微生物標准方法怎麼驗證

❶ 葯品領域的微生物檢測及標准

中國葯典微生物限度檢查法，為《中國葯典》附錄收載的關於葯品微生物檢查的法定方法。葯品的不同劑型的微生物檢測標准不同，具體如下：

1、制劑通則品種

制劑通則、品種項下要求無菌的制劑及標示無菌的制劑應符合無菌檢查法規定。

2、口服給葯制劑

細菌數每1g不得過l000cfu。每lml不得過100cfu。

黴菌和酵母菌數每lg或lml不得過100cfu。

大腸埃希菌每1g或lml不得檢出。

3、耳、鼻及呼吸道吸入給葯制劑

細菌數每1g、lml或l0cm²，不得過100cfu。

黴菌和酵母菌數每1g、lml或l0cm²，不得過10cfu。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每1g、lml或l0cm²不得檢出。

大腸埃希菌鼻及呼吸道給葯的制劑，每1g、lml或l0cm²，不得檢出。

4、陰道、尿道給葯制劑

細菌數每1g、lml或l0cm²，不得過100cfu。

黴菌數和酵母菌數每1g、lml或l0cm²應小於10cfu。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌每1g、lml或l0cm²，不得檢出。

5、直腸給葯制劑

細菌數每1g不得過l000cfu。每lml不得過100cfu。

黴菌和酵母菌數每1g或lml不得過100cfu。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每lg或lml不得檢出。

6、其他局部給葯制劑

細菌數每1g、lml或l0cm²不得過100cfu。

黴菌和酵母菌數每1g、lml或l0cm²不得過100cfu。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每1g、lml或l0cm²不得檢出。

7、含動物組織

含動物組織（包括提取物）的口服給葯制劑每10g或10ml還不得檢出沙門菌。

8、兼用途徑制劑

應符合各給葯途徑的標准。

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微生物限度檢查法的注意事項：

1、當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所採用的方法適合於該產品的控制菌檢查。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，檢查方法應重新驗證。

2、檢查項目應當包括細菌數、黴菌數、酵母菌數及控制菌檢查。

3、微生物限度檢查應在環境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區域內進行。

4、檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染。單向流空氣區域、工作檯面及環境應定期按《醫葯工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標准進行潔凈度驗證。

5、除另有規定外，本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為30℃～35℃；黴菌、酵母菌培養溫度為23℃～28℃。

6、檢驗結果以1g、1ml、10g、10ml、10c_為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。

❷ 純化水的微生物驗證大家是怎麼做的

首先：只做菌落總數和總大腸菌群兩項。
其次：當總大腸菌群產酸產氣時，根據需要做耐熱大腸菌群，和大腸埃希氏菌檢測。
在做大腸檢測時，有多管發酵法、濾膜法、酶底物法三種方法，可根據實驗室實際情況選擇具體方法。
標准參照「GB/T 5750.12-2006 生活飲用水標准檢驗方法 微生物指標」
需要請留郵箱

❸ 無菌檢驗方法驗證

無菌檢查 方法 是為了檢查葯典要求無菌的制劑及其他製品是否無菌而建立的試驗方法！至於無菌檢查具體有哪些驗證方法呢？下面就隨我一起來了解下吧！

無菌檢驗方法驗證

無菌檢查方法驗證一般分為前驗證和再驗證兩種。

前驗證，也稱預驗證，指在無菌分析方法正式使用前，按照預定驗證方案進行的驗證。如果沒有充分的理由，任何檢查方法必須進行前驗證。

再驗證，指某一檢查咐戚前方法經過驗證並在使用一段時間後進行的，旨在證實已驗證狀態沒有發生飄移而進行的重新驗證及對檢查方法進行修訂、改變時進行的驗證。

通常一個無菌產品的檢查流程為：首先基於產品的劑型、溶解度等性質，按照葯典的要求確定是否需要進行前處理;然後根據產品的特性是否有抑菌性，確定是否需要增加去除產品抑菌性的方法;最後驗證整個檢查方法中用到的一切及試驗過程中的每一個環節包括樣品的預處理方式、檢查過程、培養條件等均不影響樣品中微生物的生長。

