土壤微生物如何跟資料庫比對

Ⅰ 為什麼說土壤是人類最豐富的菌種資源庫如何從中篩選出所需的菌種

土壤是微生物生長和棲息的良好基地。土壤具有絕大多數微生物生活所需的各種條件，是自然界微生物生長繁殖的良好基地。其原因在於土壤含有豐富的動植物和微生物殘體，可供微生物作為碳源、氮源和能源。土壤含有大量而全面的礦質元素，供微生物生命活動所需。土壤中的水分都可滿足微生物對水分的需求。不論通氣條件如何，都可適宜某些微生物類群的生長。通氣條件好可為好氧性微生物創造生活條件；通氣條件差，處於厭氧狀態時又成了厭氧性微生物發育的理想環境。土壤中的通氣狀況變化時，生活其間的微生物各類群之間的相對數量也起變化。土壤的 pH 值范圍在 3.5–10.0 之 間，多數在 5.5–8.5 之間。而大多數微生物的適宜生長 pH 也在這一范圍。即使在較酸或較鹼性的土壤中，也有較耐酸、喜酸或較耐鹼、喜鹼的微生物發育繁殖，各得其所地生活著。土壤溫度變化幅度小而緩慢，這一特性極為有利於微生物的生長。如土壤溫度夏季比空氣溫度低，而冬季又比空氣溫度高。土壤的溫度范圍恰是中溫性和低溫性微生物生長的適宜范圍。
因此，土壤是微生物資源的巨大寶庫。
實驗步驟：
一、PDA培養基的配製
1、原料准備：
1000ml水：200g土豆：20g蔗糖：15—20g瓊脂

二、牛肉膏蛋白腖培養基的配製
1、原料准備：
1000ml水：3g牛肉膏：10g蛋白腖：5gNaCl：15—20g 瓊脂

三、倒平皿
1、培養基、培養皿、塗抹棒、槍頭、無菌水等置於高溫滅菌鍋121攝氏度滅菌25min；超凈工作台紫外線消毒20min。
2、將培養基、培養皿、塗抹棒、槍頭、無菌水等移入超凈工作台中。
3、將培養基倒入培養皿（培養皿三分之一容積），在酒精燈火焰附近（火焰周圍10厘米左右）操作。
4、開蓋至冷卻，蓋上蓋子。
四、土壤溶液的配置與塗布
實驗原料：
土壤樣本10g、90ml 無菌水（錐形瓶中）、9ml 無菌水(試管)、培養皿
實驗步驟：
1、電子天平準確稱取10.00 g 土樣，加入90ml 無菌水中，振盪搖勻，酒精擦拭後移入超凈工作台。
2、將試管依次編號1-6，用移液槍移取1000微升懸濁液置於1 號試管，再移取1000微升 1號試管懸濁液置於2號試管，依次做六個試管。
3、塗布
①、用移液槍分別取4、5、6號試管溶液各200微升（每個試管取2—4份）置於培養基中並做好標記（土壤採集地、操作人、溶液濃度級）。
②、用塗抹棒均勻塗抹培養基中的土壤溶液。
（以上均在超凈工作台酒精燈火焰附近操作，確保無菌環境）
4、在恆溫乾燥箱中培養，觀察。
五、菌種的分離純化
1、超凈工作台紫外線消毒20min。
2、將要分離菌株的培養基及倒好平板的培養基，接種環，酒精燈轉移至超凈工作台中。
3、點燃酒精燈，在酒精燈火焰旁操作。
4、將接種環在火焰上灼燒至紅，在火焰旁冷卻後接取菌種。
5、將菌種用劃線法或點種法接於培養基中。
6、取出，移至恆溫培養箱中培養。
7、定期觀察菌種生長情況。

Ⅱ 如何計算土壤微生物的菌數(稀釋塗布法）

土壤中微生物種類很多，根據你想要的菌配製所需要的培養基就行了，很簡單啊。

Ⅲ 從澡堂獲得一種土壤，知道裡面含有嗜熱菌，但不知道是什麼，怎麼把它培養篩選出來進行鑒定！！求詳細步驟！

1、稀釋平板法分離培養：取1克土壤放入滅菌的試管中，加入9毫升無菌水，充分混勻；取出1毫升稀釋液，加入另一隻乘有9毫升無菌水的試管中，充分混勻；再取出1毫升稀釋液，加入另一隻乘有9毫升無菌水的試管中，充分混勻；依次類推，分別稀釋1百倍、1千倍、1萬倍。從不同稀釋倍數的稀釋液中分別取0.1毫升，塗布與細菌培養基平板上（如LB固啟檔李體培養基），放在65℃的培養箱中培養1-5天，直到有明顯的單菌落長出為止。
2、菌種純化：等有明顯的單菌落生長出來後，將不同形態的單菌落，劃線分離純化，在相同的培養條件下，獲得純化的耐熱菌。將這些耐熱菌轉接在新鮮培養基上，在30℃培養，不能生長或生長非常緩慢的可以視為嗜熱菌。
3、菌種鑒定：提取細菌（一般分離出的嗜熱菌都是細菌）的基因組DNA，PCR擴增其16S rDNA，送公司測悄遲序，測序結果與GenBank資料庫中已知序列比對，即可獲得種屬信息。如果再蠢模詳細鑒定，還要做生理生化試驗，並與模式菌株進行比較。

