什麼叫微生物的生長量

A. 微生物復習-微生物的生長繁殖及其控制

第五章 微生物的生長繁殖及其控制
重點：細菌生長曲線的定義、各時期的特點、應用及生產指導意義。控制微生物生長繁殖及控制微生物生長的條件及原理。

微生物在適宜的環境條件下，不斷地吸收營養物質，並按照自己的代謝方式進行代謝活動，如果同化作用大於異化作用，則細胞質的量不斷增加，體積得以加大，於是表現為生長。簡單地說，生長就是有機體的細胞組分(constituent)與結構在量方面的增加。單細胞微生物如細菌，生長往往伴隨著細胞數目的增加。當細胞增長到一定程度時，就以二分裂方式，形式兩個基本相的子細胞，子細胞又重復以上過程。在單細胞微生物中，由於細胞分裂而引起的個體數目的增加，稱為繁殖。在多細胞微生物中，如某些黴菌，細胞數目的增加如不伴隨著個體數目的增加，只能叫生長，不能叫繁殖。例如菌絲細胞的不斷延長或分裂產生同類細胞均屬生長，只有通過形成無性孢子或有性孢子使得個體數目增加的過程才叫做繁殖。
在一般情況下，當環境條件適合，生長與繁殖始終是交替進行的。從生長到繁殖是一個由量變到質變的過程，這個過程就是發育。
微生物處於一定的物理、化學條件下,生長、發育正常，繁殖速率也高；如果某一或某些環境條件發生改變，並超出了生物可以適應的范圍時，就會對機體產生抑制乃至殺滅作用。
第一節細菌純培養的群體生長規律
大多數細菌的繁殖速度都很快。大腸桿菌的適宜條件下，每20分鍾左右便可分裂一次，如果始終保持這樣的繁殖速度，一個細菌48個小時內，其子代總重量可達2.2×10 31克，這是一個巨大的數字。然而，實際情況是不可能的。那麼，細菌的群體生長規律到底怎樣呢?
一、細菌純培養的群體生長規律（詳細講解，讓學生理解並掌握）
將少量單細胞純培養接種到一恆定容積的新鮮液體培養基中，在適宜的條件下培養，定時取樣測定細菌含量，可以看到以下現象：開始有一短暫時間，細菌數量並不增加，隨之細菌數目增加很快，繼而細菌數又趨穩定，最後逐漸下降。如果以培養時間為橫坐標，以細菌數目的對數或生長速度為縱坐標作圖，可以得到如圖6-6的曲線，稱為繁殖曲線，對單細胞微生物而言，雖然生長和繁殖是兩個不同的概念，但由於在測定方法上，多以細菌數增加(即繁殖)作為生長指標，它們的繁殖也可視為群體的生長，所以，繁新的適宜的環境中生長繁殖直至衰老死亡全過程的動態變化。根據細菌生長繁殖速率的不同，可將生長曲線大致分為延遲期、對數期、調整期或滯留適應期。
（一）延遲期 處於延遲期細菌細胞的特點可概括為8個字：分裂遲緩、代謝活躍。細胞體積增長較快，尤其是長軸，例如巨大芽孢桿菌，在延遲期末，細胞平均長度比剛接種時大6倍以上；細胞中RNA含量增高，原生質嗜鹼性加強；對不良環境條件較敏感，對氧的吸收、二氧化碳的釋放以及脫氨作用也很強，同時容易產生各種誘導酶等。這些都說明細胞處於活躍生長中，只是細胞分裂延遲。在此階段後期，少數細胞開始分裂，曲線略有上升。
延遲期出現的原因，可能是為了調整代謝。當細胞接種到新的環境(如從固體培養接種至液體培養基)後，需要重新合成必需量的酶、輔酶或某些中間代謝產物，以適應新的環境。
延遲期的長短與菌種的遺傳性、菌齡以及移種前後所處的環境條件等因素有關，短的只需幾分鍾，長的可達幾小時。因此，深入了解延遲期產生的原因，採取縮短延遲期的措施，在發酵工業上具有十分重要的意義。在生產實踐中，通常採取的措施有增加接種量，在種子培養中加入發酵培養基的某些營養成分，採用最適種齡(即處於對數期的菌種)的健壯菌種接種以及選用繁殖快的菌種等措施，以縮短延遲期，加速發酵周期，提高設備利用率。
在延遲期末，每個細胞已開始分裂，但並非所有的機體都同時結束這一時期，所以細菌數逐漸增加，曲線稍有上升，直至這一階段結束，進入下一階段。
(二) 對數期(log phase) 對數期又稱指數期(exponential phase)。在此期中，細胞代謝活性最強，組成新細胞物質最快，所有分裂形成的新細胞都生活旺盛。這一階段的突出特點是細菌數以幾何級數增加，代時穩定，細菌數目的增加與原生質總量的增加，與菌液混濁度的增加均呈正相關性。這時，細菌純培養的生長速率也就是群體生長的速率，可用代時(generation time)表示。所謂代時，即單個細胞完成一次分裂所需的時間，亦即增加一代所需的時間(也叫增代時間或世代時間)。在此階段，由於代時穩定，因此，只要知道了對數期中任何兩個時間的菌數，就可求出細菌的代時。
