qpcr生物學重復指什麼

㈠ 如何來設定轉錄組測序中的生物學重復

如何來設定轉錄組測序中的生物學重復

1.區分生物學重復與技術重復
生物學重復：指樣本重復，比如3隻小鼠，同時做一種處理，就是三個生物學重復。
技術重復：一般是三次實驗，比如對一塊組織，提了三次RNA，做三次real time。

2.設置生物學重復的意義

由於新一代測序技術的優越性以及高成本，曾一度忽略了「生物學重復」的重要性。但生物學重復對於測序實驗的設計以及實驗數據的解讀和分析都非常重要。

設置生物學重復：
能夠消除組內誤差：生物學重復可以測量變異程度
增強結果的可靠性：測序的樣本數越多，越能夠降低背景差異
檢測離群樣本：異常樣本的存在，會嚴重影響測序結果的准確性，通過計算樣本間的相關性可以發現異常樣本，將其排除。
案例一：

註：COX4NB和RASGRP1基因在生物學重復樣本中表達值的散點圖：

左邊紅色，COX4NB基因表達值的散點圖
右邊藍色，RASGRP1基因達值的散點圖
上面一行，測序數據的散點圖
下面一行：晶元數據的散點圖

COX4NB在生物學重復樣本中表達差異非常小；但在同樣情況下，RASGRP1的生物學差異很大。結果意味著：不同實驗組間 COX4NB的表達水平的變化存在研究意義；而同樣情況下RASGRP1的檢測數據可能不能說明問題。
由此可知，設計的實驗如果沒有生物學重復，或者生物學重復的數量不夠，就不能得到有統計意義的實驗結果；獲得的差異表達的基因很可能僅僅是少數個體差異的表現，並不能反映疾病或者某種特定生理狀態的群體本質特徵。

3.生物學重復設置幾個合適？

您是不是有同樣的問題：轉錄組測序是否必須進行生物學重復啊，是否要3個重復，是否可以用3個樣品的RNA等量混合代替生物學重復，如果不重復能否發文章…..？一方面是有限的經費，一方面是編輯的質疑；實在很難抉擇呀~~~
目前沒有生物學重復的實驗發文章比較困難，尤其是IF≥5的雜志。如果確實受限於研究經費，無法設置生物學重復。文章投出之後，遭編輯質疑。那就得結合強有力的實驗數據做支撐，比如定量實驗，FISH熒光原位雜交，或者是northern 雜交等，用實驗數據說服編輯。重復設置原則上越多越好，然而考慮到現實條件，重復設置≥3。一般不建議設置兩個重復，因為如果兩者結果不一致，我們無法確定以哪個數據為參考。
註：3個生物學重復，不等同於將3個樣品的RNA等量混合後測序。3個樣品等量混合測序，相當於將3個樣本的基因表達量取了平均值，其實就是相當於取了一個樣本，由此得到的差異基因同樣不可信，不能反應群體生物學現象。

4.生物學重復分析結果展示

以公司做項目的經驗來看，原核生物以及真菌生物學重復的效果>植物>動物，這是由於動植物個體差異較大所導致。所以動植物在選取生物學重復時，應按照嚴格的篩選條件進行取樣，方可得到理想結果。

㈡ 【一文讀懂生物學重復與技術重復】

在RNA-Seq等測序設計中，生物學重復和技術重復，是非常需要注意的問題。

那麼問題就來了，生物學重復和技術重復，到底是什麼？它們是如何影響我們的實驗設計的。

生物學重復 （biological replicate）：可以理解為我們對一個群體進行研究，但是我們不會對整個群體進行檢測（考慮到成本和工作量的問題，我們肯定也不會採取這種地毯式的方法），只是抽取群體中的一部分進行檢測，用樣本來代表總體。