Ⅳ 土壤質量評價的評價指標

土壤質量是土壤的許多物理、化學和生物學性質，以及形成這些性質的一些重要過程的綜合
體現，土壤質量指標則是土壤屬性的外在量度，由於對各種土壤屬性與功能之間的關系，以及形成各種土壤屬性的過程機理等問題尚未十分明確，土壤質量評價體系仍無明確標准，土壤質量的研究仍然只是從不同關心角度進行的嘗試。目前國內外科學家採用的評價土壤質量的指標體系不盡一致，可根據不同的土壤和不同的評價目的，選擇不同的評價指標體系。大致可分為兩類，一類是描述性指標，即定性指標，而不是定量化指標，因此被視為「軟」數據。如土壤顏色、質地、緊實性、耕性、侵蝕狀況、作物長勢、保肥性等，農民往往通過這些描述性指標定性認識土壤質量狀況，但科學家和技術人員不太重視這些指標。另一類是分析性定量指標，選擇土壤的各種屬性，進行定量分析，獲取分析數據，然後確定數據指標的閥值和最適值。
1.根據分析性指標的性質，土壤質量的評價指標分為土壤物理指標、土壤化學指標、土壤生物學指標三方面。
（1）土壤質量的物理指標
土壤物理狀況對植物生長和環境質量有直接或間接的影響。土壤物理指標包括土壤質地及粒徑分布、土層厚度與根系深度、土壤容重和緊實度、孔隙度及孔隙分布、土壤結構、土壤含水量、田間持水量、土壤持水特徵、滲透率和導水率、土壤排水性、土壤通氣、土壤溫度、障礙層次深度、土壤侵蝕狀況、氧擴散率、土壤耕性等。
（2）土壤質量的化學指標
土壤中各種養分和土壤污染物質等的存在形態和濃度，直接影響植物生長和動物及人類健康。土壤質量的化學指標包括土壤有機碳和全氮、礦化氮、磷和鉀的全量和有效量、CEC、土壤pH、電導率（全鹽量）、鹽基飽和度、鹼化度、各種污染物存在形態和濃度等。
（3）土壤質量的生物學指標
土壤生物是土壤中具有生命力的主要部分，是各種生物體的總稱，包括土壤微生物、土壤動物和植物，是評價土壤質量和健康狀況的重要指標之一。土壤中許多生物可以改善土壤質量狀況，也有一些生物如線蟲、病原菌等會降低土壤質量。應用較多的指標是土壤微生物指標，而中型和大型土壤動物指標正在研究階段。土壤質量的生物學指標包括微生物生物量碳和氮，潛在可礦化氮、總生物量、土壤呼吸量、微生物種類與數量、生物量碳/有機總碳、呼吸量/生物量、酶活性、微生物群落指紋、根系分泌物、作物殘茬、根結線蟲等。
2.根據土壤質量評價指標的選擇原則，土壤質量的評價指標分為農藝指標、微生物指標、碳氮指標和生態學指標。
（1）土壤質量評價的農藝指標
對土壤做出適宜性評價，直接與農業的可持續性相關聯，需選擇與土壤生產力和農藝性狀直接有關的參數指標。吳啟堂等(1995)選用了10個參數指標，即①質地，②耕層厚度，③pH，④有機質，⑤全氮，⑥鹼解氮，⑦速效磷，⑧速效鉀，⑨容重，④CEC。對這些參數項目進行分級賦值，可以得到定量評價值，這種以農藝基礎性狀為主的土壤質量評價對於農林業生產具有指導意義。
（2）土壤質量的微生物學指標
土壤微生物是維持土壤質量的重要組成部分，它們對施人土壤的植物殘體和土壤有機質及其它有害化合物的分解、生物化學循環和土壤結構的形成過程起調節作用。土壤生物學性質能敏感地反映土壤質量的變化，是評價土壤質量不可缺少的指標。但由於土壤生物學方面的指標繁多，加上測定方面的難度，下面的指標可供選擇。
①土壤微生物的群落組成和多樣性：土壤微生物十分復雜，地球上存在的微生物約有18萬種之多，其中包含藻類、細菌、病毒、真菌等，1g土壤就含有10000多個不同的生物種。土壤微生物的多樣性，能敏感地反映出自然景觀及其土壤生態系統受人為干擾(破壞)或生態重建過程中的微細的變化及程度。因而是一個評價土壤質量的良好指標。
②土壤微生物生物量：微生物生物量(microbialbiomass，MB)能代表參與調控土壤能量和養分循環以及有機物質轉化相對應微生物的數量。它與土壤有機質含量密切相關，而且微生物量碳或微生物量氮轉化迅速。因此，微生物量碳或微生物量氮對不同耕作方式、長期和短期施肥管理都很敏感。
③土壤微生物活性：土壤微生物活性表示土壤中整個微生物群落或其中的一些特殊種群狀態，可以反映自然或農田生態系統的微小變化。
④土壤酶活性：土壤酶絕大多數來自土壤微生物，在土壤中已發現50-60種酶，它們參與並催化土壤中發生的一系列復雜的生物化學反應。如水解酶和轉化酶對土壤有機質的形成和養分循環具有重要的作用。已有研究表明，土壤酶活性和土壤結構參數有很好的相關性。它可作為反映人為管理措施和環境因子引起的土壤生物學和生物化學變化的指標。
高質量的土壤應具有穩定的微生物群落的組成、生物多樣性及良好的生物活性。土壤徽生物是表徵土壤質量最有潛力的敏感性指標之一。因此，建立土壤質量的微生物學指標受到科學家的重視。美國土壤微生物學家(Kemedy等，1995)根據可接受的測定項目和方法，提出了下面土壤質量微生物學指標體系：①有機碳，②微生物生物量，A總生物量，B細菌生物量，C真菌生物量，D微生物生物量碳、氮比，③潛在可礦化氮，④土壤呼吸，⑤酶活性，A脫氫酶，B磷酸酶，C精氨酸酶，D芳基硫酸酯酶，⑥生物量碳與有機碳比，⑦呼吸量與生物量比，⑧微生物群落，A基質利用，B脂肪酸分析，C核酸分析。
（3）土壤質量的碳氮指標
