生物中分離蛋白質的方法有哪些

❶ 蛋白質分離純化的5種方法主要有什麼

蛋白質分離純化常用方法有：
1、沉澱，
2、電泳：蛋白質在高於或低於其等電點的溶液中是帶電的，在電場中能向電場的正極或負極移動。根據支撐物不同，有薄膜電泳、凝膠電泳等。
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。
4、層析：
a.離子交換層析，利用蛋白質的兩性游離性質，在某一特定PH時，各蛋白質的電荷量及性質不同，故可以通過離子交換層析得以分離。如陰離子交換層析，含負電量小的蛋白質首先被洗脫下來。
b.分子篩，又稱凝膠過濾。小分子蛋白質進入孔內，滯留時間長，大分子蛋白質不能時入孔內而徑直流出。
5、超速離心：既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。不同蛋白質其密度與形態各不相同而分開。

❷ 生物樣品中蛋白質的處理方法有哪些

一。蛋白質沉澱方法
1.中性鹽鹽析法
⑴在一定的
ph值及溫度條件下，改變鹽的濃度（即離子強度）達到沉澱的目的，稱為「ks」分級鹽析法。
（ks鹽析：固定ph,
溫度，改變鹽濃度）
⑵在一定的離子強度下，改變溶液的ph值及溫度，達到沉澱的目的，稱為「β」分級鹽析法。
（β鹽析：固定離子強度，改變ph及溫度。）
2.等電點沉澱法
蛋白質等電點沉澱法是基於不同蛋白質離子具有不同等電點這一特性，依次改變溶液ph值的辦法，將雜蛋白沉澱除去，最後獲得目標產物。
3.有機溶劑沉澱法
許多能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用於低鹽濃度下沉澱蛋白質。
4.非離子型聚合物沉澱法
20世紀60年代非離子型聚合物開始用於分離血纖維蛋白原和免疫球蛋白，從此高相對分子質量非離子聚合物沉澱蛋白質的方法被廣泛使用，如：聚乙二醇（peg）、聚乙烯吡咯烷酮（pvp）、葡聚糖等。
5.金屬沉澱法
能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環化合物強烈結合的金屬離子，如：mn2+、fe2+、co2+、ni2+、cu2+、zn2+、cd2+；
能與羧酸結合而不與含氮化合物結合的金屬離子，如：ca2+、ba2+、mg2+、pb2+；
與巰基化合物強烈結合的金屬離子，如：hg2+、ag+、pb2+。
實際使用時，金屬離子的濃度常為0.02
mol/l。
6.親和沉澱
初始階段：將一個目標蛋白質與鍵合在可溶性載體上的親和配體絡合成沉澱；
所得沉澱物用一生中適當的緩沖溶液進行洗滌，洗去可能存在的雜質；
用一種適當的試劑將目標蛋白質從配體中離解出來。
7.選擇性變性沉澱法
（1）例如對於α-澱粉酶等熱穩定性好的酶，可以通過加熱進行熱處理，使大多數雜蛋白受熱變性沉澱而被除去。
（2）根據欲分離物質所含雜質的特性，通過改變ph值或加進某些金屬離子等使雜蛋白變性沉澱而被除去。
8.反膠束萃取蛋白質
菌體細胞提取
固液分離是生物產品生產中的重要單元操作。培養基、發酵液、某些中間產品和半成品等都需進行固液分離。發酵液由於種類多、粘度大及成分復雜，其固液分離最為困難。
固液分離的方法很多，生物工業中常規的方法有分離篩、重力沉降、浮選分離、離心分離和過濾等，其中用於發酵液固液分離的方法主要是離心分離和過濾。
二。超濾膜濾去。