不同的細菌，其對數期的代時不同，同一種細菌，由於培養基組成和物理條件的影響，如培養溫度、培養基pH、營養物的性質等，代時也不相同。但是，在一定條件下，各種菌的代時又是相對穩定的，多數種為20-30分鍾，有的長達33小時，而有的繁殖極快，增代時間只9.8分左右。表6-4示不同細菌的代時。
處於對數期的微生物，其個體形態、化學組成和生理特性等均較一致，代謝旺盛，生長迅速，代時穩定，所以是研究基本代謝的良好材料，也是發酵生產的良好種子，如果用作菌種，往往延遲期很短以至檢查不出，這樣可在短時間內得到大量微生物，以縮短發酵周期。
(三) 穩定期(stationary phase) 又稱恆定期或最高生長期。處於穩定期的微生物，新增殖的細胞數與老細胞的死亡數幾乎相等，整個培養物中二者處於動態平衡，此時生長速度，又逐漸趨向零。
在一定容積的培養基中，細菌為什麼不能按對數期的高速率無限生長呢?這是由於對數期細菌活躍生長引起周圍環境條件條件發生了一系列變化，某些營養物質消耗，有害代謝產物的積累，以及諸如pH、氧化還原電位、溫度等的改變，限制了菌體細胞繼續以高速度進行生長和分裂。
此階段初期，細菌分裂的間隔時間開始延長，曲線上升逐漸緩慢。隨後，部分細胞停止分裂，少數細胞開始死亡，致使細胞的新生與死亡速率處於動態平衡。這時培養物中細胞總數達到最高水平，接著死亡細胞數大大超過新增殖細胞數，曲線出現下降趨勢。
穩定期的細胞內開始積累貯藏物，如肝糖、異染顆粒、脂肪粒等，大多數芽孢細菌也在此階段形成芽孢。如果為了獲得大量菌體，就應在此階段收獲，因這時細胞總數量最高；這一時期也是發酵過程積累代謝產物的重要階段，某些放線菌抗生素的大量形成也在此時期。
從上可以看出，穩定期的微生物，在數量上的達到了最高水平，產物的積累也達到了高峰，此時，菌體的總產量與所消耗的營養物質之間存在著一定關系，這種關系，生產上稱為產量常數，可用下式表示：
γ=菌體總生長量/消耗營養物質總量
式中γ值的大小可說明該種細菌同化效率的高低。根據這一原理，可用適當的微生物作為指示，對維生素、氨基酸或核苷酸等進行定量的生物測定。穩定期的長短與菌種和外界環境條件有關。生產上常常通過補料、調節pH、調整溫度等措施，延長穩定期，以積累更多的代謝產物。
(四) 衰亡期(decline hpase) 穩定期後如再繼續培養，細菌死亡率逐漸增加，以致死亡數大大超過新生數，群體中活菌數目急劇下降，出現了"負生長"，此階段叫衰亡期。其中有一段時間，活菌數換幾何級數下降，故有人稱之為"對數死亡階段"。這一階段的細胞，有的開始自溶，產生或釋放出一些產物，如氨基酸、轉化酶、外肽酶或抗生素等。菌體細胞也呈現多種形態，有時產生畸形，細胞大小懸殊，有的細胞內多液泡，革蘭氏染色反應的陽性菌變成陰性反應等。在學習細菌生長曲線的有關知識時，應注意各生長期之間的過渡階段。從圖6-6可以看到培養物是逐步地從一個生長期進入到下了個生長期的。也就是說，並不是所有細胞在接近某一生長期的末尾時均處於完全相同的生理狀態，因此，在細菌生長的整個周期，細菌數和培養時間，若以線性關系表示，往往是一條緩慢上升以後又逐漸下降的曲線，而不是一個階段分明的直線。
認識和掌握細菌生長曲線，不僅對指導發酵生產具有很大作用，而且對科學研究也是十分必要的。例如，為了得到研究材料，往往少不了要預計一細胞群體生長到一定數量水平需要多長時間，這就必須計算生長速率和代時。另外，正確認識正常生長曲線的完整意思也很重要，在某個生長時期細胞年幼而代謝活躍，哪個時期細胞老化並瀕於死亡，因不同生長期的細胞在結構和生理上可能有很大差別，了解了這些，就能根據需要進取樣和收獲。同時，在不同的生長期里理化因子對微生物的影響了可能不同。一般來說，對數生長期的細胞較為一致，因此常用於研究細胞的新陳代謝。
二、微生物生長的測定（詳細講解，讓學生理解）
微生物特別是單細胞微生物，體積很小，個體的生長很難測定，而且也沒有什麼實際應用價值。因此，測定它們的生長不是依據細胞個體的大小，而是測定群體的增加量，即群體的生長。例如用直接或間接的方法測定群體的增加量；或測定群體的原生質量；或測定細胞中某些生理活性的變化等。就一般單細胞微生物而言，尤其在對數生長期，像細菌的生長量與細菌的數目之間完成是一種正比例關系。因此，某些情況下，細菌的數目就表示了它的生長量。測定生長量的方法很多，概括起來有以下幾種。