通常把土壤有機質和全氮量作為土壤質量評價的一個重要指標。其實，更合適的指標是生物活性碳和生物活性氮，它們是土壤有機碳和有機氮的一小部分，能敏感反映土壤質量的變化，以及不同土地利用和管理如耕作、輪作、施肥、殘留物管理等對土壤質量的影響。
所謂生物活性有機碳是通過實驗法和數學抽象法來定義的。前者分離有機碳的活性組分，按有機碳的穩定性劃分為若干組。後者根據土壤有機碳各組分在轉化過程中的流程位置及其穩定性，用計算機模擬建立多個動態碳庫，活性有機碳庫的轉化快，轉化速率常數較大，土壤活性有機氮反映了土壤氮素供應能力，它可被視為一個單獨的氮庫，或根據土壤有機質分解動力學分成幾個組分。活性有機氮，常用3種表示方法：微生物生物量氮(MBN)，潛在可礦化氮(MN)和同位素稀釋法測定活性有機氮(ASN)。MBN主要是微生物生物量N和少量土壤微動物氮。PMN是指實驗室培養測定的土壤礦化氮，包括全部活性非生物量氮及部分微生物生物量氮。ASN是指參與土壤中生物循環過程中的氮，即用同位素稀釋法測定的活性
非生物量氮及固定過程中的微生物生物量氮。（4）土壤質量的生態學指標
物種和基因保持是土壤在地球表層生態系統中的重要功能之一，一個健康的土壤可以滋養和保持相當大的生物種群區系和個體數目，物種多樣性應直接與土壤質量關聯。關於土壤與生態系統穩定性與多樣性的關系，國內已有較多的研究，土壤質量的生態學指標主要有：
①種群豐富度：包括種群個數、個體密度、大動物、節肢動物、細菌、放線菌、真菌等。
②多樣性指數：生物或生態復合體的種類、結構與功能方面的豐富度及相互間的差異性。
③均勻度指數：生物個體或群體在土壤中分布的空間特徵。
④優勢性指數：優勢種群的存在及其特徵。
某些土壤性狀在土壤質量評價中顯得十分重要。美國土壤學家提出了土壤質量分析最小指標矩陣(Papendick，etal，1995)，其參數為：①團聚性(aggregation)，②容重(bulkdensity)，③至硬碟的距離(distancetohardpan)，④滲濾性(infiltration)，⑤電導率(conctivity)，⑥持水率(waterholdingcapacity)，⑦pH，⑧有機質(organicmatter)，⑨可礦化氮(mineralizablenitrogen)，⑩呼吸作用(respiration)。
3.根據土壤質量評價指標涉及的內容，土壤質量指標可分為以下四個方面。
(1)土壤肥力：土壤肥力因素包括水、肥、氣、熱四大肥力因素，具體指標有土壤質地、緊實度、耕層厚度、土壤結構、土壤含水量、田間持水量、土壤排水性、滲濾性、有機質、全氮、全磷、全鉀、速效氮、速效磷、緩效鉀、速效鉀、缺乏性微量元素全量和有效量、土壤通氣、土壤熱量、土壤侵蝕狀況、pH、CEC等。土壤肥力退化主要是指土壤養分貧瘠化，為了維持綠色植物生產，土地(壤)就必須年復一年地消耗它有限的物質貯庫，特別是植物所需的那些必要的營養元素，一旦土壤中營養元素被耗竭，土壤就不能滿足植物生長。
(2)土壤環境質量：背景值、鹽分種類與含量、硝酸鹽、鹼化度、農葯殘留量、污染指數、植物中污染物、環境容量、地表水污染物、地下水礦化度與污染物、重金屬元素種類極其含量、污染物存在狀態及其濃度等。
(3)土壤生物活性：微生物量、C/N、土壤呼吸、微生物區系、磷酸酶活性、脲酶活性等。
(4)土壤生態質量：節肢動物、蚯蚓、種群豐富度、多樣性指數、優勢性指數、均勻度指數、雜草等。 土壤質量評價指標選擇原則
有效性原則：選取的指標能正確反映出土壤的基本功能，是土壤中決定物理、化學及生物學過程的主要特性，對表徵土壤功能是有效的。
敏感性原則：選取的土壤質量指標對土壤利用方式，人為擾動過程，土壤侵蝕強度及程度的變化有足夠敏感的反應。如果所選指標對土壤變化反應不敏感，則對監測土壤質量變化沒有使用價值。但是，指標的敏感性要以監測土壤質量變化的時間尺度而定。
實用性原則：選取的土壤質量指標要易於定量測定，簡便實用。在田間或實驗室測定時，測定過程穩定，測定誤差低，具有較高的再現性與適宜的精度水平。
通用性：影響土壤質量的因素很多，必須立足於綜合的、系統的觀點。通過分析各種土壤特性在土壤質量形成中的主次作用，選取那些有重要影響的指標，尤其是不要遺漏制約土壤生產力的主要指標。另一方面，也不要無限制地擴大指標的選擇面，使整個指標體系復雜化。
一般說來，反映土壤質量與土壤健康的診斷特徵可以分成兩組，一組是描述土壤健康的描述性特徵，另一組是分析性指標，具有定量單位，常為科學家所用。分析性指標通常包括物理指標、化學指標和__生物指標，在土壤質量評價中需要根據不同的土壤、不同的評價目的，按照上述指標選擇原則對這些指標進行取捨組合。
（1）土壤物理指標
由於土壤結構的穩定性控制了生態系統內的許多功能，是土壤最基本的質量指標。在評價土壤質量的基本定量體系中，物理性指標包括：土壤質地、土層和根系深度、土壤容重和滲透率、田間持水量、土壤持水特徵、土壤含水量。Larson和Pierce（1991）提出了用於控制土壤侵蝕或防止地表水和地下水污染的物理指標為：土壤質地、結構和強度，植物有效水和最大紮根深度；Fitzpatriok（1996）則指出土層的厚度、土壤的結構性在景觀中的分布可用來評價土壤與流域過程及土壤生產力，是最通常、簡便的指標，同時指出土壤質地與植物生長和水分運移密切相關，是重要的物理指標。Cass（1996）認為土壤退化的程度與土壤結構穩定性有關，選取土壤分散性、土壤強度、水分吸收速率作為關鍵的物理指標。