❸ 分離和提純蛋白質的方法

1. 前處理
把蛋白質從原來的組織或溶解狀態釋放出來,保持原來的天然狀態,並不丟
失生物活性.常用的方法：勻漿器破碎、超生波破碎、纖維素酶處理以塌高及溶菌酶等.
超聲波破碎法：當聲波達到一定頻率時,使液體產生空穴效應使細胞破碎的技術.超聲波引起的快速陵森振動使液體局部產生低氣壓,這個低氣壓使液體轉化為氣體
,即形成很多小氣泡.由於局部壓力的轉換,壓力重新升高,氣泡崩潰.崩潰的氣泡產生一個振動波並傳送到液體中,形成剪切力使細胞破碎.
2． 粗分級
分離可用鹽析、等電點沉澱和有機溶劑分級分離等方法.這些方法的特點是簡便、處理量大,
3． 細分級
樣品的進一步純化.樣品經粗分離以後,一般體積較小,雜蛋白大部分已被團汪尺除去.進一步純化,一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等.必要時還可選擇電泳、等電聚焦等作為最後的純化步驟.
結晶是最後的一步

❹ 蛋白質分離方法有哪些,它們的特點各是什麼

1.根據分子大小不同進行分離純化
蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白
質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離.根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等.透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法.透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離.超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程.這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開.它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽.由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小.所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果
離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法.當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開.例如,在從大米渣中提取蛋白質的實驗中,加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後,再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離[3].使蛋白質在具有密度梯度的介質中離圓舉心的方法稱為密度梯度(區帶)離心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根據所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度.密度梯度離心曾用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產品純度高但產量偏低.蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白.凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最桐芹有效的方法之一.凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構,而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠局腔畢珠之間的空隙向下運動並最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子後流出柱外.目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠等.在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1].凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質[7].
2.根據溶解度不同進行分離純化
影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等.但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的.常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等.
等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法.每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最
低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解.因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質.王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%.李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來.等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取.李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8.他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73·78%.另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11].利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12].
蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析.應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多.在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%[10].鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產.由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性.為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%.利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13].
有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質.例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14].由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性.因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決.對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液.冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白.冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15].
萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質.雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取.此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高.對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎.目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中.採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16].
反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的.反膠團是當表面活性劑
在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體.這種方法的優點是萃取過程中蛋
白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護.程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質.
3.根據電荷不同進行分離純化
根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類.
在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這
種現象稱為電泳.聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質.它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少.等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定.利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的.在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶.孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用.結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大.
離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法.離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成.帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂.離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化.當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同.陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來.反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來.李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純.另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7].
4. 利用對配體的特異親和力進行分離純化
親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法.它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高.應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件.近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20].親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21].范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達到62·5%.該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定.