這邊樣本個數，實際上就是生物學重復數。

技術重復 （technical replicate）：對一個樣本的數值進行多次測定。

下表給出常見實驗對應重復類型：

Replication這篇文章以測定小鼠肝臟細胞中的某一個gene的表達量為例，展示了什麼是生物學重復和技術重復以及如何權衡這兩者之間的關系。

分別給出3種類型的重復，分別為：
（1）animal水平的重復
（2）cell水平的重復
（3）技術重復

由上圖可以得到，3種不同種類的重復，所計算出來的表達量方差是不一樣的，但gene表達量的總方差，可以有下列公式計算得到：

接下來，將總體的重復次數限定，即在滿足 的前提條件下，對Var(X)進行計算。

1、當 和 均為1， 為48的情況下，計算出來的Var(X)如下圖標記：

這種情況下，只反映了由於cell樣品重復和技術重復所引起的基因表達量誤差。當n_{A}=1（動物樣品數為1），即無法計算由於animal樣品數變化，所帶來的基因表達量誤差。

因此在上述情況下， 就被低估了。

2、當 和 均為1， 為48的情況下

計算得到的基因表達量誤差完全是由於技術重復所引起的。因此，如果我們將這種情況下的誤差，認定為由生物重復所引起的，就造成了假陽性。

同樣地，每一種重復對於真實基因表達量的方差貢獻也不是相同的。

因為cell重復和測定技術重復，並是一個獨立變數。技術重復本質上是對同一份樣品進行測定，數據在這種情況下的變異，完全是由於人為或機器造成的，而cell重復在本質上可以認為與animal樣品之間存在相關性，因此也不是獨立的。

3、從 的角度，來選擇replicate

【標注】 越小，代表對 估計越准確

可以看到的是，當增大animal重復數時， 趨於一個穩定值，該樣本對總體的估計達到了一個較為准確的水平，同時 的值也接近於0。

4、從統計檢驗的角度，來選擇replicate

使用two-sample t檢驗，來判斷cell樣品的gene表達量方差、動物樣品表達量均值之間是否存在顯著差異。

下圖很明顯的一個結果就是，隨著 的增加，統計檢驗的效能得到提升，假陽性也在降低（同時也得權衡 和 ）

對於一組數據來說， 研究對象的生物重復比技術重復更能夠反映總體 ，因此在進行實驗設計時，最好將實驗/測序資源傾向這邊，而不是技術重復（除非對技術重復所誘發的影響感興趣）

[1] 劉小樂老師-哈佛計算生物學與生物信息學
[2] Blainey P, Krzywinski M, Altman N. Points of significance: replication[J]. Nature methods, 2014, 11(9): 879.

㈢ 【轉載】生物學重復與技術重復

生物重復和技術重復分別是什麼？在一個實驗中應該如何安排生物重復和技術重復？
重復是實驗設計的重要原則之一，實驗重復無論對於實驗結果的可重復性，還是對於最終實驗結論的可靠性，都起著起決定性的作用。
實驗重復還可以進一步細分為生物重復(biological replicates)和技術重復(technical replicates)，那麼生物重復和技術重復分別是什麼？在一個實驗中應該如何安排生物重復和技術重復？
生物重復和技術重復分別是什麼？
生物重復：指對同一個處理組中獨立來源的重復樣本分別進行獨立分析，是整個實驗的完全重復，如將具有同一基因型的多個細胞株進行獨立地測定。由於遺傳和環境等因素的影響會引起有機體的個體差異，因此需要採用生物重復的實驗設計方法來消除該差異。目前都以3次生物學重復實驗設計為主，要求嚴格的實驗可以做5次重復。
技術重復：指對同一樣本進行重復地檢測分析，例如同一份細胞中抽提的蛋白質進行三次質譜檢測，或者對同一RNA-seq樣本測序3次。與生物學重復相比，技術重復的測量變異程度較小，從而可以減少實驗中的分析變異，將對同一份樣本產生高重復性的測量結果 。
簡單來講，生物重復是生物級別的重復，一般都是生物樣本的重復。而技術重復，更多的是參數測定環節的重復，一般是對同一生物樣本進行多次測定。
進一步分析，其實可以發現生物重復是衡量實驗的總波動的（處理組間的差異不列入此處的波動，他們應該稱為效應），它包括樣本個體間差異和技術重復差異，而技術重復更多的是單純的衡量參數測量時的波動，如實驗操作嫻熟程度、儀器穩定性等等。
在一個實驗中應該如何安排生物重復和技術重復？
如此說來，對於一個實驗來說，如果條件允許的話，最好把生物重復和技術重復做全了？
然而StatQuest推薦的策略是只需要生物重復即可，不需要技術重復。為什麼？
只做生物重復
以小鼠的RNA-seq實驗為例，先看一下生物偏差（biological variation）和技術偏差（technical variation ）。
下圖代表小鼠的RNA-seq數據，虛線μ是總體小鼠的Read Counts，藍色條代表5個樣本小鼠的Read Counts。那那麼樣本小鼠的Read和總體μ是存在一定的差異的，我們將5個樣本小鼠的Read取平均：
average = [(μ+5)+(μ-1)+(μ+4)+(μ+2)+(μ-5)] / 5 = μ + (5-1+4+2-5)/5
隨著生物重復的增多，(5-1+4+2-5)/5會逐漸趨向於0，這個平均數也會趨近於總體搜咐均值μ。