（2）土壤化學指標
土壤質量的化學指標包括有機C和N，礦化態的N、P、K、pH、電導率。Duxbury（1994）提出土壤有機質生物活性部分更適於作為土壤質量的指標。Anderson（1990）在考慮評價土壤質量的有機質快速指標時，建議採用微生物活性指標——代謝商。土壤活性有機氮反映了土壤氮素的供應能力，與農業持續發展及環境質量緊密相關，可作為衡量土壤質量的一個重要指標。在測出土壤全N或有機質水平的變化之前，土壤潛在礦化氮（PMN）和土壤活性氮（ASN）的變化就可測到。在確定土壤質量變化時，土壤活性氮是一個靈敏的指標。但是，有關PMN和ASN在年際水平上的動態變化資料不多，進一步的工作是確定如何使用這些參數以及它們各自的局限性。
由於土壤有機質可以對土壤質量和作物產生有益的影響，研究認為SOM是土壤質量的中心指標（美國水土保持學會，1995），甚至把它看作是土壤質量衡量指標中的唯一重要的指標（Larson和Pierce1991；Doran等，1996）。
Singer和Ewing（1999）還強調了污染物對土壤質量的影響，並提出了將污染物的有效性、濃度、活動性和存在狀態作為重要化學指標。
（3）土壤生物指標
土壤中的生物是維持土壤質量的重要組成部分，土壤生物學性質能敏感地反映出土壤質量健康的變化，是土壤質量評價不可缺少的指標。生物學指標包括土壤上生長的植物、土壤動物、土壤微生物，其中，應用最多的是土壤微生物指標，多數研究認為，土壤微生物(包括微生物量、土壤呼吸等)是土壤質量變化最敏感的指標。
Kennedy（1995）提出的土壤質量微生物指標包括生物量、細菌、真菌、土壤呼吸、微生物區系以及與微生物活動有關的參數。Turco（1994）認為一個高質量的土壤應該具有良好的生物活性和穩定的微生物種群組成。在農田系統中，在測定土壤有機質變化之前，微生物群落對土壤的變化就可提供可靠的直接證據。微生物多樣性指標可評價自然或人為干擾對微生物群落的影響，進一步揭示土壤質量在微生物數量和功能上的差異。對土壤微生物多樣性狀況的常規檢測方法仍處於實驗室階段，一般將微生物量作為常規的土壤質量指標。進一步的工作是確定一套評價土壤質量中生物部分的最小參數集，這些指標應同時考慮生物學過程和種群多樣性，能反映干擾的影響，准確評價系統的功能，而且應該是廉價和快速的。
Dick（1994，1996）提出土壤酶活性是作為反映管理措施和環境因子引起的土壤生物學和生物化學變化的指標，尤其是非專一性和水解性的土壤酶活性十分適合這種指標。利用土壤酶活性評價干擾對土壤質量影響時，需要與參照系或特定地區狀況進行比較。為簡化評價步驟，合理評價某個時刻的土壤質量，有些研究者提出了綜合指標，如生物肥力指標、酶數量指標、水解系數指標等，以對酶活性作出評價。對於土壤質量的酶活性指標，科學研究的重點是尋找一個相對或統一的指標；它不需要通過在時間上的多次測定或在處理間的比較來作解釋，統一指標應當是土壤生物學、化學和物理學重要參數的綜合。 在土壤質量調查中，根據評價的目的、對象、區域環境條件、污染源和污染狀況確定調查項目。選擇的參數過少或者過多，都不能反映土壤的綜合污染特性。從理論上講，應選擇那些與土壤質量的形成和變化有重大關系的參數。譬如以有機物污染為主的地區，選擇油、苯並(a)芘、DDT、六六六等。在用生活污水灌溉的地區，主要選擇與一般衛生標准有關的參數，如細菌、病菌、蛔蟲卵等。在沖積扇上部土層薄的地區，為了保護飲用水源，要注意易溶於水的污染物，如酚、氰、氮、磷等。在平原地區則要注意易溶性鹽類。在用含重金屬的工業廢水或礦區廢水灌溉的地區，由於重金屬在土壤中不易遷移而易於累積,應選擇難遷移的重金屬，如汞、鎘、鉛等。
確定調查項目後，一般採用傳統的方法進行調查，在調查中可根據地區的大小選用適當的比例尺以提高調查數值的精確度。比較精確的方法是按方格網路法進行調查。由於方格網路法工作量較大，也可在前一方法調查的基礎上繪出等值線，再以內插法補足每一方格數值,用方格網路表示出來。
評價土壤質量要有一種相對的、可比的單位作為衡量尺度，一般採用土壤質量指數。單個污染物質量指數的一般模式為Pi=Ci/Si。式中Pi為污染指數,或稱分指數；Ci為污染物的實測值；Si為污染物的
評價標准。
綜合質量指數的模式，一般採用單個污染物的質量指數相加，或相加後再平均的方法。即： 式中n 為污染物的種類數。有人利用模糊數學中的系統聚類分析對單個污染物的質量指數進行綜合，效果較好。 為了進行評價，繪制質量圖，要對求出的指數進行分級。分級一般是先定出「開始污染」和「嚴重污染」的起始值，然後將兩者之間的數值根據需要分為若干級。「開始污染」的起始值一般採用土壤背景值。「嚴重污染」的起始值一般以土壤環境質量標准表示，或以作物體內污染物含量超過衛生標准時的土壤中污染物含量來表示。也有人以作物減產到一定程度時土壤中的污染物的
含量作為依據。