(一) 直接計數法(又稱全數法)
1. 塗片染色法 將已知體積的待測材料，均勻地塗布在載玻片的已知面積上，經固定染色後，在顯微鏡下計算染色塗片上的細菌數。一般在載玻片一平方厘米的面積上，均勻塗布0.01毫升樣品。很顯然，在顯微鏡下要觀察整個塗布區域是較困難的，因此，人們常常任意選擇幾個乃至十幾個視野來計算細胞的數量。如果藉助鏡台測微尺測得視野的直徑，就可計算了。視野的面積(面積=πr2，r為視野的半徑)，然後用一平方厘米內的視野數乘以每個視野中的細胞平均數，再乘以100(因只用了0.01毫升樣品塗布)，就等於每毫升菌液的細胞數。其計算公式如下：
每毫升原菌液含菌數=視野中的平均菌數×1cm 2/視野面積×100×稀釋倍數
2.計數器測定法 用特製的細菌計數器或血球計數器進行計數。取一定容積稀釋的單細胞微生物懸液置於計數器載玻片與蓋玻片之間的計數室內。由於計數室的容積是己知的(總面積為1平方毫米，高0.1毫米)，並有一定刻度。因此，可根據計數器刻度內的細菌數，計算出樣品中的含菌數。
根據計數器小格數目的不同，可概括成兩個換算公式：
(1) 16個中格×25個小格的計數器：每毫升原菌液含菌數=100小格內菌數100×400×10，000×稀釋倍數
(2) 25個中格×16個小格的計數器：每毫升原菌液含菌數=小格內菌數80×400×10：000×稀釋倍數
上述兩種計數器有一個共同特點，即每一個大方格均由16×25=400個小方格組成，故可將上面兩個公式歸納成一個通式：
每毫升原菌液含菌數=每小格平均菌數×4，000，000×稀釋倍數
3.比例計數法 將待測的細菌懸液與等體積血液混合後塗片，在顯微鏡下可以測得細菌數與紅細胞數的比例。由於每毫升血液中紅細胞數是已知的，如正常的男性每立方毫米血液中約含400-500萬個，女性約為350-450萬個。這樣，通過細菌數與紅細胞數的比例，就可計算出每毫升樣品中的細菌數。如果測定空氣和水中的微生物時，由於含菌數低，需將一定體積的樣品通過特製的濾器進行濃縮。
上述三種方法都屬於顯微鏡直接計數法。這些方法雖然較麻煩，但在許多有關微生物生長的研究工作中卻很重要。然而也有一定的局限性，主要表現在：死、活細胞不易區分；小的細胞很難在顯微鏡下觀察，有一些細胞可能被遺漏；濃度太低的細胞懸液也不能使用此法，可以計數的最低的群體細胞數與細胞大小有關，就大多靈敏細菌而言，群體數必須每毫升懸液中含菌10 6個以上；精確性也較差。
4.電子自動計數器計數法 電子計數器的工作原理，就是測定一個小孔中液體的電阻變化。
電子自動計數器具有一個特製的有孔玻璃薄膜，當定量的細胞懸液中的菌體高速地通過小孔時，由於懸液與菌體的導電性不同，使得小孔的電導下降，電阻強率明顯增加，並形成一個脈沖，自動記錄在電子記錄尺標裝置上。這樣，一份已知體知的含有待測細胞的菌懸液，讓其通過這一小孔，每當一個細胞通過時就就產一個脈沖被記錄下來。此設備可以高速測定菌數，而且結果也較精確。但是電子計數器不能區別其他顆粒，因此，菌懸液中應無其他碎片。
5.比濁法 這是測定懸液中細胞數的快速方法。其原理是懸液中細胞濃度與混濁度成正比，與透光度成反比。菌體是不透光的，光速通過菌懸液時則會引起光的散射或吸收，從而降低透光量。細菌越多，透光量越低。因此，測定菌懸液的光密度或透光度可以反映細胞的濃度。而光密度或透光度又可借光電池精確地測得。然後將未知細胞數的懸液與已知細胞數的懸
液相比，可以從已知懸液的稀釋倍數，求出未知懸液所含的細胞數。此法比較簡便。但使用時必須注意：樣品顏色不宜太深；樣品中不要混雜其他物質，否則不能使用；同時菌懸液濃度必須在10 7/毫升以上才能顯示可信的混濁度。
(二) 間接計數法(又叫活菌計數法)
直接計數法測定的是死、活細胞總數。在多數情況下，人們所關心的是計算活菌數。間接計數法是基於每個分散的有機體在適宜的培養基中具有生長繁殖的能力，並且一個活細胞能形成一個菌藩。因此，菌落數就是待測樣品的含的活菌數。此法所得的數值往往比直接法測定的數字小。