前處理方法直接影響後續步驟的效果和重現性，應是驗證的重點。

供試品中抑菌活性的去除是當前驗證工作的重點，尤其強調應充仔跡分驗證供試品本身對微生物生長的影響。

(一)具體的驗證方法如下：

1. 菌種的選擇

無菌檢查方法驗證中通常選擇以下6種試驗中常用的控制菌的標准菌株，它們分別代表不同類型的菌種：枯草芽孢桿菌 [CMCC(B)63 501]代表葯品中常見的污染菌——芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌 [CMCC(B)26 003]代表革蘭陽性菌、生孢梭菌 [CMCC(B)64 941]代表厭氧菌、大腸埃希菌 [CMCC(B)44 102]代表革蘭陰性菌、白色念珠菌 [CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑麴黴菌 [CMCC(F)98 003]代表黴菌。

2. 菌液的制備

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30~35 ℃培養18~24h;接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，23~28℃培養24~48h，上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml含菌數小於100cfu的菌懸液。接種黑麴黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，23~28 ℃培養5~7天，加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然後，採用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml含孢子數小於100cfu的孢子懸液。

3. 樣品的前處理

無菌產品中每個成分應該是均勻的，因此只要確定在驗證的方法中，按所需的總接種量即可，而不必像樣品日常檢測中按規定的容器數取樣。

如果制備樣品時需要使用溶解劑、稀釋劑、助溶劑、破乳劑等溶劑，需要確保這些溶劑是有效的，並且其使用對微生物生長無影響;或者制備過程中需要對樣品進行加熱助溶、離心等操作時，需要確保加熱的溫度、離心速度和離衡清心時間等對微生物生長或分布無影響。 不需前處理的樣品免做。

(二)消除樣品抑菌性的方法

無抑菌性樣品的驗證方法：依據產品溶解性和微生物限度選擇合適的中性稀釋劑溶解和稀釋，用直接接種法驗證，常用中性稀釋液或淋洗液。

對於具有抑菌性樣品的驗證方法，首先確定樣品的抑菌作用(抑細菌、真菌試驗驗證)，選擇敏感標准菌株對供試品抑菌活性去除效果檢查(陽性菌回收試驗)。 常用的消除樣品抑菌活性的方法如下：

1. 稀釋法：利用降低供試品的相對濃度，將樣品稀釋至最低抑菌濃度下進行。如：取規定量的樣品溶液至較大量的培養基中，使單位體積內的樣品含量減少，至不含抑菌作用。

2. 薄膜過濾法：利用體積差異分離，通過薄膜過濾，微生物被截於濾膜，培養薄膜觀察有無微生物生長。通常薄膜孔徑應不大於0.45μm，直徑一般為50?mm，若採用其他直徑的濾膜，沖洗量應進行相應的調整。濾器和濾膜在使用前採用適宜的方法進行滅菌。使用時應保證濾膜在過濾前後的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試液其濾膜和濾器在使用前應充分乾燥。 供試液經過濾膜過濾後，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100?ml。總沖洗量不得超過1000ml。

3. 化學中和法：利用化學(生物)專屬性滅活，常用中和劑或滅活方法有：對氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。對化學中和劑不敏感的樣品，用酶中和，如β -內醯胺酶。

4. 聯合使用：將以上兩種或幾種方法組合運用，以消除樣品的抑菌性。適用於抑菌作用較強的中西葯制劑。

5. 其次按照以下要求制備3組樣品：

樣品組：選擇以上適當的方法中和樣品，加入少量驗證微生物(接種量少於100cfu)。

對照組：0.1%蛋白腖或pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液,加少量微生物(接種量少於100cfu)。

陽性對照組：將試驗菌株直接接種於培養基中(接種量少於100cfu)。

6. 最後結果分析如下：

樣品組與對照組微生物生長數量相似，表明中和劑的中和方式有效消除了樣品的抑菌性(即有效性)，如果對照組與陽性對照組的微生物數量相似，表明樣品預處理、消除樣品抑菌性的方法、檢測程序和培養條件等均不影響微生物生長(即無毒性)。樣品如無抑菌性，省去對照組試驗，樣品組與陽性對照組直接比較。樣品組微生物生長數量不及陽性對照組微生物生長數量，表明樣品的預處理、試驗用器具材料、培養條件等方面存在對微生物生長不利的因素。