Ⅳ 高通量測序中如何判斷土壤微生物數量的多少

在陸地生態系統中，在土壤中生活有數量龐大的微生物種群，包括原核微生物如細菌、藍細菌、放線菌及超顯微結構微生物, 以及真核生物如真菌、藻類( 藍藻除外) 、地衣等。它們與植物和動物有著明確的分工，主要扮演「分解者」的角色，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學反應，擔負著地球C、N、P、S 等物質循環的「調節器」[1 ]、土壤養分植物有效性的「轉化器」和污染環境的「凈化器」等多方面生態功能[2 ]。土壤微生物是氣候和土壤環境條件變化的敏感指標，土壤微生物群落結構和多樣性及其變化在一定程度上反映了土壤的質量。土壤微生物多樣性一般包括微生物分類群的多樣性、遺傳(基因) 多樣性、生態特徵多樣性和功能多樣性[3 ]。由於土壤微生物的復雜性、土壤本身的多變性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人們對土壤微生物多樣性的研究與動、植物相比遠遠落後。隨著多聚酶鏈反應(PCR)、核酸測序等現代生物學分子生物學技術的迅速發展, 人們對土壤微生物多樣性有了更多的了解；高通量測序技術的發展則為研究土壤宏基因組提供了大量數據，為直接探究土壤中的微生物群落結構提供了客觀而全面的信息。
一、對土壤微生物進行研究的方法
1、微生物平板培養法
傳統的土壤生態系統中微生物群落多樣性及結構分析大多是將微生物進行分離培養，然後通過一般的生物化學性狀，或者特定的表現型來分析，局限於從固體培養基上分離微生物。
這種方法只限於極少量（0.1%-1%）可以培養的微生物類群，無法對絕大多數微生物的分類地位和系統發育關系的深入研究。
2、分子生物學技術結合測序的方法
在過去的20多年裡，分子生物學技術，尤其16SrDNA技術已經廣泛應用於鑒定未知菌的研究中。20世紀80年代以來, 逐步建立起了以分子系統發育分析為基礎的現代微生物分子生態學的研究方法, 如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、熒光原位雜交技術(FISH)、基因晶元(Microarry) 、磷脂脂肪酸圖譜分析( Phospholipid fatty acid, PLFA) 、穩定同位素探針( Stable Isotope Probing, SIP) 、PCR-DGGE/TGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 等, 使得研究者能夠在分子水平上對土壤微生物多樣性進行研究。
其中運用比較廣泛並被普遍認可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在於，檢測的DNA片段長度范圍以200bp ～900bp為佳，超出此范圍的片段難以檢測[4]，PCR 擴增所需G/C 鹼基對含量至少達40 % ，通常只能檢測到環境中優勢菌群的存在，只有占整個群落細菌數量約1％或以上的類群能夠通過DGGE檢測到[5]。TGGE 儀器所允許的溫度范圍為15 ℃～80 ℃，較大片段DNA 的Tm 值因為接近80 ℃而使檢測難度提高；若電泳條件不適宜，不能完全保證將有序列差異的DNA片段分開，從而出現序列不同的DNA 遷移在同一位置的現象。
3、高通量測序方法
近年來，16S rRNA/DNA為基礎的分子生物學技術已成為普遍接受的方法[6,7 ]。研究表明，400～600鹼基的序列，足以對環境中微生物的多樣性和種群分類進行初步的估計[8]，因此454高通量測序的方法因其讀長（400~500bp）長和准確性高的特點大量用於微生物多樣性的研究。
有了微生物16S rDNA序列，不論是全長還是部分，都可以提交到GenBank採用BLAST程序與已知序列進行相似性分析。Gen Bank將按照與測得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應的微生物種類，但更為精確的微生物分類還取決於系統發育分析(phylogenetic analysis)。
高通量測序的優越性體現在：測序序列長，可以覆蓋16S /18S rDNA、ITS等高變區域； 測序通量高，可以檢測到環境樣品中的痕量微生物；實驗操作簡單、結果穩定，可重復性強；無需進行復雜的文庫構建，微生物DNA擴增產物可以直接進行測序，實驗周期短；測序數據便於進行生物信息分析。
該方法得到頂級期刊的認可（Nature等），已成為土壤微生物多樣性檢測的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，為客戶提供的土壤樣本進行高通量測序並進行生物信息學分析。高通量測序因其數據量大，操作過程簡單，盡可能避免了繁瑣的實驗操作過程所造成的樣本損失，能夠相對客觀的反應出土壤樣本的真實情況。