1.平皿菌落計數法 像稀釋平皿分離法一樣，先將待測菌液作一系列10倍稀釋，使平皿上長出的菌落數在30-300個之間。然後將最後三個稀釋度的稀釋液各取一定量(一般為0.2毫升)與融化並冷至45℃左右的瓊脂培養基一起，傾入無菌平皿中搖勻，靜置，待凝固後進行保溫培養，通過平皿上出現的菌落數，便可推算出原菌液含菌數。計算公式：
總活菌數/毫升=同一稀釋度三次重復的菌落平均數×稀釋倍數×5
此法由於個人掌握程度的不同，結果常不穩定。其成敗關鍵在於應使樣品充分均勻，而且每個稀釋度的菌液應各用一支無菌吸管，以減少吸管壁因存在油脂等物粘上細菌而影響計數的精確度(否則，有時誤差高達15%左右)。為克服這一弱點，近年來有人對此法作了改進。他們認為，對原菌液濃度為10-9/毫升的微生物來說，如果第一次稀釋採用10-4�級(即用毛細吸管吸菌液10微升至100毫升的無菌水中)，第二次稀釋則採用10-2�級(即吸1毫升上述稀釋菌液於100毫升無菌水中)，然後再吸0.2毫升此菌液進行平皿菌落計數(採用表面塗布法)，其結果較為精確可靠(圖6-4)。
平皿菌落計數法是教學、生產、科研中最常見的一種活菌計數法。它不僅適用於多種材料，而且，即使樣品中含菌數量極少也可以測出。常用於測定水、土壤、牛奶、食品及其他材料中的活菌數。必須注意的是：並非所有生活有機體都要在實驗條件下或實驗期間內生長並形成菌落，如果在待測樣品中含有不同生理類型的有機體時更是如此。此外，意外的損傷也可導致菌數減少，例如有些細菌，可能在稀釋和傾倒平皿等過程中遭到損傷，造成人為的誤差。處於融化狀態的瓊脂培養基溫度較高，某些易受熱力影響的微生物往往不能存活；加之人們無法看出產生菌落細胞，因而不能絕對肯定一個菌落僅來源於一個細胞，以致造成實驗誤差。
2.稀釋法 獎待測樣品作一系列稀釋，一直稀釋到該稀釋液的少量(如1毫升)接種到新鮮培養基中沒有或極少出現生長繁殖。根據沒有生長的最低稀釋度與出現生長的最高稀釋度(即臨界級數)，再用"或然率"理論，可以計算出樣品單位體積中細菌數的近似值。具體的說，菌液經多次稀釋後，一定量菌液中可以極少甚至無菌，然後將待測液於液體培養基中，按十倍稀釋度作一系列稀釋，每個稀釋度取3-5次重復，培養後，將有細胞生長的最的三個稀釋度中的出現細菌生長的管數作為數量指示，由統計分配表(表6-2)上查出近似值，再乘以數量指標第一位數的稀釋倍數，即為原菌液中的含菌數。例如：某一細菌在稀釋法中的生長情況如下：
根據上述結果，其數量指標為"541"，查統計分配表得近似值為17。然後乘以第一位數的稀釋倍數(10-5的稀釋倍數為100，000)。那麼，原菌液中的活菌數=17×100，000=10 5。即每毫升原菌液中含活菌數為1，700，000個。統計分配表根據重復次數不同分為三次重復測數統計表，四次重復測數統計表和五次重復測數統計表(又稱五管最或然數表)。
在實踐中，通常以五管重復為一個組，故這里僅列出了五次重復測數統計表。只要知道了數量指標，就可查知近似值。
例1 經巴斯德消毒的牛奶樣品作10 0、10-1、10-2稀釋，每個稀釋度作五管重復，每個重復管中加入1ml小份樣品接種，培養後，100五管均出現生長10-1有三管生長，而10-2�沒有生長，其數量指標為530，從表6-2查出近似值是7.9，則每毫升牛奶含活菌為：7.9×10個。
例2 牛奶樣品作10-3、10-4、10-5稀釋，同上法各取五個1毫升小份稀釋的樣口接種，經培養，10-3有四管生長，10-4有兩管生長，而10-5沒有生長。其數量指標為420。從表6-2查出近似值是2.2，由於數量指標的第一位數的稀釋倍數是1，000，故每毫升牛奶中含活菌為：2.2×10 3個。此方法只有因某種原因不能使用瓊脂平皿菌落計數時才採用。
從前面可看出，活菌計數法盡管有一定的局限性，但它卻能提供其他方法不能獲得的資料，所以在食品、奶品、醫學及衛生微生物學中經常採用。為了消除上述方法的復雜性，現在不論是培養基、培養條件或是稀釋方法、計算方法，以及結果分析和解釋等方面，通過多年的實踐，都制訂了嚴格的標准。
如果測定量大而且含菌濃度很低樣品(如空氣、水等)中的活菌數時，則應將待測樣品通過微孔薄膜(如硝化纖維素薄)過濾濃庥，再與膜一起放到培養基或浸透了培養液的支持物表面培養，然後根據菌藩數推知樣品含菌數。
(三) 測定細胞物質量
