① Realtime PCR如何減小復孔誤差值為什麼我前後兩次對同一批次的cDNA進行的realtime PCR差異很大
兩次的差異大,可和梁能是cDNA的保存問題,一般保存在-20度,但是時間長了就會有所降解.
如果降解了,你再做,相對表達量就會降低.
至握胡於復孔之間的差異,我到覺得不是很大,0.5以喚皮運內可以了,已經RT-PCR只是一個半定量的方法.
② qrtpcr數據三個重復如何處理
首先建議生物學重復和技術重復保證三個左右，如果樣本只有兩個donor，可以將兩者混勻後作為第三個樣本李歷。三個技術重復可以更加確保你數據的准確性。
－△△CT方法中參照因子的選擇決定於基因表達定量實驗的類型。最簡單的設計就是把未經處理的樣品作為參照因子（calibrator ）。經內標基因均一化處理後，通過方法計算，目標基因表達差異通過經過處理的樣本相對於未經處理的樣本的倍數來表示。對於未經處理的參照樣，△△CT=0，而2^0=1。所以根遲游據定義，未處理樣本的倍數變化為1 。而對於那些經過處理的哪旦搜樣本，相對於參考因子基因表達的倍數為2－△△CT。同樣的分析也可用於不同時相的基因表達差異，在這種情況下，一般選0 時刻的樣本作為參照因子。
③ 做PCR的時候為什麼同樣的東西同樣的操作，結果就是會不一樣呢，有時候連帶都不出，
首先，確唯戚認你的引物和模版，buffer和Taq酶沒有拿錯別的
其次，你的引物和模版是如何保存的？會不會因為保存不當而降解了。具體方法就是拿別人的模版或者已知有效的模版再做一次，如果是質粒，可以直接拋個電泳，如果是cDNA之類的，可以用讓凳GAPDH之類的做一下看看
第三，用別的儀坦山旅器做一個對照，看看儀器的升降溫是否出了問題
④ 生物學上對同一組實驗若兩次實驗結果偏差較大應如何處理
先看趨勢，如果趨勢一致直接算平均值，在生物雪森鍵上基本上每次的宏彎取樣以及樣本蔽春悶的狀態都會影響實驗結果，一般都是多做幾組，去掉偏差值，然後算平均值和SD如果SD好大那就算SEM，反正取最漂亮的結果上圖
⑤ real-time PCR復孔間的重復性差怎麼辦
學習做Realtime PCR, 實驗結果頃鎮旅是出來了,得到的內參、目的基因的Ct 值在15-25 之間,熔 融曲線基本上也是單峰,但不太會處理這個結果,對旅喊著數雀凳據發愁.不同的處理方法得到不 同的結果. 做的是相對定量,SYBR Green, 選用2^（-△ △ Ct）法 內參基因：對照。
⑥ 宏基因組測序對樣品的生物學重復有什麼要求如何避免重復性較差的問題出現
土壤、水體等生態環境樣本建議5個或5個以上的生物學重復；取樣時每個樣品均需多點取樣後混勻，降低單個樣本特異性。
人和動物樣本因個體特異性較大，建議10個以上生物學重復；腸道、瘤胃或糞便樣本因含有較多厭氧菌，要快速取樣、迅速低溫保存，針對較難富集微生物的樣品，如各種物體表面，可採用緩沖液洗脫或棉簽擦拭等方法。
樣品取好後避免長時間放置，需盡快進行DNA提取，送樣測序。
⑦ 臨床pcr測定的重復性不好的原因有沒有實驗室被擴增子污染
核酸檢測技術有諸多優點，但由於其超高的靈敏度，一旦實驗室出現核酸污染，很容易導致假陽性結果，從而影響檢測的准確性。
因此了解核酸污染原因和清除核酸污染是分子檢測實驗室的工作重點。
一、核酸實驗室污染的產生
在新冠病毒核酸檢測過程中 ，常見以下幾種污染類型 ：①標本污染；②試劑污染；③ 產物污染；④ 設備污染；⑤ 其他污染。
實驗室應發現污染其解決措施：
①標本污染：重新采樣進行檢測，評估標本前處理環節；
②試劑污染：更換新的試劑重新檢測評估；
③設備污染：設備整體消毒清潔、維護；
④產物污染：全面清潔消毒實驗室、儀器設備所有實驗有關用品。
實驗室的污染不可能一次就清理干凈，需反復清理驗證，直到實驗結果能被採用為止。
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在實際工作中，實驗室可能會因實驗過程的操作造成污染而導致「假陽性」。據其分析，污染來源主要有兩個方面：
其一，是擴增產物的遺留污染，在大規模核酸篩查的過程中，由於樣本量大、採取的又是「停人不停機」的連續工作方式，每輪擴增檢測之間的清潔漏宴可能不到位，同時也無法保證每個擴增管完全密閉，帶來「假陽性」返隱銀的可能。
