❶ 免疫組化原理、流程及結果分析
免疫組化原理
免疫組化染色是用一抗與被檢測組織中目的蛋白抗原結合，然後用HRP等標記的二抗與一抗進行結合，最後通過與DAB顯色劑反應，進而確認所要檢測蛋白抗原的定位、半定量等目的。
免疫組化更多的意義在於查看目的蛋白的定位。定量一般用western來實現。
免疫組化染色和HE染色的不同之處可能是HE染色比較粗略地辨認不同細胞形態學改變；而後者能夠針對特異性細胞標志物來檢測特異性細胞的改變（數量）、也可檢測細胞內細胞因子的轉位，組織中一些特異性蛋白的表達的量改變（通過圖像分析系統分析顏色深淺、分布的面積等綜合分析）。
通俗的講，HE僅僅是看大體病理改變，比如組織壞死，比如炎性滲出。免疫組化，看你的目的蛋白的表達情況。
免疫組化和****HE****染色的對比
DAB和HE一樣也是一種染色劑，HE染色相對簡單，能分辨出細胞中的嗜酸嗜鹼性物質；DAB染色全稱應該叫做免疫組化DAB染色，經過一系列復雜的生化反應後，DAB(二氨基聯苯胺)染色劑能將辣根過氧化物酶染成棕色。
常用的免疫組化染色方法:
組化用HRP的話，信號不夠強。通常用生物素標記HRP來增強信號。
1、 ABC法（卵白素-生物素-過氧化物酶復合物法）
ABC法是利用卵白素與生物素特有的高度親和力特性，與生物素化二抗結合，形成抗原＋特異性抗體＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP復合物，最後DAB顯色。
復合物配製：先將生物素與酶結合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物素-過氧化物酶復合物。
2、 SP法（抗生物素蛋白鏈酶素-過氧化物酶復合物）
本身沒有連接生物素，但有兩個生物素親和力極高的結合位點，可以與二抗上的生物素結合，敏感性高，復合物不需要使用前混合，更為簡便。
3、 PAP法
4、 直接法
樣本制備
免疫組化結果分析
免疫組化結果的判斷原則：
1 、必須設陽性對照和陰性對照。
2 、 抗原表達必須在特定部位。
3 、 陰性結果不能視為抗原不表達。
免疫組化染色實驗組與對照組結果分析表
從表可以看出只有6、7實驗結果有意義。1-5均因對照組的結果已否定Ab的特異性或IHC技術操作存在錯誤等而使實驗結果失去意義，必須重復實驗或換用Ab。
染色失敗的幾種情況及原因:
1、 所染的全部切片均為陰性結果，包括陽性對照在內。
2、 所有切片均呈陽性反應。
3、 所有切片背景過深。
4、 陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。
所有切片呈陽性反應，其原因:
1、 切片在染色過程中抗體過濃，或乾片了。
2、 緩沖液配置中未加氯化納和PH值不準確， 洗滌不徹底。
3、 使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反 應時間過長。
4、 抗體溫育的時間過長。
5、 H 2 O 2 濃度過高，呈色速度過快且粘附劑太厚。
所有切片背景過深，其原因:
1、 內源性過氧化酶沒有完全阻斷。
2、 切片或塗片過厚。
3、 漂洗不夠。
4、 底物呈色反應過久。
5、 蛋白質封閉不夠或所用血清溶血。
6 、使用全血清抗體稀釋不夠。
陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。
最常見的原因:標本固定和處理不當。
注意事項：
1、 蘇木素復染時間需要摸索，尤其要考慮陽性染色的位置。
2、 切片脫蠟和水化要充分；加反應液時要覆蓋組織充分；每次加液前甩乾洗滌液，但又防止乾片。
3、 以下原因可能導致片子著色不均勻：
①脫蠟不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鮮的二甲苯中。
②水化不全。應經常配製新鮮的梯度乙醇。
③抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑。④抗體孵育時，切片放傾斜。
⑤抗體孵育後PBS沖洗不充分。
⑥製片厚薄不均勻等問題。
⑦染片盒不平，切片傾斜。
4、 一抗的清洗:
1、單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。
2、溫柔沖洗，防止切片的脫落，推薦用浸洗方式。
3、沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去 結合的物質。