1.測定細胞總含氮量來確定細菌濃度 蛋白質是細胞的主要物質，含量比較穩定，而氮又是蛋白質的重要組成。其方法要點：從一定量培養物中分離出細菌，洗滌，以除去培養基帶入的含氮物質。再用凱氏定氮法法測定總含氮量，以表示原生質含量的多少。一般細菌的含氮量約為原生質乾重的14%。而總氮量與細胞蛋白質總含量的關系可用下式計算：
蛋白質總量=含氮量%×6.25
此法只適用於細胞濃度較高的樣品，同時操作過程也較麻煩，故主要用於科學研究。
2.DNA含量測定法 利用DNA與DABA-2HCl(即新配製的20%W/W，3，5-二氨基苯甲酸-鹽酸溶液)能顯示特殊熒光反應的原理而設計的。將一定容積培養物的菌懸液，通過熒光反應強度，求得DNA的含量，可以直接反映所含細胞物質的量。同時還可根據DNA含量計算出細菌的數量。因為每個細菌平均含DNA8.4×10-5納克。
3.測定細胞乾重法 單位體積培養物中，細胞的乾重可用來表示菌體的生長量。將單位體積培養液中的菌體，以清水洗凈，然後放入乾燥器內加熱或減壓乾燥。其菌體乾重可直接用精密儀器測定。一般來說，細菌的乾重約為濕重的20-25%，即1毫克干菌體=4-5毫克濕菌體=4-5×10 9個菌體。此法較為直接而又可靠，主要用於調查研究。但只適用於菌體濃度較高的樣品，而且要求樣品中不含非菌體的干物質。
4.基他生理指標測定法 微生物新陳代謝的結果，必然要消耗或產生一定量的物質，以表示微生物的生長量。一般生長旺盛時消耗的物質就多，或者積累的某種代謝產物也多。例如通過測定微生物對氧的吸收、發酵糖產酸量、或測定谷氨酸在氨基脫羧酶作用下產生CO2的多少來推知細菌生長情況。這是一種間接方法。使用時必須注意：作為生長指標的那些生理活動項目，應不受外界其他因素的影響或干擾。
可以看出，每種方法都各有優點和局限性。只有在考慮了這些因素同要著手解決的問題之間的關系以後，才能對具體的方法進行選擇。正如前面說過的，平皿菌落計數法是微生物學中應用最多的常規方法，掌握這一方法的原理和實際操作，很有必要。但此法在理論上僅能反映活細胞數。另外，當用兩種不同的方法測量細菌的生長量時，其結果不一致是完全可能的，例如對靜止期培養物進行顯微鏡計數時比平皿菌落計數法所得的數字高得多，因前者包括所有的活細胞與死細胞。而後者只能反映出活細胞數。
測定微生物生長量，在理論研究和實際應用中都十分重要。當我們要對細菌在不同培養基中或不同條件下的生長情況進行評價或解釋時，就必須用量的術語來表示生長。例如，可以通過細菌生長的快慢來判斷某一條件是否適合。生長快的條件，最終的細胞總收獲量可能沒有另一些條件下的收獲量大。在另一些條件下，生長速率雖然較低，但它卻可在一段較長的時間內不斷增加。這種情況可用釁6-5表示。這是同一種菌在兩種不同的培養基上生長情況的比較。這種菌在兩種培養里都能生長。假如在A時測量生長，可以斷定在培養基Ⅱ里生長快；若在B時測量，則在兩種培養基上都生長得很好；可是在C時測量，卻在培養基Ⅰ里生長好些。據此，我們就可以根據需要進行選擇了。如果培養目的是要機體生長得早而快，就選用培養基Ⅱ；如果是要得到大量的細胞，就應選用培養基Ⅰ。因此，只有具備了有關生長的定量方面的知識，才能在實際應用中作用正確的選擇，以利科研和生產。
三、連續培養（詳細講解，讓學生理解並掌握）
將微生物置於一定容積的培養基中，經過培養生長，最後一次收獲，此稱分批培養(batch culture)。通過對細菌純培養的生長曲線的分析可知，在分批培養中，培養基一次加入，不予補充，不再更換。隨著微生物的活躍生長，培養基中營養物質逐漸消耗，有害代謝產物不斷積累，細菌的對數生長期不可長時間維持。如果在培養器中不斷補充新鮮營養物質，並及時不斷地以同樣速度排出培養物(包括菌體及代謝產物)，理論上講，對數生長期就可無限延長。只要培養液的流支量能使分裂繁殖增加的新菌數相當於流出的老菌數，就可保證培養器中總菌量基本不變。50年代出現的連續培養(continuous cultivation)技術就是據此原理而設計的，這種方法就叫連續培養法。連續培養方法的出現，不僅可隨時為微生物的研究工作提供一定生理狀態的實驗材料，而且可提高發酵工業的生產效益和自動化水平。此法已成為當前發酵工業的發展方向。
最簡單的連續發酵裝置包括：培養室、無菌培養基容器以及可自動調節流速(培養基流入，培養物流出)的控制系統，必要時還裝有通氣、攪拌設備。連續培養裝置的一個主要參數是稀釋率(D)，它的定義為：D=FV=流動速率容積。控制連續培養的方法主要有兩種：