(三) 為考查驗證方法的穩定性和重現性，驗證至少需3個不同批次的同類樣品，分別進行3次驗證試驗。

無菌檢查方法驗證試驗設計

薄膜過濾法：按照葯典的要求取每種培養基規定接種的樣品總量按薄膜過濾法過濾、沖洗，在最後一次的沖洗液中加入小於100cfu的試驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養或改良馬丁培養基中，或將培養基加至濾桶內。另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。按照葯典的要求的溫度和時間進行培養。

直接接種法：取符合直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養基8管，分別接入小於100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管;取符合直接接種法培養基用量要求的改良馬丁培養基4管，分別接入小於100?cfu的白色念珠菌、黑麴黴各2管。其中1管接入每支培養基規定的供試品接種量，另1管作為對照，按照葯典的要求的溫度和時間進行培養。

結果判斷

同對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明驗證通過;如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，驗證失敗，應採用增加沖洗量、增加培養基的用量、使用中和劑和滅活劑、更換濾膜等方法，消除供試品的抑菌作用，重新進行驗證。

無菌檢查的常見方法

首先要檢查方法驗證方案設計的科學性和完整性，是否有與葯典方法相悖的地方，尤其是產品本身的抑菌性，檢查方法的選擇，是直接接種法還是薄膜過濾法等。

無菌檢查方法驗證的硬體是否具備及是否已經進行了相關的確認。如使用黑麴黴菌是否具有生物安全櫃並進行確認，無菌室的確認及日常監測，培養箱的型號及數量和進行確認的情況等，智能集菌器、全封閉無菌試驗過濾培養器的型號、性能，濾膜是否符合規定等。

驗證中各個環節有關數據的真實性，如產品本身抑菌性試驗數據，菌種回收率和培養基適用性和靈敏度檢查數據，菌種的傳代、銷毀和使用記錄，無菌檢查操作記錄、培養記錄等。

無菌檢查中偏差的處理是否真的找到了根本原因，是否在沒有確切的原因前就對樣品重新檢查並依據新的檢查結果放行產品。

驗證的方法與無菌檢查操作規程和無菌檢查記錄是否完全一致，如操作步驟、檢查方法、檢查環境、試驗耗材均需與實際檢查操作規程及驗證過程完全相符。

為了考查驗證方法的穩定性和重現性，驗證時是否至少採用了3個不同批次的同類樣品，分別進行了3次驗證試驗。

使用新的濾膜或過濾器(不同廠家或批號、型號)是否重新進行樣品試驗組、蛋白腖對照組和陽性對照組的驗證確認。

除非樣品不能採用過濾的方法(難溶解)，企業是否採用全封閉的薄膜過濾法。

菌液的保存條件和保存期限是否符合葯典的要求，對於黑麴黴孢子懸液是否有驗證的資料。

無菌檢查的注意事項

培養基的適用性檢查包括培養基的無菌性檢查和培養基的靈敏度檢查。

中國葯典附錄中規定的檢驗數量不包括陽性對照用樣品量，雖然附錄另處有專門說明，仍然容易忽略。

無菌檢查時應強調“檢驗數量”，主要是保證試驗結果的代表性，而陽性對照試驗和驗證時僅須滿足“檢驗量”總量要求即可，以保證試驗結果的可靠性，驗證試驗可以由此減少大量的樣品;工作菌株的傳代次數不得超過5代，以防止過度的傳代增加菌種變異的風險。這里“代”的定義是指，活的培養物接種到微生物生長的新鮮培養基中培養，任何亞培養的形式均被認為是轉種或傳代一次。

菌液加入，按規定應在最後一次沖洗液中加入陽性菌液，主要是考慮過濾器的有效性。過濾器的有效性應由提供企業控制，用戶可採用適當方法抽查(如檢查陽性菌液通過濾筒的流出液)。