5、 PBS的PH和離子強度的使用：
1、建議PH在7.4-7.6濃度是0.01 M。
2、中性及弱礆性條件（PH7-8）有利 於免疫復合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫復合物的形成，而高離子強度則有利 於分解。
6、 拍照：
1、有條件的話應該立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。
❷ 生物素——親合素原抗在實際應用中有巨大優勢主要體現在哪些方面
主要表現在以下幾個方面。
1放射免疫測定中的應用
BAS主要與免疫放射分析（IRMA）檢測體系偶聯，用於對終反應的放大（BA法）：先將針對不同抗原決定簇的固相抗體和生物素化抗體與抗原（標准抗原和待測抗體）同時反應，在固相載體表面形成雙抗體夾心免疫復合物；再加入125I標記的親和素（或鏈霉親和素）與復合物中的生物素結合，最終使反應信號放大，進一步提高IRMA的靈敏度。如該系統用於測定促甲狀腺激素（TSH）時，由於方法的高靈敏性，即可將甲亢患者降低的TSH水平與正常值低限有效地予以區別。此外，BAS也可用於IRMA反應後B、F成分的分離：先將生物素化的McAb和放射性核素標記的McAb與抗原的不同抗原決定簇結合，反應平衡後，加入表面偶聯有親和素的聚苯乙烯珠與免疫復合物中的生物素連接成固相終產物。該法的優點是克服了其他IRMA法需多次離心的麻煩．待測復合物與固相結合更牢固，操作更簡便。
2在分子生物學中的應用
BAS在分子生物學領域中的應用日漸增多，目前主要集中在以生物素標記核酸探針進行的定位檢測，用BAS制備的親和吸附劑進行基因的分離純化以及將免疫測定技術與PCR結合建立免疫—PCR（immuno-PCR）用於抗原的檢測等三方面。
❸ 如何純化生物素標記的IgG
如何純化生物素標記的IgG
EMSA結合反應：(1) 如下設置EMSA結合反應陰性對照反應：Nuclease-Free Water 7微升EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) 2微升細胞核蛋白或純化的轉錄因子 0微升標記好的探針 1微升總體積 10微升樣品反應：Nuclease-Free Water 5微升EMSA/Gel-Shift結合...
BAS-ELISA是在常規ELISA原理的基礎上，結合生物素(B)與親和素(A)間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統。生物素很易與蛋白質(如抗體等)以共價鍵結合。這樣，結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應，既起到了多級放大作用，又由於酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。
BAS用於檢測的基本方法可分為三大類。
第一類是標記親和素連接生物化大分子反應體系，稱BA法，或標記親和素生物素法(LAB)。
❹ 生物素化抗體
在做western blot或免疫組化時我們常使用一抗二抗來放大、顯示抗原，用酶或熒游標記二抗。生物素化的抗體，是在抗體上連接生物素（biotin），生物素能和親和素（avitin）特異性高親和性結合，親和力是抗原抗體結合的一萬倍，而且一個avitin可以結合四個biotin，這樣又起到級聯放大的作用。所以能更加靈敏的顯示微量抗原。這種方法也叫親和免疫組化。
❺ gbs生物活化素
生物素的活化與活化生物素的標記2007-01-12 03:33 1． 生物素的活化
生物素預先活化後，通過噻吩環的戊酸側鏈上羧基與抗體、酶等生物大分子以醯胺鍵偶聯。活化生物素的制備是獲得高敏感度BAS制劑的關鍵環節。常用方法有以下幾種：
1） 生物素N—羥基丁二醯亞胺酯（biotinyl-N-hydroxy-succinnimide，BNHS）的制備：
取生物素1g混懸於12 ml，N,N-二甲基甲醯胺(DMF)，加人0．6g N-羥基丁二醯亞胺(HOSU)和0. 8 g二環己基碳二亞胺(DCC)，置於密閉容器內，室溫下磁力攪拌作用過夜。過濾，濾液經旋轉蒸干。加10mL乙醚洗滌，繼加200 ml異丙醇使其重結晶，獲得白色粉末狀晶體。