二、高通量測序在土壤微生物研究中的應用
1、 研究土壤微生物的物種多樣性
微生物物種多樣性主要從對微生物類群即細菌、真菌和放線菌這三大類群的數量及其比例組成來描述微生物多樣性，或者按照微生物在生態系統中的作用將其劃分成不同的功能群(function group)，通過某一功能群中物種的分類及其數量來研究土壤微生物多樣性，如對土壤中的產甲烷細菌、固氮菌、根瘤菌等的多樣性進行研究。以下是幾篇具有代表性的文章。
Roesch等[9]採用454測序法對西半球的一個大的橫斷面的4類土壤進行檢測和統計學評價。結果表明，這4種土壤中，最豐富的微生物類群擬桿菌綱、β-變形菌綱和α-變形菌綱。與農業土壤相比，森林土壤的微生物多樣性更為豐富，然而檢測結果表明森林土壤中的古生菌多樣性較少，僅為該位點所有序列的0.009%，而農業土壤的比例則為4% -12%。
土壤中細菌的多樣性差距非常大，因土壤結構的不同土壤中的細菌群體也呈現出多樣化。Triplett等[10]基於焦磷酸測序法來對16S rRNA的V2-V3區域進行測序，估測9個草地土壤中的菌群的整體和垂直特性。對所有752,838條數據序列進行聚類分析，探索菌群在豐度、多樣性和組成成分等方面的特異性。作者發現在不同的土壤層中，細菌系統發生的種群或者亞群的不同分配是與土壤的性質有關的，包括有機碳含量、總含氮水平或者微生物生物量。
2、研究土壤微生物功能多樣性
土壤微生物功能多樣性指包括微生物活性、底物代謝能力及與N、P、S 等營養元素在土壤中轉化相關的功能等, 通過分析測定土壤中的一些轉化過程, 如有機碳、硝化作用以及土壤中酶的活性等來了解土壤微生物功能。
氨氧化反應是硝化作用的第一步，也是全球氮循環中由微生物活動形成硝化鹽的重要進程。Leininger[11]檢測了3個氣候區域12塊原始和農業用地的土壤里編碼氨單加氧酶(amoA)的一個亞基的基因豐度。採用反向轉錄定量PCR研究及無需克隆的焦磷酸測序技術對互補DNA測序，證實古細菌的氨氧化活性要遠高於細菌，證實Crenarchaeota可能是土壤生態系統中最富有氨氧化活性的微生物。
Urich等[12]採用基於RNA的環境轉錄組學方法同時獲得土壤微生物種群結構和功能信息。結果認為，通過該方法可以同時研究微生物生種群結構與功能從而避免其他方法所造成的偏差。群落基因組學分析可以通過研究微生物基因組序列與某些表達特徵之間的關系，獲得一些微生物功能方面的信息。但同時也需要運用其他方法將特定功能與具有這種特定功能的微生物群落結構對應起來。對rRNA表達基因和與環境因素相關的主要酶類的基因進行定量化和比較分析，將能了解微生物結構與特定功能之間的關系，如硝化、反硝化和污染物降解。
反硝化作用是參與到氮流失和溫室氣體排放等氮循環過程的重要流程之一。通過宏基因組測序的方法，結合分子檢測和焦磷酸測序，Ryan等分離鑒定了操縱編碼反硝化過程的酶類。通過篩選77,000個土壤宏基因組文庫中得到的克隆，最終分離並鑒定了9個參與反硝化作用的酶簇[13]。
3、 研究環境的突然變化對土壤微生物菌群的影響
環境的突然改變會導致微生物群落的結構和功能發生變化。Zachary等[14]以重水穩定同位素探測技術（H218O-SIP）鑒定與土壤增濕相關的細菌。通過液相色譜/質譜（LC-MS），作者確定H218O中的氧原子結合到了所有的DNA結構成分中。盡管這種結合不是均勻的，還是可以明顯的將標記了18O和未標記的DNA區分開來。作者發現DNA和細胞外的H2O中的氧原子在體外沒有發生交換，表明摻入DNA的18O是相對穩定的，並且摻入到細菌DNA中的18O的比例較高（48-72h）。土壤增濕後，對土壤中16S rRNA進行高通量測序，發現Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相對比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例則降低。作者通過控制土壤濕度的動態變化，對微生物菌群的結構發生變化進行研究和生態類群的劃分。

Ⅵ 如何計算土壤微生物的菌數

計算土壤微生物數量，常見的有兩種方法，一種是傳統的培養法，即平板法，將一定質量的土壤製成則蘆懸嫌虛浮液，稀釋後塗到培養基上，培養18-24h，在顯微鏡下找菌落數目，乘以稀釋倍數，粗略估算細菌數量。但這種方法只能得到可培養的微生物數目，僅占土壤總細菌的1%，另外99%的微生物是不可培養的，用這種方法得到的值只是參考數值；
第二種方法是高通量測序的方法，提取土壤總DNA，通過測定土壤中所有DNA的鹼基序列，與細菌的鹼基序列資料庫比對，得到細菌的名稱（操作分類單位，OTU），根據序列的條數大概估算這類微生物所佔的比例。但這種方法無法區分死亡的細菌和活著的細菌，也有一定孫者帶的局限性。