❺ 蛋白質分離提純方法

1、鹽析法：

鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出。

2、有機溶劑沉澱法：

有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。

3、蛋白質沉澱劑：

蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用，常見的有鹼性蛋白質、凝集素和重金屬等。

4、聚乙二醇沉澱作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用。

(5)生物中分離蛋白質的方法有哪些擴展閱讀：

吸附層析

1、吸附柱層析

吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。

2、薄層層析

薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。

3、聚醯胺薄膜層析

聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。

層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。

❻ 蛋白質的提取方法有哪些

眾所周知，人的生命活動不能缺少蛋白質，很多食物裡面都含有蛋白質成分，正常的飲食可以為身體補充蛋白質。實際上，在生物化學研究領域，蛋白質的分離提取技術具有廣泛的應用，想要把蛋白質提取出來非常不容易，需要經過很多工序，並且要找到專業的操作技術，現在有下列這些方法可以提取蛋白質。
1、超速離心法
此法分離和純化抗原的原理是利用各顆粒在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的顆粒處於不同密度梯度層內，達到彼此分離的目的。常用的密度梯度介質有蔗糖、甘油、CsCl等。
用超速離心或梯度密度離心分離和純化抗原時，除個別成分外，極難將某一抗原成分分離出來，故只用於少數大分子抗原的分離，如IgM、C1q，甲狀腺球蛋白等，以及一些比重較輕的抗原物質如載脂蛋白A、B等。多數的中、小分子量蛋白質採用此種方法很難純化。
2、選擇性沉澱法
其原理多襪雀根據各蛋白質理化特性的差異，採用各種沉澱劑或改變某些條件促使蛋白質抗原成分沉澱，從而達到純化的目的。最常用的方法是鹽析沉澱法。
鹽析法的原理
蛋白質在水溶液中的溶解度取決於蛋白質分子表面離子周圍的水分子數目，亦即主要是由蛋白質分子外周親水基世橋團與水形成水化膜的程度以及蛋白質分子帶有電荷的情況決定的。蛋白質溶液中加入中性鹽後，由於中性鹽與水分子的親和力大於蛋白質，致使蛋白質分子周圍的水化層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質溶液後由於離子強度發生改變，蛋白質表面的電荷大量被中和，更加導致蛋白質溶解度降低，使蛋白質分子之間聚集而沉澱。由於各種蛋白質在不同鹽濃度中的溶解度不同，不同飽和度的鹽溶液沉澱的蛋白質不同，從而使之從其他蛋白分離出來。最常用的鹽溶液是33%～50%飽和度的硫酸銨。鹽析法簡單方便，可用於蛋白質抗原的粗提，丙種球蛋白的提取，蛋白質的濃縮等。鹽析法提純的抗原純度不高，只適用抗原的初步純化。
3、凝膠層析法
凝膠層析是利用分子篩作用對蛋白質進行分離。凝膠是具有三維空間多孔網狀結構的物質，經過適當的溶液平衡後，裝入層析柱。一種含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經凝膠層析柱時，大分子物質不易進入凝膠顆粒的微孔，只能分布於顆粒之間，因此在洗脫時向下移動的速度較快，最先被洗脫。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，洗脫時向下移動的速度較慢，隨後被洗脫。因此，蛋白質分子按分子大小被分離。
4、離子交換層析法
離子交換層析的原理是利用一些帶離子基團的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質抗原。由於各種蛋白質的等電點不同，所帶的電荷量不同，與纖維素（或凝膠）搜好猛結合的能力有差別。當梯度洗脫時，逐步增加流動相的離子強度，使加入的離子與蛋白質競爭纖維素上的電荷位置，從而使吸附的蛋白與離子交換劑解離。
在離子交換色譜技術中常用的離子交換劑有以下幾種
①具有離子交換基團的纖維素，如羧甲基（CM）纖維素、DEAE-纖維素
②具有離子交換基團的交聯葡聚糖、瓊脂糖和聚丙烯醯胺
③凝膠合成的高度交聯樹脂。
5、親和層析
親和層析是利用生物大分子的生物特異性，即生物大分子間所具有專一親和力而設計的層析技術。例如抗原和抗體、酶和酶抑制劑（或配體）、酶蛋白和輔酶、激素和受體、IgG和葡萄球菌蛋白A（SPA）等物質間具有一種特殊的親和力。例如提純IgG時，可將SPA吸附在一個惰性的固相基質（如Speharose2B、4B、6B等）上，並制備成層析柱。當樣品流經層析柱時，待分離的IgG可與SPA發生特異性結合，其餘成分不能與之結合。將層析柱充分洗脫後，改變洗脫液的離子強度或pH值，IgG與固相基質上的SPA解離，收集洗脫液便可得到欲純化的IgG。