BNHS酯鍵中的-C=0基團可與蛋白質分子中賴氨酸的氨基結合，使生物素標記在蛋白分子上，含賴氨酸殘基越多，或蛋白質的等電點在pI 6.0以上，其標記效果越好。因此，BNHS適用於標記抗體及中性和偏鹼性的抗原。
2）長臂活化生物素(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS)的制備
生物素的分子量僅為244.31，當與抗體或酶結合後應用於免疫試驗時，極易受到大分子蛋白空間位阻效應(steric hindrance)的影響。使用長臂生物素可以減少位阻效應，提高試驗的靈敏度。長臂生物素是在生物素和N-羥基丁二醯亞胺之間添加2分子6－氨基己糖，猶如給生物素分子增添一隻手臂，使其不受位阻效應影響，更易與抗體、酶等生物大分子結合而發揮作用、BCNHS的制備過程分為兩步：先製成長臂生物素，然後再使其活化。
長臂生物素的制備：稱取BNHS 3 41 mg ,6-氨基己糖鹽酸鹽200mg，溶解於5mLDMF，再加入0.152 mL三乙胺(TEA)，室溫攪拌下作用20h。蒸發去除DMF，加l mmol/L NaOH 3mL，繼加甲醇至溶液變清，攪拌2h。蒸發去甲醇，加10mL蒸餾水，攪拌下滴加濃鹽酸酸化至剛果紅指示劑恰好變色。室溫靜置2h後，移放冰箱過夜。收集白色固體物，乾燥後用水重結晶，再經真空乾燥，所得物即為長臂生物素，平均獲得率為64％。熔點為206-215℃。
長臂生物素的活化：稱取長臂生物素357mg溶於DMF10ml 。中，加HOSU 130 mg和適量縮合劑，室溫攪拌下作用48h。過濾，收集濾液蒸發干，加乙醚洗滌後，用無水異丙醇10－15ml重結晶。所得粉末狀固體即為活化長臂生物素，平均獲得率為41％，熔點為156-162℃。
3) 生物素醯肼(biotin hydrazide，BHZ)的制備
BHZ是水合肼(hydrazine hydrate)與生物素的合成物，因在生物素的羧基側鏈上帶有肼基，故能標記帶醛基的蛋白質。
BHZ制備過程：取10生物素和氯化亞碸0.1 ml，在攪拌下緩慢加入冰冷的無水甲醇1ml中。溶解後放置28℃24h，繼經真空乾燥；加無水甲醇lml，待溶解後再次真空乾燥。殘余物溶於0.5mL無水甲醇，並緩慢加入水合肼0.1ml，置28℃24h後用濾紙過濾，沉澱物用乙醚20ml反復淋洗，最後用DMF l0 ml淋洗，移置37℃溫箱內烘乾，放4℃保存備用。
BHZ主要用於標記偏酸性的糖蛋白。如在其側鏈上添加1分子賴氨酸作為連接臂，可使生物素免受位阻作用，更易與親合素結合。
4）肼化生物胞素 (biocytin hydazide ，BCHZ)的制備 生物胞素為ε生物素賴氨酸，是生物素通過C=O基與賴氨酸的ε-氨基連接生成的化合物。BCHZ可與蛋白質的醛基和氨基結合，優於只能與醛基結合的BHZ。
BCUZ制備過程：取生物胞素甲酯100mg溶於甲醇2 ml，加入無水肼0.1 ml，25℃反應48h.濃縮至近乎乾燥時，在H2SO4乾燥裝置中減壓抽干，直至只測出少量的肼。產物溶於l ml蒸餾水中，通過聚苯乙烯型色譜固定相Q去肼。BCHZ可在熱乙醇中結晶。
2．生物素結合物的制備
經過活化的生物素及其衍生物可以和各種蛋白質(包括抗體、葡萄球菌A蛋白、酶、激素等)、多肽、多糖、核酸及核素、熒光素、膠體金等結合；並可藉助交聯劑與細胞、瓊脂糖珠等偶聯。廣泛應用於免疫學、細胞生物學和分子生物學的實驗研究領域，以及作為親和分離制劑，用於相應配基的分離與純化。以下重點介紹生物素化抗體、抗原及酶結合物的制備方法。
1）生物素化抗體制備
(1)BNHS溶液lmg／ml以二甲亞碸(DMSO)制備。
(2)將待偶聯的抗體溶液以0．1m01／LpH9．0NaHCO。配成1—2mg／m1。
(3)將BNHS與待偶聯抗體(如IgG)按1：8混合，室溫攪拌4h。
(4)4℃條件下使上述混合液體以o．05m01兒，pH7．2PBS透析過夜，加等體積甘油
或0．02％NaN：一30℃分裝存放。
生物素化抗體應避免反復凍融，按使用需量分裝小瓶。一旦啟封稀釋使用，勿繼續凍存保留。
2）生物素化辣根過氧化物酶(bio—HRP)制備：
(1)取BNHS(MW454)2．?mg溶於4m1DMF。
(2)以0．1m01兒pH8．4的NaHC02配製5mg／m1的HRP，按BNHS：HRP為1：8
混合(應將BNHS溶液緩慢加至HRP溶液)。置22℃反應4h。；
(3)上述混合液於4℃條件下對0．01m01兒pH7．4PBS透析，48h，中間換液8次以上。
(4)收集透析液加等量甘油混合，或加o．02％NaN，分裝，-20℃存放。