B. 微生物細胞生長的測定方法

微生物生長的測定方法有多種，根據研究對象或目的選擇。(一)微生物細胞數目的檢測方法1．總細胞計數法 顯微鏡直接記數法和比濁法(1)血球計數板法 血球汁數板中央有一個體積一定的計數室( 0.1mm3)。將菌懸液或孢子懸液在顯微鏡下計數，然後再按一定公式計算出細菌總數。 (2)塗片計數法 將一定體積(0.1ml)的樣品，均勻地塗在載片的一定面積內(1cm2)。在顯微鏡下計算細胞數量，推算1cm2所含細胞數目。（3）比濁法：菌體細胞培養液混濁，在一定范圍內，菌體數量與渾濁成正比，故可通過分光光度計或比色計求出渾濁度，通過與標准曲線對比，求出樣品中菌液濃度，算出個體數。特點：所得結果包括死菌和活菌。2. 活菌計數法（平板菌落記數法）：是通過測定樣品在培養基上形成的菌落數來間接確定其活菌數的方法．故又稱平板計數法。特點：計算的結果是活菌落。注意：樣品稀釋度。一個活細胞形成一個菌落。（1）塗布平板法 用滅菌的塗布器將一定體積(不大於0.1ml)的適當稀釋度的菌液塗布在瓊脂培養基的表面，然後保溫培養有到菌落出現，記錄菌落的數目並換算成每毫升試樣中的活細胞數量。（2）倒平板法 將樣品稀釋到一定濃度，取一定體積(0.1—1ml)倒入冷卻至45℃的固體培養基混合，製成平板，培養後，出現菌落，由菌落數推算出的菌總數。3 濾膜過濾法：樣品同過微孔濾膜後，細菌收集在濾膜上，然後將濾膜放在培養基中培養，通過菌落計數求出樣品活菌落。 (二)微生物生長量和生理指標的測定方法測定微生物生長量及相關的生理指標，常用以下方法：1．濕重法：將單位體積微生物培養液離心，收集沉澱物，然後再稱重。2．乾重法：將離心得到的細胞沉澱物，置於100---105℃的烘箱中乾燥過夜除去水分，然後再稱重。特點：適合與菌體濃度高的樣品。表示菌體生長量。3、測定細胞內菌種化學成分：方法難，操做困難，但較准確。細胞內菌種化學成分多少（∝），反映群體中菌體數量的多少。（1） 測定含氮量：N在細胞內穩定，測定總N量，粗蛋白=N*6.25g。（2） 測定DNA：微生物細胞DNA含量穩定，採用熒光指示劑或染色劑與菌體DNA作用熒光比色或分光光度法測得DNA的含量。（3） 其他生理指標：如測定碳、磷、RNA、ATP、DAP(二氨基庚二酸)的含量等。 (二)絲狀微生物菌絲長度的測定方法 對於絲狀微生物。特別是絲狀真菌，通常是通過測定菌絲的長度變化來反映它們的生長速率。方法有： 1．培養基表面菌體生長速率測定法 主要測定一定時間內在瓊脂培養基表面的菌落直徑的增加值。 2．培養料中菌體速率測定法主要測定一定時間內在固體培養料中菌絲體向前延伸的距離。如：栽培食用菌的培養料。 3．單個菌絲頂端生長速率測定法 在顯微鏡下藉助目鏡測微尺測定在一定時間內單個菌絲的伸長長度。