實驗室菌種的處理和保存的程序應標准化，以盡可能減少菌種污染和變異。

試驗時菌懸液並不是只要活的菌體就行，而是要保持旺盛的生命力，所以菌懸液存放時間不能太長。

菌液制備後若在室溫下放置，應在2?h內使用，若保存在2～8℃，可在24?h內使用。黑麴黴孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內使用。

薄膜過濾法採用大樣品量集菌的方法，具有代表性，不易漏檢，儀器操作相對簡單。該系統是全封閉過濾系統，避免了操作過程中外源性微生物的污染，對試驗結果的可信性影響較小。因此無菌試驗採用薄膜過濾法還是直接接種法並不依賴於驗證結果，而是取決於樣品的特性，如能採用過濾的方法均應採用薄膜過濾法檢查。

若樣品含有抑菌成分，當採用薄膜過濾法時，應先將供試液稀釋後在過濾，這樣可以減少濾膜對樣品的吸附，減少沖洗量，進而減少微生物的損失或傷害。

無菌檢查應作為穩定性考察的項目進行，以便對產品有效期的制定和合理的確定儲存條件提供重要的依據。

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❹ 微生物計數方法驗證需要怎麼准備

微生物限度檢查方法學驗證

1、供試品：XXXXX膠囊（批號：XXXXXX）

2、菌種：

菌落計數用菌種：

(1) 枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]

(2) 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]

(3) 大腸埃希菌[CMCC（B）4]

(4) 白色念珠菌[CMCC (F) 98001]

控制菌檢查用菌種：

(1) 大腸埃希菌[CMCC（B）4]

(2) 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]

3、培養基：營養肉湯培養基、改良馬丁培養基、營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、4-甲基傘形酮葡糖苷培養基（MUG）。

4、預試驗 按照中國葯典2005年版微生物限度檢查法中常規法及培養基稀釋法檢驗，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均小於70%，本品有抑菌作用。

5、細菌、黴菌及酵母菌計數

按照中國葯典2005年版微生物限度檢查法進行細菌、黴菌及酵母菌計數的方法學驗證試驗及菌落計數。

5.1菌液制備：

(1) 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至10ml營養肉湯中，35～37℃培養18～24小時，取此培養液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，使菌數約為50～100cfu/ml。

(2) 接種白色念珠菌的新鮮培養物至10ml改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48小時，取此培養液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，使菌數約為50～100cfu/ml。

5.2 供試液的制備 取供試品10g，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml，振搖，使呈1：10的供試品儲備液。取1：10的供試品儲備液 10ml

❺ 膏劑微生物檢測方法

膏劑微生物檢測方法
答案如下：膏劑微生物檢測方法：取供試品，去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無菌玻璃或塑料器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無菌多孔材料

❻ 微生物檢驗常見問題解答

微生物檢驗常見問題解答

你知道什麼是微生物檢驗嗎?你對微生物檢驗常見問題了解嗎?下面是我為大家帶來的微生物檢驗常見問題解答的知識，歡迎閱讀。

一、方法驗證

1.做過驗證的樣品微生物檢驗方法是否都需要按照新的方法進行重新驗證?

答：對於微生物限度檢查的產品而言，由於培養時間調整，應重新進行驗證。對於無菌檢查的產品而言，如果方法未作實質性調整，可以不必重新驗證。個別產品在各論中收載了新的無菌檢查方法，對這些品種，應對收載方法的適用性進行驗證。

2. 以前做過無菌驗證的品種是否需要重新按照新的標准再驗證?

答：參見問題1。

3. “新增抗生素供試品應選擇低吸附的濾器及濾膜” 比如注射用克林黴素磷酸酯屬於抗生素，是否需要重新選取濾膜再驗證?

答：目前採用的方法如果經驗證表明可行，則可以繼續使用該方法。

4. 微生物方法學驗證時，培養時間是否跟樣品日常檢驗所培養時間一致?

答：應該一致。

5. 微生物限度驗證時，如果一個方法只有金葡回收率達不到要求，該方法時是否可以用來做細菌黴菌的檢測方法?

