上，確保內室無死點，保證滅菌的合格。

b．升溫：蒸汽經過滅菌器夾層進入內室，對器械進行加熱，同時內室疏水閥間歇性開啟，將蒸汽冷凝後產生的水排出。內室溫度達到設定值後程序轉入滅菌階段。

c．滅菌：開始滅菌計時，在此期間內室進汽閥受到內室溫度和壓力的共同控制以確保內室保持在一定的溫度范圍內對器械進行滅菌。當內室溫度高於滅菌器設定的數值上限時，進汽閥關閉，低於數值下限時，進汽閥打開；同時，當內室壓力高於數值上限時，進汽閥也會關閉，低於內室壓力下限值時，進汽閥打開以確保滅菌階段溫度的上下波動不超過3°。滅菌計時結束後，程序轉入排汽階段。

d．排汽：排汽閥打開，內室的蒸汽在內外壓差的作用下排出，經過換熱器的作用，大部分蒸汽冷凝成水，少部分蒸汽經過濾後排至大氣。內室壓力下降到設定值後，程序轉入乾燥階段。

e．乾燥：真空泵打開對內室進行友信掘抽真空，同時夾層保持一定的壓力和溫度，起到烘乾器械的作用。

f．結束：蜂鳴器呼叫，此時可以打開門將滅菌車推出進行器械的晾放。