C. 微生物的生長

是指整個菌落，即你發酵液中的生物量的含量。
那麼我們如何確定哪個時期是對數期，哪個時期是穩定期等呢？
我們需要在不同的時間測定發酵液中細菌的含量，即在不同的時間裡面取相等含量的發酵液體積，測定細菌的含量。然後以時間為橫坐標，細菌的含量為縱坐標，你會得到一條此細菌生長周期的曲線，從曲線上我們可以很明顯的看出對數期的時間范圍，你可以選用對數期後期（即屬於對數期並靠近穩定期）的細菌來接種。
細菌含量的測定：你可以採取：1.乾重法（培養基全為可溶物），此法簡單。
2.DNA法（培養基含不溶物），此法稍復雜。

D. 測量微生物生長的方法有哪些

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2微生物生長量的測定微生物特別是單細胞微生物，體積很小，個體生長很難測定，意義也不大。通常測定微生物的生長是測群體的生長，而測定繁殖則都要建立在計數這一基礎上。2.1測生長量測定生長量的方法有許多種，適用於一切微生物。2.1.1直接法2.1.1.1測體積它是一種較為粗放的方法，通常用於初步比較用。例如將待測培養液放在刻度離心管中作自然沉降或進行一定時間的離心，然後觀察沉降物的體積。2.1.1.2稱乾重採用離心法或過濾法測定，一般乾重為濕重的10%~20%。如用離心法，將待測培養液離心，再用清水洗滌離心1~5次後乾燥，可用105℃、100℃或紅外線烘乾，也可在較低的溫度（80℃或40℃）下進行真空乾燥，然後稱乾重。如細菌一個細胞一般重10-12~10-13g。如為絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜進行過濾。過濾後，細胞可用少量水洗滌，再真空乾燥（40℃以下），稱乾重。以乳酸菌為例，在液體培養基中，細胞的濃度大約為2×108個/ml。100ml培養物可得10~70mg乾重的細胞。2.1.2間接法2.1.2.1生理指標法與生長量相平行的生理指標很多，它們均可用作生長測定的相對值。1）測定細胞總含氮量來確定細菌濃度大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%，酵母菌為7.5%，黴菌為6.0%。總氮量與細胞粗蛋白的含量（因其中包括了雜環氮和氧化型氮）的關系可用下式計算：粗蛋白總量=含氮量%×6.25含氮量的測定方法有很多，常用凱氏定氮法。此法適用於細胞濃度較高的樣品，同時

E. 2.有哪些生理指標可用來表示微生物的生長量其原理如何

生長繁殖指標（群體生長計數法、間接估演算法）生理指標可用來表示微生物的生長量，其原理：

物理方法中主要是溫度控制、濕度控制。微生物生長繁殖必須具備一定的溫度和濕度。一般說，低溫、乾燥不利於微生物生長，甚至能夠殺滅微生物。所以可以用低溫和乾燥控制微生物生長繁殖。酸度過高或過低、滲透壓過高或過低也能控制微生物生長繁殖。

生長繁殖快

相比於大型動物，微生物具有極高的生長繁殖速度。大腸桿菌能夠在12.5-20分鍾內繁殖1次。不妨計算一下，1個大腸桿菌假設20分鍾分裂1次，1小時3次，1晝夜24小時分裂24×3=72次，大概可產生4722366500萬億個（2的72次方），這是非常巨大的數字。但事實上，由於各種條件的限制，如營養缺失、競爭加劇、生存環境惡化等原因，微生物無法完全達到這種指數級增長。

F. 為什麼微生物的生長測量在理論和實踐上有重要意義包括那些反面

微生物的檢測，無論在理論研究還是在生產實踐中都具有重要的意義，本文分生長量測定法，微生物計數法，生理指標法和商業化快速微生物檢測簡要介紹了利用微生物重量，體積，大小，生理代謝物等指標的二十餘種常用的檢測方法，簡要介紹了這些方法的原理，應用范圍和優缺點。