答：按葯典的規定，一個計數方法通過驗證，是指所有試驗菌的回收率均達到要求。如果採用各種方法以及方法的組合仍無法使金葡回收率達標，則可以採用使金葡回收率最高的方法作為計數方法。

6. 薄膜過濾的沖洗量不能超過1000ml，我公司的喹諾酮類產品原來的方法是每張膜沖洗量為1500和2000ml，請問有沒有合適的方法將沖洗量降至1000，各菌的回收率仍能符合規定?

答：有幾種辦法可以降低沖洗劑的用量：1)降低接觸濾膜的供試品的濃度;2)改進沖洗的方式，如少量多次地沖洗、降低蠕動泵的轉速等;3)添加中和劑，如高價金屬離子。

7. 微生物限度檢查法規定，技術方法驗證時，採用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那麼選擇回收率最接近要求的方法和試驗條件進行供試品檢驗。請問，上述方法是指僅通過一種方法還是一定要通過幾種方法聯用的?

答：應該要把可能採用的所有方法包括方法聯用都進行驗證。

8. 供試品不溶於稀釋劑，同時又有抑菌性，限度檢查時應如何消除抑菌性?

答：採用低速離心的方式，盡可能把供試品去除干凈，取離心後的上層液，進行薄膜過濾。

9. 不溶於水的固體產品，加表面活性劑後，如何操作才能在方法驗證中得到較好的回收率?

答：同問題8。

10. 有些品種2010年葯典與2005年比較檢驗方法變了，是否需要驗證或確認?

答：同問題1。

二、菌種管理

1. 濃菌液的有效期該如何確定?

答：葯典沒有規定。可以通過實驗確定有效期。例如，在不同的時間點測定濃菌液的濃度，從而判斷其有效期。

2. 葯典要求菌液在制備後2小時內使用，若保存在2-8℃的菌懸液可在在24小時內使用，那我們在做驗證或陽性對照是要加一定量的菌就沒有時間進行平板計數了，該如何確保所加菌量准確?

答：葯典對稀釋菌液的使用期限作出規定，並不會影響操作過程中稀釋菌液的加入。即便不規定，也無法在准確知道菌液濃度的情況下加入試驗菌。菌液稀釋的實驗操作和加入菌液的實驗操作應該是在同一次實驗中完成的，要使加入的菌量符合葯典的規定，可以從濃菌液的制備方法、菌液稀釋的方法等方面進行規范，也可以引入濁度比較的方法。

3. 菌懸液能否在倒平板之前確定菌含量?

答：活菌含量是無法確定的。總菌量可以通過比濁的方式確定。

4. 具體從哪些方面進行菌種菌株的特性和純度確認?如何操作?

答：基層的微生物實驗室進行菌種純度確認可以考慮以下一些方面：1)形態學鑒定，包括菌落形態和染色形態;2)生化鑒定，可以考慮使用API鑒定系統。

5. 黑麴黴凍干菌種如何轉種，傳代?

答：與其他菌種一樣，所不同的是使用的培養基應改為改良馬丁瓊脂培養基。

6. 乾粉狀的是否可做第0代使用?

答：只要是菌種保藏機構提供的凍干保藏的菌種，可以確定為第0代。

7. 菌種每次傳代都要做純度、特性等的確認嗎?

答：從外部購入的菌種，在進入本實驗室的菌種保藏體系時，需要進行純度和特性的確認。以後的每次傳代，可以通過顯色培養基做簡單的確認即可。

8. 如採用低溫保存菌種，需購買哪些設備?能夠到省所進行實際操作培訓?

答：低溫冰箱，應能夠提供-70℃的低溫。可以到省所來培訓。

9. 做方法驗證時，工作用菌種能否同時操作，如何防止交叉污染?

答：可以同時操作。避免交叉污染的關鍵是無菌操作技術。

10. 是否等菌懸液的含菌數出結果後再做適用性等檢查?

答：沒有必要。可參見問題2。

11. 菌液制備中菌液是否都要驗證儲存期?