Ⅶ 土壤微生物的檢測怎麼做，哪裡可以做

土壤微生物是土壤中一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱，嚴格意義上應包括細菌、古菌、真菌、病毒、原生動物和顯微藻類。其個體微小，一般以微米或毫微米來計算，通常1克土壤中有幾億到幾百億個，其種類和數量隨成土環境及其土層深度的不同而變化。它們在土壤中進行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等過程，促進土壤有機物的分解和養分的轉化；那土壤內的微生物如何測定呢，下面喆圖小編帶大家來了解一下。

一、培養方法

（1）稀釋平板塗抹法

具體操作如下：

①准確稱取 10g（精確到 0.001）採集的鮮土，倒入裝有 90 ml 無菌水的 500 ml 的三角瓶中，置於往返震盪機上（120r/min，常溫），震盪 20 min，使土壤充分分散成為土壤懸液。

②將上面的土壤懸液用無菌移液管吸取 5 ml 到 45 ml 稀釋液中，即為 10-2稀釋度，依次按 10倍法稀釋，製成 10-1~-~10-6稀釋度。注意:每次吸取懸液時,在稀釋液中反復吸入和吹出 3-~5 次,減少因管壁吸附而造成的誤差,並使懸液進一步分散,每個稀釋度需要更換無菌吸管吸取懸液。)

③根據各類微生物在土壤中的數量多少選擇適當稀釋度的懸液接種。本實驗選擇細菌的稀釋度為 10-~10-5,放線菌為 10~-10-4,真菌為 10-1~-10-3。 -3-2

④土壤懸液的接種方法:在無菌培養皿中倒入 15~20 ml 選擇性培養基,待凝固後,用 0.2 ml無菌移液槍吸取0.2 ml各稀釋度的土壤懸液,然後立即用塗抹棒將懸液均勻的塗抹於培養基表面。用同一支吸管接種時,從高稀釋度開始,依次接種到低稀釋度。

⑤接種了土壤懸液的培養皿,平放在超凈工作台 20~30 min,使得菌液滲透入培養基內,然後倒置於 28~-30°C 生化培養箱中培養一定時間:細菌 1~-3 天,放線菌 10-~14 天,真菌 3~-7 天。

⑥培養結束後,取出培養皿計數。

(2)稀釋培養法

一系列稀釋度的製作與稀釋平板法相同。根據各類微生物在土壤中數量的多少選擇適當的稀釋度,分別接種 1 ml 稀釋液與製作好的液體培養基中,根據需要做 3~4 次重復,適溫培養。2 三大類土壤微生物培養基的分離三大類土壤微生物的分離採用稀釋平板塗抹法,每個菌種要求做 3 個稀釋度,每個稀釋度做3-4次重復,選取細菌和放線菌的菌落在20~-200之間的培養皿、真菌的菌落在 10-~100 的培養皿計數,並計算三次重復的平均值。每克干土中微生物數量計算式:

每克干土中菌落數=(菌落平均數×稀釋倍數×100%)/(濕土質量×干土)

1, 細菌:牛肉膏蛋白腖培養基:牛肉膏 3g、蛋白腖 5g、瓊脂 18g、蒸餾水 1000 ml、pH 值 7.0-~7.2 。

2, 放線菌:改良高氏 1 號培養基:KNO3 1g,FeSO4·7H2O 0.01g,K2HPO4 0.5g,澱粉 20g,MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、瓊脂 18g、3%重鉻酸鉀溶液 3.3ml、蒸餾水 1000ml、pH 值 7.2~-7.4

3,真菌:馬丁氏培養基(虎紅瓊脂):蛋白腖 5g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、葡萄糖 10g、瓊脂 18.5g、孟加拉紅 0.033g、氯黴素 0.1g、蒸餾水 1000ml。

所有培養基需在濕熱滅菌鍋中121°C滅菌 20-~30min

以上土壤微生物測定方案僅供參考，可以查詢專業公司進行檢測。

Ⅷ 如何調查土壤中微生物種類

真菌類

存在種類龐大且多樣。人類僅了解當中極少部分真菌類的作用，其他的幾乎不清楚。

放線菌類

具有分解黴菌等有機物的能力。多半屬於製造抗生物質的菌類，有抑制病原菌的作用。

絲狀真菌類

也就是種類超過10萬種的黴菌。已知極少部分的絲狀真菌是導致蔬菜生病的病原菌。

藻類

除了水中之外，有許多種藻類也存在在土壤中。有些藻類會吸收空氣中的氮。

蚯蚓

蚯蚓能吃下含有腐殖質的土壤然後排泄出來，是耕土促使土壤團粒化的幫手。

蜱蟎類

小於1MM的土壤動物。土壤列存在許多會捕食、會寄生的蜱蟎類。

原蟲類

移動捕食並且分解有機物的單細胞原生動物，，草履蟲、眼蟲藻等的夥伴。

線蟲類

小於數毫米的微小土壤動物。種類很多，寄生在蔬菜根的僅僅是很少一部分。

甲蟎

0.2~1.5mm的小型草食性土壤動物，也是土壤里最多的土壤動物。通過分解落葉為生。

跳蟲類

小於數毫米的土壤動物，分解黴菌、藻類為生。被稱為「大地的浮游生物」，是物質循環的重要角色。

Ⅸ 如何從復雜的土壤樣本中分離我們所需要的目標微生物

如何從復雜的土壤樣本中分離我們所需要的目標微生物？
有機肥之中有機質的分解轉化是一個復雜的過程，微生物活動在分解轉化過程之中起著重要作用。土壤環境非常適合微生物活動，所以土壤之中天然微生物數量最多。因為土壤之中微生物種類繁多，數量大；一克土壤之中，微生物有幾十種到幾百種，幾億到幾十億個，土壤微生物繁殖迅速，在有機質的轉化和分解之中起著重要作用。土壤微生物包括細菌、放線菌、真菌和藻類。