概述：

一個微生物細胞在合適的外界條件下，不斷的吸收營養物質，並按自己的代謝方式進行新陳代謝。如果同化作用的速度超過了異化作用，則其原生質的總量（重量，體積，大小）就不斷增加，於是出現了個體的生長現象。如果這是一種平衡生長，即各細胞組分是按恰當的比例增長時，則達到一定程度後就會發生繁殖，從而引起個體數目的增加，這時，原有的個體已經發展成一個群體。隨著群體中各個個體的進一步生長，就引起了這一群體的生長，這可從其體積、重量、密度或濃度作指標來衡量。微生物的生長不同於其他生物的生長，微生物的個體生長在科研上有一定困難，通常情況下也沒有實際意義。微生物是以量取勝的，因此，微生物的生長通常指群體的擴增。微生物的生長繁殖是其在內外各種環境因素相互作用下的綜合反映。因此生長繁殖情況就可作為研究各種生理生化和遺傳等問題的重要指標，同時，微生物在生產實踐上的各種應用或是對致病，霉腐微生物的防治都和他們的生長抑制緊密相關。所以有必要介紹一下微生物生長情況的檢測方法。既然生長意味著原生質含量的增加，所以測定的方法也都直接或間接的以次為根據，而測定繁殖則都要建立在計數這一基礎上。微生物生長的衡量，可以從其重量，體積，密度，濃度，做指標來進行衡量。

生長量測定法

體積測量法：又稱測菌絲濃度法。

通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間（如5分鍾）和轉速（如5000 rpm），離心後，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。

稱乾重法：

可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速，進行離心，並用清水離心洗滌1-5次，進行乾燥。乾燥可用烘箱在105℃或100℃下烘乾，或採用紅外線烘乾，也可在80℃或40℃下真空乾燥，乾燥後稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾後用少量水洗滌，在40℃下進行真空乾燥。稱乾重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常採用這種方法，如活性乾酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

比濁法：

微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可採用一種特製的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用於發酵工業菌體生長監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600nm 處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.Coli的生長及誘導時間。

菌絲長度測量法：

對於絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度，或是利用一隻一端開口並帶有刻度的細玻璃管，到入合適的培養基，卧放，在開口的一端接種微生物，一段時間後記錄其菌絲生長長度，藉此衡量絲狀微生物的生長。

微生物計數法

血球計數板法:

血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平台，兩嵴的表比兩平台的表面高0.1 mm，每個平台上刻有不同規格的格網，中央0.1 mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜於單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，並且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

染色計數法：

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。藉助不同的染料對菌體進行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色後在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。

比例計數法：

將已知顆粒（如黴菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較粗放。並且需要配製已知顆粒濃度的懸液做標准。

液體稀釋法：

對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15隻裝培養液的試管中，經培養後記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然後查最大或然數表MPN（most probably number）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用於食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

平板菌落計數法：

這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液塗布於已凝固的固體培養基平板上。保溫培養後，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。

試劑紙法：

在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色）待蘸取測試菌液後置密封包裝袋中培養。短期培養後在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標准紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷准確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

膜過濾法：

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。

生理指標法：

微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸鹼度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。

測定含氮量：

大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%，酵母為7.5%，黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱後產生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO2後即可測出N2的量。

測定含碳量：

將少量（乾重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鍾後冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標准樣品做標准曲線。

還原糖測定法：

還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用於大規模工業發酵生產上微生物生長的常規監測。方法是，離心發酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鍾，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點時加入澱粉溶液，繼續加Na2S2O3至終點，查表讀出還原糖的含量。

氨基氮的測定：

方法是，離心發酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應數刻，加入0.02N的使之變色，根據NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據培養液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。

其他生理物質的測定：

P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙醯胞壁酸）等含量以及產酸，產氣，產CO2（用標記葡萄糖做基質），耗氧，黏度，產熱等指標， 都可用於生長量的測定。也可以根據反應前後的基質濃度變化，最終產氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如我所在BMP-2的發酵生產上，隨時監測溶氧量的變化和酸鹼度的變化，判斷細菌的長勢。

商業化快速微生物檢測法：

微生物的檢測，其發展方向是快速，准確，簡便，自動化，當前很多生物製品公司利用傳統微生物檢測原理，結合不同的檢測方法，設計了形式各異的微生物檢測儀器設備，正逐步廣泛應用於醫學微生物檢測和科學研究領域。例如：

1、抗干擾培養基和微生物數量快速檢測技術結合解決了傳統微生物檢測手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測系統奠定了堅實的基礎。中科院廣州分院合作產業處提供的抗干擾微生物培養基，新型生化鑒定管，微生物計數卡，環境質量檢測試劑盒等，可方便的用於多項檢測。

2、BACTOMETER 全自動各類總菌數及快速細菌檢測系統可以數小時內獲得監測結果，樣本顏色及光學特徵都不影響讀數，對酵母和黴菌檢測同樣高度敏感原理是利用電阻抗法（IMPEDANCE TECHNOLOGY）將待測樣本與培養基置於反應試劑盒內，底部有一對不銹鋼電極，測定因微生物生長而產生阻抗改變。如微生物生長時可將培養基中的大分子營養物經代謝轉變為活躍小分子，電阻抗法可測試這種微弱變化，從而比傳統平板法更快速監測微生物的存在及數量。測定項目包括總生菌數，酵母菌，大腸桿菌群，黴菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌等。