答：稀釋菌液可參考葯典規定。如要保存濃菌液，則需要驗證有效期。

12. 菌種CMCC是否可以用ATCC替代，從省所或中檢所購買的菌種是否每次都可以出具規范的COA?

答：中國葯典使用CMCC的菌種，並沒有規定可以使用其他等效的菌種。省所提供的菌種嚴格講屬於標准貯備菌種，無法提供ATCC這樣的COA。CMCC至今也無法提供這類證明。

13. 銅綠假單胞如何保藏?答：可以使用低溫冷凍保存的方法。14. 工作用菌液是否屬於亞培養或傳代一次?

答：工作用菌液應屬於一次傳代。

三、微生物限度

1. 包裝材料的大腸埃希菌檢查?

答：根據包裝材料的不同，大腸埃希菌的檢查方法大致有兩種，一種是將浸提液合並後，取一部分，接種膽鹽乳糖培養基進行檢查;另一種是將浸提液合並後，薄膜過濾，然後按規定的方法檢驗。

2. 抗真菌葯品的微生物限度檢查法

答：這類產品的黴菌和酵母菌計數方法需要進行調整，可以根據產品劑型的不同，選擇薄膜過濾法或培養基稀釋法等方法。

3. 為什麼在日常樣品檢測中還需要做陽性對照(國外不需要)?

答：為了確保每一次檢測對可能存在的微生物都是有效的`。

4. 對於同一個品種，葯典為什麼不規定統一的檢測方法?

答：本版葯典進行過這樣的嘗試，也有某些品種已經收載了統一的檢測方法，如注射用頭孢類抗生素的無菌檢查。之所以沒有大量收載，主要是由於檢測方法還沒有經過必要的復核。將微生物檢驗的統一方法收載在品種的各論項下，始終是努力的方向。

5. 梭菌檢查中需置厭氧條件下培養48小時，是否指在厭氧培養箱中?

答：需要在厭氧培養裝置中進行培養，未必一定是厭氧培養箱。

6. 控制菌檢查方法驗證時，採用多種方法均未檢出控制菌，如何處理?

答：在確保所使用的各種方法都沒有錯誤的情況下，如果仍無法使試驗菌生長，則應該採用薄膜過濾法進行檢查。理由是該方法能夠最大程度地去除產品的抑菌作用。

7.常規的監督抽樣檢品(包括原料)在進行微生物限度檢查時，是否一定要進行活蟎檢查並在原始記錄與報告書中體現?

答：需要進行檢查。可以在原始記錄中體現，報告書上可以不出現，除非當發現有活蟎檢出。

8. 葯包材微生物限度檢查規定了合格質量水平，通常產量下取樣8個，要求8個瓶子均符合規定，如何進行?

答：每個瓶子分別進行實驗。

9. 大腸埃希菌具體操作規程?

答：參見中國葯品檢驗標准操作規程。

10. 動物組織及動物類原葯材的提取物入葯，是否需要檢沙門菌?

答：需要進行沙門菌檢查。

11. 關於中國葯典菌落計數結果的判斷還存在疑義，望能舉例說明。

答：不清楚所指的存在疑義是指哪方面。2010年版對結果報告進行了較大篇幅的修訂，目前的規定應該比05版更為清晰、明確。

12. 需做沙門菌檢驗樣品量的確定?

答：10g(ml)用於樣品計數檢驗和其他控制菌檢查，10g(ml)用於沙門菌檢查，10g(ml)用於沙門菌檢查的陽性對照。需要進行沙門菌檢查的樣品，檢驗用量應為30g(ml)。

13. 日常的實驗室裝備能否達到梭菌無氧的培養要求?

答：完全可以。可以採用厭氧培養盒(罐)。

14. 如果一個產品有兩個規格，是否可以取其中之一做陽性對照?

答：每個規格均需進行陽性對照。

15. 細菌數為100g/g的，樣品稀釋級只做1:10,1:100的倍數就可以了嗎?

答：可以。

16. 培養時間3天，5天，可理解為72小時，120小時嗎?

答：可以。這樣更為嚴謹。

17.中國葯品檢驗標准操作規范“已做驗證試驗的供試品，在檢查時刻不必再做陽性對照”如何理解?