其二，檢測過程中，樣本之間可能會發生交叉污染，比如，陽性樣本或者實驗室所用的質控品污染了本來為陰性的樣本，這也會造成的「假陽性」。
除實驗室污染外，「假陽性」的出現也可能是因不規范操作所致。個別實驗室包括技術人員沒有嚴格按照規定的工作程序進行操作，這是引發「假陽性」的另一種可能。
二、核酸實驗室污染的防控
進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規程，最大程度地降低可能出現的PCR污染或杜絕污染的出現。
(一) 嚴格實驗室功能分區
目前，實驗操作在不同的區域內進行，PCR的前處理和後處理要在不同的隔離區內進行：
1. 試劑准備區。
2．標本制備區。
3. PCR擴增區及分析區。
各工作區要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。
（二）確保實驗室人、物及空氣流動
核酸檢測實驗室的人、物及空氣流向按照試劑儲存和准備區→樣本制備區→擴增和產物分析區，防止擴增產物隨人流、物流及空氣進入擴增前的區域。空氣流向應按照從試劑儲存和准備區→樣本制備區→擴增區→擴增產物分析區方向空氣壓力遞減的方式進行。
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（三）實驗操作注意事項
1.實驗前安全要求
①實驗室工作桌面、檯面及地面消毒：應使用0.2%含氯消毒劑或75%酒精，消毒液不得超過24小時。
②轉運桶及標本消毒：轉運至實驗室的標本轉運桶應在生物安全櫃內開啟。轉運桶內壁和標本採集密封袋進行噴灑消毒。取出標本採集管後，應首先檢查標本管外壁是否有破損、管口是否泄露或是否有管壁殘留物。
③如為采樣管為非滅活管，實驗室操作人員在進行標本熱滅活時，溫浴前需旋緊標本採集管管蓋，必要時可用封口膜密閉管蓋；溫浴過程中可每隔10分鍾將標本輕柔搖勻1次，以保證標本均勻滅活；溫浴後標本需靜置至室溫至少10分鍾使氣溶膠沉降，隨後再開蓋進行後續核酸提取。
2.核酸提取和檢測安全要求
標本進行核酸提取和檢測時應盡可能在生物安全櫃內進行操作。如為打開標本管蓋或其他有可能產生氣溶膠的操作，則必須在生物安全櫃內進行。
3.實驗結束後清潔要求
①實驗室空氣清潔。實驗室每次檢測完畢後，可採用房間固定和/或可移動紫外燈進行紫外照射2小時以上。必要時可採用核酸清除劑等試劑清除實驗室殘留核酸。
②工作檯面清潔。每天實驗後，使用0.2%含氯消毒劑或75%酒精進行檯面、地面清潔。
③生物安全櫃消毒。實驗使用後的耗材廢棄物放入醫療廢物垃圾袋中，包紮後使用0.2%含有效氯消毒液或75%酒精噴灑消毒其外表面。手消攜禪毒後將垃圾袋帶出生物安全櫃放入實驗室廢棄物轉運袋中。試管架、實驗檯面、移液器等使用75%酒精進行擦拭。隨後關閉生物安全櫃，紫外燈照射30分鍾。
④轉運容器消毒。轉運及存放標本的容器使用前後需使用0.2%含氯消毒劑或75%酒精進行擦拭或噴灑消毒。
⑤塑料或有機玻璃材質物品清潔：使用0.2%含氯消毒劑或過氧乙酸或過氧化氫擦拭或噴灑。
（三）核酸實驗室污染的處理
實驗室一旦發生污染，檢測工作應立即停止，直到確認消除污染後才能重新開始檢測。
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1.標本污染生物安全櫃的操作台造成局限污染時：
立即用吸水紙覆蓋，並使用0.55%含氯消毒劑進行噴灑消毒。消毒液需要現用現配，24小時內使用。
2.標本傾覆造成實驗室污染時：
保持實驗室空間密閉，避免污染物擴散。立即使用潤濕有0.55%含氯消毒劑的毛巾覆蓋污染區。必要時（如大量溢撒時）可用過氧化氫加熱熏蒸實驗室，劑量為2g/m³，熏蒸過夜；或20g/L過氧乙酸消毒液用氣溶膠噴霧器噴霧，用量8ml/m³，作用1-2小時；
3.清理污染物時：
嚴格遵循活病毒生物安全操作要求，採用壓力蒸汽滅菌處理，並進行實驗室換氣等，防止次生危害。
因核酸實驗室污染後難以清除，有可能造成實驗室不能使用的風險。但是如果一旦出現核酸實驗室污染，除了上面常規的消毒清潔之外，另外可採用專門的實驗室污染去除儀去除實驗室核酸污染。
僅供醫學人士參考
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