剛才只考慮了生物生物偏差，沒有考慮技術偏差，下圖中添加悄灶了技術偏差，棕色條為生物偏差，綠色箭頭為技術偏差，那麼此時依然可以取5個樣本小鼠的Read平均：
average = μ + (5-1+4+2-5)/5 + (-2+5+2-2-1)/5
隨著生物重復的增多，生物偏差(5-1+4+2-5)/5 逐漸趨向於0，技術偏差也會逐漸趨向於0，這個平均數也會趨近於總體均值μ。
所以只做生物重復就可以很好的使用樣本代表總體。

只做技術重復
繼續進行實驗，下圖代表對1#小鼠測定了5次RNA-seq數據。那麼同樣方法取5個RNA-seq數據的平均：
average = μ + 5 + (-2+5+2-2-1)/5
隨著技術重復數的增加，技術偏差(-2+5+2-2-1)/5會逐漸趨近於0，而這個平均數會逐漸趨近於μ + 5，永遠也不會等於總體均值μ，因此做再多的技術重復，最終的RNA-seq數據也無法很好的代表總體。

同時做生物重復和技術重復
以下圖為例，1#小鼠做了2個技術重復，2#小鼠做了3個技術重復，此時的生物偏差為5、5、-1、-1、-1，而技術偏差不變（技術偏差是參數測定時的偏差，不會因樣本而異，而且因樣本而已的偏差肯定是樣本偏差），所以樣本均值為：
average = μ + (5+5-1-1-1)/5 + (-2+5+2-2-1)/5
隨著樣本量啟漏扮的增加，技術偏差(-2+5+2-2-1)/5會逐漸趨向於零。
但生物偏差(5+5-1-1-1)/5雖然也會收斂到0，但是此時所需要的樣本量比『只做生物重復』時大大增加，也就是說生物偏差的收斂速度變慢了。

這個生物偏差收斂變慢的速度有多慢呢？
假如多了3個技術重復，那麼就需要3倍的樣本量才能抵得上『只做生物重復』時的收斂速度。說白了，就是多做的技術重復最多不過和『只做生物重復』的效果持平而已。

做一下總結：
只做生物重復：最佳的實驗設計，可以很好的代表總體；
只做技術重復，沒有生物重復：不要使用這種實驗設計，永遠只會得到總體的有偏估計。
生物重復和技術重復：不推薦做，並不能很好的提高樣本的代表性，要麼獲得一個有偏的估計，要麼需要更多的樣本。

㈣ qpcr是什麼

qPCR（）是一種利用PCR技術定量檢測DNA或RNA的方法。它是PCR技術的一種改進，可以快速、准確地檢測DNA或RNA的數量，並且可以檢測非常少量的樣品。
qPCR的原理是在PCR反應中，通過定量檢測PCR擴增的DNA或RNA的數量，來推斷初始模板的數量。在qPCR實驗中，通常會加入一種熒光染料，這種染料在PCR反應中與擴增的DNA或RNA結合，產生熒光信團襲號。通過檢測熒光信號的強度，就可以推斷出模板的數量。
qPCR技術廣泛應用於塌脊兄醫學、生物學、生態學、農業等領域，例如檢測病原體、評估基因表達和基因型、檢野稿測環境中的微生物等。