答：該標准操作規范中在無菌檢查法中規定“供試品無菌檢查應進行陽性對照試驗”，表明不論是否進行了方法驗證，在產品的每一次檢驗過程中，還必須進行陽性對照。在控制菌檢查的大腸埃希菌項下，指出“已做驗證試驗的供試品，在該供試品檢查時不必再作陽性對照”。該規定僅適用方法驗證與供試品檢查同時開展的情況。2005年版葯典和2010年版葯典在控制菌檢查中均對陽性對照試驗有明確規定，“進行供試品控制菌檢查時，應做陽性對照試驗。”產品檢驗中應以葯典規定為准。

18. 無菌檢查和微生物限度檢查中，產品中規定的溶解液是否可以換成其他的溶液?

答：可以。

19. 制劑通則中，沒有微生物檢查項目的，是否可不進行微生物項目檢測?

答：可以。主要是二部制劑通則中口服片劑、膠囊劑、丸劑和顆粒劑。

20. 在細菌、黴菌和酵母菌計數中，適用性檢查細菌是培養48小時，黴菌和酵母菌是培養72小時，供試品檢查中細菌是培養3天，黴菌和酵母菌是培養5天，那方法驗證中應參照哪個時間進行培養。

答：應按照供試品檢驗時的條件，即細菌3天，黴菌和酵母菌5天。

21. 測定純化水微生物限度時，每張濾膜過濾量是多少合適?需要先稀釋嗎?過濾完後需不需要沖洗?假如我取10ml純化水通過雙杯體封閉式薄膜過濾器過濾，每張濾膜上的計數是以5ml為單位還是10ml為單位?

答：過濾量應以培養後出現的微生物數不超過100cfu/膜為標准。一般可不稀釋。不需要沖洗。每張濾膜的過濾量為5ml。

22. 2010葯典中關於純化水的微生物限度是：細菌、黴菌及酵母菌總數每1ml不得過100個。這句話的意思是細菌總數每1ml不得過100個，黴菌及酵母菌總數不得過100個，還是細菌+黴菌+酵母菌總數每1ml不得過100個。如果是三者總數的話，那細菌總數限度是多少?黴菌及酵母菌總數限度又是多少?

答：是總數不得過100個。沒有必要考慮各自的限度值。

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❼ 微生物生長的幾種檢測方法

一、生長量測定法

1.1體積測量法：又稱測菌絲濃度法。

通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間（如5分鍾）和轉速（如5000rpm），離心後，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。

1.2稱乾重法：

可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速，進行離心，並用清水離心洗滌1-5次，進行乾燥。乾燥可用烘箱在105℃或100℃下烘乾，或採用紅外線烘乾，也可在80℃或40℃下真空乾燥，乾燥後稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾後用少量水洗滌，在40℃下進行真空乾燥。稱乾重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常採用這種方法，如活性乾酵母（activitydryyeast,ADY）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

1.3比濁法：

微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可採用一種特製的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用於發酵工業菌體生長監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600nm處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.Coli的生長及誘導時間。

1.4菌絲長度測量法：

對於絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度，或是利用一隻一端開口並帶有刻度的細玻璃管，到入合適的培養基，卧放，在開口的一端接種微生物，一段時間後記錄其菌絲生長長度，藉此衡量絲狀微生物的生長

二、微生物計數法

2.1血球計數板法:

血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平台，兩嵴的表比兩平台的表面高0.1mm，每個平台上刻有不同規格的格網，中央0.1mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜於單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，並且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

2.2染色計數法：

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。藉助不同的染料對菌體進行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色後在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。

2.3比例計數法：

將已知顆粒（如黴菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較粗放。並且需要配製已知顆粒濃度的懸液做標准。

2.4液體稀釋法：

對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15隻裝培養液的試管中，經培養後記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然後查最大或然數表MPN（mostprobablynumber）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用於食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

2.5平板菌落計數法：

這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定

體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液塗布於已凝固的固體培養基平板上。保溫培養後，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。

2.6試劑紙法：

在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色）待蘸取測試菌液後置密封包裝袋中培養。短期培養後在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標准紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷准確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