❼ 蛋白質的分離方法有哪些它們各依據蛋白質的什麼性質或特點

（一）水溶液提取法
稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑,通常用量是原材料體積的1-5倍,提取時需要均勻的攪拌,以利於蛋白質的溶解.提取的溫度要視有效成份性質而定.一方面,多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大,因此,溫度高利於溶解,縮短提取時間.但另一方面,溫度升高會使蛋白質變性失活,因此,基於這一點考慮提取蛋白質和酶時一般採用低溫（5度以下）操作.為了避免蛋白質提以過程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸,碘乙酸等）.
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇.
1、pH值
蛋白質,酶是具有等電點的兩性電解質,提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH
范圍內.用稀酸或稀鹼提取時,應防止過酸或過鹼而引起蛋白質可解離基團發生變化,從而導致蛋白質構象的不可逆變化,一般來說,鹼性蛋白質用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白質用偏鹼性的提取液.
2、鹽濃度
稀濃度可促進蛋白質的溶,稱為鹽溶作用.同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合,具有保護蛋白質不易變性的優點,因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽,一般以0.15摩爾.升濃度為宜.緩沖液常採用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液.
（二）有機溶劑提取法
一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶,不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀鹼中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑,它們具的一定辯皮的親水性,還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液.但必須在低溫下操作.丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越,一是因為丁醇親脂性強,特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性,在溶解度范圍內（度為10%,40度為6.6%）不會引起酶的變性失活.另外,丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣,也適用於動植物及微生物材料.
二、蛋白質的分離純化
蛋白質的分離純化方法很多,主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質的溶解度增加,此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時,蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出,這種現象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質溶液中,高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力,可奪取蛋白質分子的水化層,使之「失水」,於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出.鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好.由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱.
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外,一般可在室溫中進行.一般溫度低蛋白質溶介度降低.但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低,更容易鹽析.（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低.（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時,欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）.因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質含量在2.5-3.0%.
蛋白質鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等.
其中應用最多的硫酸銨,它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M,即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M,即676克/升）,在這一溶解度范圍內,許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質變性.硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間,當用其他pH值進行鹽析時,需用硫酸或氨水調節.
蛋白質在用鹽析沉澱分離後,需要將蛋白質中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙）,用緩沖液進行透析,並不斷的更顫睜換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進行.此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短.
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質的等電點有差別,可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結合用.
3、低溫有機溶劑沉澱攜洞差法
用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數蛋白質溶解度降低並析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質較易變性,應在低溫下進行.
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開.
超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質分子通過半透膜,而蛋白質留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質.
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一.柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex
ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）.
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同,可將其分開.
1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下,因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開.值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質作為載體,電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度,當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時,到達各自等電點的pH位置就停止,此法可用於分析和制備各種蛋白質.
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT
FACE="宋體"
LANG="ZH-CN">纖維素）,當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上,隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來.（詳見層析技術章）
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity
chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法,它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來,而且純度很高.這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合.其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在,每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質,因此蛋白質的分離（Separation）,提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分,至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來,因此往往採取幾種方法聯合使用.
細胞的破碎
1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液,放置於筒內約1/3體積,蓋緊筒蓋,將調速器先撥至最慢處,開動開關後,逐步加速至所需速度.此法適用於動物內臟組織、植物肉質種子等.
2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中,再套入研桿來回研磨,上下移動,即可將細胞研碎,此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高,適用於量少和動物臟器組織.
3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液,使細胞急劇震盪破裂,此法多適用於微生物材料,用大腸桿菌制備各種酶,常選用50-100毫克菌體/毫升濃度,在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾,此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱,應採取相應降溫措施.對超聲波敏感和核酸應慎用.
4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍,室溫融解,反復幾次,由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹,使細胞結構破碎.
5、化學處理法：有些動物細胞,例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞,細菌細胞壁較厚,可採用溶菌酶處理效果更好.
無論用哪一種方法破碎組織細胞,都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中,使大分子生物降解,導致天然物質量的減少,加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺醯氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,還可通過選擇pH、溫度或離子強度等,使這些條件都要適合於目的物質的提取.
濃縮、乾燥及保存
一、樣品的濃縮
生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀,為了保存和鑒定的目的,往往需要進行濃縮.常用的濃縮方法的：
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低,減壓的真空度愈高,液體沸點降得愈低,蒸發愈快,此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮.
2、空氣流動蒸發濃縮
空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液,表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室,用電扇對准吹風,使透過膜外的溶劑不沁蒸發,而達到濃縮目的,此法濃縮速度慢,不適於大量溶液的濃縮.
3、冰凍法
生物大分子在低溫結成冰,鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中,操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體,然後緩慢地融解,利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的.如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時,不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面,蛋白質和酶則集中於下層溶液中,移去上層冰塊,可得蛋白質和酶的濃縮液.
4、吸收法
通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮.所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應,對生物大分子不吸附,易與溶液分開.常用的吸收劑有聚乙二醇,聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等,使用聚乙二醇吸收劑時,先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡,外加聚乙二醇復蓋置於4度下,袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積.
5、超濾法
超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法,不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時,溶劑和小分子透過,大分子受阻保留,這是近年來發展起來的新方法,最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽,並具有成本低,操作方便,條件溫和,能較好地保持生物大分子的活性,回收率高等優點.應用超濾法關鍵在於膜的選擇,不同類型和規格的膜,水的流速,分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同,必須根據工作需要來選用.另外,超濾裝置形式,溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響.Diaflo
超濾膜的分子量截留值：
膜名稱分子量截留值孔的大的平均直徑
XM－300300,000140
XM－200100,00055
XM－5050,00030
PM－30 30,00022
UM－2020,00018
PM－1010,00015
UM－21,00012
UM05500 10
用上面的超濾膜製成空心的纖維管,將很多根這樣的管攏成一束,管的兩端與低離子強度的緩沖液相連,使緩沖液不斷地在管中流動.然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中.當緩沖液流過纖維管時,則小分子很易透過膜而擴散,大分子則不能.這就是纖維過濾秀析法,由於透析面積增大,因而使透析時間縮短10倍.
二、乾燥
生物大分子制備得到產品,為防止變質,易於保存,常需要乾燥處理,最常用的方法是冷凍乾燥和真空乾燥.真空乾燥適用於不耐高溫,易於氧化物質的乾燥和保存,整個裝置包括乾燥器、冷凝器及真空乾燥原理外,同時增加了溫度因素.在相同壓力下,水蒸汽壓隨溫度下降而下降,故在低溫低壓下,冰很易升華為氣體.操作時一般先將待乾燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體,然後在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去.此法干後的產品具有疏鬆、溶解度好、保持天然結構等優點,適用於各類生物大分子的乾燥保存.
三、貯存
生物大分子的穩定性與保存方法的很大關系.乾燥的製品一般比較穩定,在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化,貯藏要求簡單,只要將乾燥的樣品置於乾燥器內（內裝有乾燥劑）密封,保持0－4度冰箱即可,液態貯藏時應注意以下幾點.
1、樣品不能太稀,必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏,樣品太稀易使生物大分子變性.
2、一般需加入防腐劑和穩定劑,常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等.蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等,如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性.此外,鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用.核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標准緩沖液中.
3、貯藏溫度要求低,大多數在0度左右冰箱保存,有的則要求更低,應視不同物質而定.