㈤ 請問什麼叫QPCR

QPCR 問：什麼是QPCR？答：QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即實時熒光定量核酸擴增檢測系統，也叫實時定量基因擴增熒光檢測系統，簡稱QPCR。問：QPCR、DNA檢測、PCR之間的關系？答：聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction簡稱PCR）原理憑借敏感、特異、快速的特點榮獲93年諾貝爾化學獎。因其在病原體檢測方面的獨特優勢，因而發達國家在相關方法和儀器方面的研發非常快，成為分子生物學診斷的主流，至今仍處於學術和應用前沿：第一代產品：基因擴增熱循環儀（DNA Thermal Cycler）+電泳儀+紫外分析儀+定性試劑，構成PCR定性檢測。第二代產品：基因擴增熱循環儀+熒光儀+終點定量試劑，構成PCR-DNA終點法定量檢測（End-point quantitative PCR detection），又分為終點酶免定量（ End-point ELISA-PCR）和終點熒光定量（End-point Fluor-PCR）兩種。第三代產品：實時定量QPCR儀＋實時熒光定量試劑，構成QPCR-DAN/RNA實時熒光定量檢測。問：相比以前的方法，QPCR有哪些特點？答：QPCR至少有以下特點：所用儀器少，只用一台儀器。檢測時間短，只須45分鍾～1小時10分鍾（試劑各異），而定性PCR須3～4小時，酶免終點定量須6～8小時，熒光終點定量須2～3小時。操作極其簡單：前處理後，樣本插入儀器一小時後到電腦上來出報告即可，無須開蓋，移樣本（以前方法），避免污染。結果精確：定性PCR只能定性，很粗略，終點定量PCR由於只能在40個熱循環結束後檢測熒光，被測熒光達到飽和導致定量不夠精確，屬於半定量狀態。而實時熒光QPCR是在擴增的每時每刻連續檢測各樣本的熒光值的變化，如圖一所示： 圖一 西安天隆TL988實際曲線1檢測動態范圍：10～10000000000 DNA copies/ml檢測精度：0.1RLU辨別率：5000和10,000個模板拷貝樣本的辨別率99.7％。問：QPCR的技術先進性、價格及應用現狀？答：實時熒光QPCR是當今世界用於臨床的最先進核酸分子診斷技術，被美國FDA承認並推崇，被美國FDA批准並取得臨床應用執照的QPCR試劑品種有：HBV乙肝病毒DNA，HCV丙肝病毒RNA，HIV艾滋病病毒RNA，Chlamydi trachomatis（CT），性傳播疾病，沙眼衣原體，Neiserria gonorrhea(NG)，性傳播疾病，淋病雙球菌，Cytomegalovirus（CMV），性傳播疾病，巨細胞病毒，Mybobacterium tuberculosis（Mtb），呼吸道疾病，結核分支桿菌等。實時熒光PCR儀研發技術難度大，門檻高，發達國家也只有有限幾家知名公司生產，且售價昂貴：如美國ABI/7700-120萬元，美國ABI/5700-50萬元，瑞士Roche/Lightcycler-70萬元，美國Stratagene公司2005年新品MX3005P-80萬元 可見，在病人看來，哪家醫院應用了QPCR技術便是先進診斷技術的象徵，在發達國家也是如此。 國產儀器情況：國產儀器生產單位不超過五家，其中包括：日本獨資杭州博日實時熒光QPCR儀（33孔）西安天隆科技有限公司TL988實時熒光QPCR儀（48孔） 以上產品均取得國家SFDA認證，報價均在45萬以上。 國產試劑情況：多家公司生產實時熒光QPCR試劑盒，價格與終點法試劑相當，且品種齊全，價格便宜，購買方便：乙肝HBV-DNA，丙肝HCV-RNA，艾滋AIDSHIV-RNA，性病系列：淋病雙球菌NG、沙眼衣原體CT、解脲支原體UU、皰疹病毒HSV、人體乳頭瘤HPV，優生優育系列：巨細胞病毒CMV、弓形蟲COX等。 編輯詞條 開放分類：病毒、DNA、PCR、分子生物、實時熒光定量PCR儀 參考資料： 1. http://hi..com/pcr%D2%C7 2. http://www.medtl.com 貢獻者：zhang120jing、弦之月NONO

㈥ qpcr是否一定要有生物學重復

要的。
首先qPCR不是很准，特別是對於新手來說。
其次，三個平燃纖行以上才具有統計學皮首仿意義，三個生物學重復以上才具有生物學意義。（芹亂發表文章時需要）