（1）細菌



細菌是一種單細胞微生物，是土壤之中分布最廣、數量最多的微生物。細菌有三種基本形態：球形、桿狀和螺旋形；有球菌、桿菌和螺旋體（40種）；包括弧菌&41；三種類型。土壤細菌按其營養類型可分為自養菌、兼性自養菌和異養菌。

（2） 真菌



土壤真菌分布廣泛，適應廣泛的酸性條件，在PH4.0條件之下生長良好，對森林土壤有機質的轉化起著重要作用。土壤真菌是異養的。它們必須從土壤有機質之中獲取能量和碳源，並在發育過程之中需要良好的供氧。根據真菌與樹木的關系及其營養類型，真菌可分為腐生真菌、寄生真菌和共生真菌。

（3） 放線菌



放線菌是細長的菌絲體，呈分枝狀或放射狀。它們在土壤之中僅次於細菌。大多數是腐生植物。許多放線菌能分解纖維素、澱粉、脂肪、木質素和蛋白質。

Ⅹ 土壤微生物的新方法

用生物化學技術能快速地檢測土壤酶活性，使土壤酶學研究在60年代後期至80年代比較熱門，其中尿酶、磷酸酶、脫氫酶在土壤中的含量和變化規律研究較多。但土壤酶測定方法用於土壤微生物研究的一個致命弱點是不能直接的反映土壤實際微生物狀況。Visser等對酶檢測用於土壤微生物群落和土壤質量評價提出了懷疑。Skujins(1978)認為脫氫酶本身的生物化學特徵決定了它不可能以胞外酶狀態存在於土壤中。為了解決土壤酶測定中的評判問題，Beck（1984）提出了土壤微生物如微生物量（microbialbiomass）、還原酶（rectase）、水解酶（hydrolase）的適宜指標，然而，這些指標從來沒有被廣泛採用。Beck（1984）和Trasar-Cepedaetal.（1998）認為把酶用於土壤質量評價指標是值得懷疑的，而且缺乏常規可行的酶測定手段，存在葯品昂貴等問題[7，8]。
Community-levelphysiologicalprofiling(CLPP)是由GarlandandMills（1991）提出的另一種酶分析方法，微生物群落降解95種不同單一碳源的能力可一次分析，其中BIOLOGGN微平板較多應用於研究土壤和環境微生物區系。作者採用BIOLOGGN微平板培養分析施用生態有機肥對土壤微生物多樣性和番茄青枯病的影響，結果表明，連作地施用生態有機肥後，番茄青枯病顯著降低，土壤微生物多樣性顯著提高。由於真菌、放線菌的代謝反應不能分解四氮疊茂，此方法只能檢測微生物群落細菌（主要是革蘭氏陰性菌）中快速生長的那部分微生物信息。不同的微生物對同一碳源的利用能力是有差異的，微生物對不同單一碳源的代謝指紋差異並不能簡單地歸納為微生物群落數量和結構的差異，而且土壤微生物在BIOLOG系統中生長時，由於溫育環境的改變引起微生物對野輪搜碳底物實際利用能力的改變，同時在溫育過程中存在適應性問題如代謝補償、代謝適應等。但CLPP方法因快速、簡便而受到人們的歡迎，因而有專用於土壤和環境微生物生態研究的生態微平板（EcoPlates）（Insam，1997）。土壤酶測定方法至今沒有一個標準的參數和測頌歷定標准，不能對土壤微生物生態功能一個准確的答案，若要充分分析土壤特徵，了解不同土壤之間的差異，一定要與其他的方法相配合。 土壤微生物是土壤生態系統桐漏中庫（pool）和流的一個巨大的原動力。土壤酶測定一般要在適宜的條件下測定，不能作為土壤物流的原位評價。庫和流的計算對土壤微生物學家來說很重要，測定土壤微生物呼吸（CO2的釋放量），是較好的微生物群落總代謝活性指標。
N、NO3輸入引起土壤酸化，甚至引起地下水的N污染。氮的分配（N2O、NO等）對氣候變化和臭氧層破壞有極大影響，生物固氮對緩解矛盾有重要的意義，同時也提高農作物產量和減少人類飢餓。從1970年以來，共生和非共生固氮研究很熱烈。土壤微生物學家應用分子生物學技術在轉基因作物和轉基因工程菌方面研究，大大提高了生物固氮效果。許多傳統方法，如N礦化測定，硝化潛力或用於反硝化測定的乙炔抑制方法仍然廣泛使用。應用15N放射性標記方法可詳細地了解土壤中或土壤微生物群落中的N分配和去向。
土壤具有復雜的空間異質性，大多數養分流測定方法不適於田間測定，局限於實驗室模擬，目前有較好的地理信息系統軟體來統計和分析這些數據。Bruckner等（1999）測定土壤理化和生物指標，研究了溫帶松果類森林土壤的的空間差異，發現土壤中某些養分轉化過程需要在一定的生態點進行，如僅在一定團粒粒級范圍內進行。Rasiah等（1999）研究發現不同農業措施會引起土壤緊實度、質地和有機質特性變化。Stenberg等（1998）研究26種不同性質土壤的微生物狀況，也證明土壤有巨大的異質性。