❽ 蛋白質分離方法有哪些它們的特點各是什麼

據蛋白質分子大小不同進行分離改碧悔的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。

透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法。

透析是將待分離的混合物放核正入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離。超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程。

這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開。

它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方慧模法除去引入的無機鹽。

由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果。

❾ 常用的蛋白質分離純化方法有哪幾種

分離蛋白質混合物的各種方法主要是根據蛋白質在溶液中的以下性質：1）分子大小；2）溶解度；3）電荷；4）吸附性質；5）對其它分子的生物學親和力等進行分離.
常見的分離提純蛋白質的方法有：1、鹽析與有機溶劑沉澱：在蛋白質溶液中加入大量中性鹽,以破壞蛋白質的膠體性質,使蛋白質從溶液中沉澱析出,稱為鹽析.常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等知鄭.鹽析時,溶液的pH在蛋白質的等電點處效果最好.凡能與水以任意比例混合的有機溶劑,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白質沉澱.2、電泳法：蛋白質分子在高於或低於其pI的溶液中帶凈的負或正電荷,因此在電場中可以移動.電泳遷移率的大小主要取決於蛋白質分子所帶電荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超濾性質,可將大分子搭盯頌物質與小分子物質分離開.4、層析法：利用混合物中各組分理化性質的差異,在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離.主要有離子交換層析,凝膠層析,吸附則前層析及親和層析等,其中凝膠層析可用於測定蛋白質的分子量.5、分子篩：又稱凝膠過濾法,蛋白質溶液加於柱之頂部,任其往下滲漏,小分子蛋白質進入孔內,因而在柱中滯留時間較長,大分子蛋白質不能進入孔內而徑直流出,因此不同大小的蛋白質得以分離.6、超速離心：利用物質密度的不同,經超速離心後,分布於不同的液層而分離.超速離心也可用來測定蛋白質的分子量,蛋白質的分子量與其沉降系數S成正比.