2.7膜過濾法：

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。

2.8生理指標法：

微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸鹼度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的'生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。

2.9測定含氮量：

大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%，酵母為7.5%，黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱後產生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO2後即可測出N2的量。

2.10測定含碳量：

將少量（乾重0.2-2.0mg）生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在1000C下加熱30分鍾後冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標准樣品做標准曲線。

2.11還原糖測定法：

還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生(轉載於:mHg）的條件下才能生長，他們有完整的呼吸鏈，以分子氧為最終氫受體，具有超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶。

兼性厭氧菌:它是以在有氧條件下的生長為主也可兼在厭氧條件下生長的微生物，有時也稱「兼性好氧菌」。

微好氧菌:只能在嬌滴滴額氧分壓（1.33~3.Pa，正常大氣中的氧分壓為0.2bar）下才能正常生長的微生物。

耐氧菌:耐氧性厭氧菌的簡稱，是一類可在分子氧存在下進行發酵性厭氧生活的厭氧菌。

厭氧菌:有一般厭氧菌與嚴格厭氧菌（專性厭氧菌）之分。

超氧陰離子自由基:活性氧的形式之一，因有奇數電子，故帶負電荷；它既有分子性質，又有離子性質；其性質極不穩定，化學反應力極強，在細胞內可破壞各種重要生物大分子和膜結構，還可形成其他活性氧化物，故對生物體極其有害。

超氧化物歧化酶(SOD):保護好氧菌免受超氧化物陰離子自由基的毒害的酶。按SOD分子中所含金屬輔基的不同分三類：1、含Cu、Zn的SOD，存在於幾乎所有真核生物的細胞質中；2、含Fe的SOD，主要存在原核生物中；3、含Mn的SOD，主要存在於真核生物的線粒體中。SOD除可清除超氧陰離子自由基外，還發現在防治人體衰老、治療自身免疫性疾病、抗癌、防白內障、治療放射病和肺氣腫以及解除苯中毒等方面有一系列療效。

PRAS培養基:用嚴格厭氧方法配置、分裝、滅菌後的厭氧菌培養基，稱為預還原無氧滅菌培養基，即PRAS培養基。

厭氧罐:培養厭氧菌的裝置。

亨蓋特滾管技術:一種集制備高純氮、以氮驅氧和全過程實現無氧操作、無氧培養、無氧檢測於一體，用於研究嚴格厭氧菌的技術和裝置。

厭氧手套箱:一種用於無氧操作和培養嚴格厭氧菌的箱形密閉裝置。

搖瓶培養:一般將三角瓶內培養液的瓶口用8層紗布包紮，以利通氣和防止雜菌污染，同時減少瓶內裝液量，把它放在往復式或旋轉式搖床上作有節奏的震盪，以達到提高溶氧量的目的。

曲:是一類用麩皮、米糠等疏鬆的固體營養料接種、培養微生物而製成的含氧活菌產品。

曲法培養:將麩皮、碎麥或豆餅等固態基質經蒸煮和自然接種後，薄薄地鋪在培養容器表面，使微生物即可獲得充足的氧氣，又有利於散發熱量，對真菌來說，還有利於產生大量孢子。

通風曲:一種機械化程度和生產效率都較高的現代大規模製曲技術，在我國醬油釀造業中廣泛應用。

污染:有害微生物通過氣流、水流、接觸和人工接種等方式，傳播到合適的基質或生物對象上而造成種種危害。

巴氏消毒法:有發過微生物學家巴斯德用於果酒消毒，故名。這是一種專用於牛奶、啤酒、果酒或醬油等不宜進行高溫滅菌的也太風味食品或調料的低溫消毒方法（一般在60-85度下處理30min至15s）。有兩種方法：1、低溫維持法；2、高溫瞬時法。

間歇滅菌法:適用於不耐熱的培養基滅菌。方法是：講帶滅菌的培養基放在80-100度下蒸煮15-60min，以殺滅其中所有的微生物營養體，然後放至室溫37度下保溫過

夜，誘使其中殘存的芽孢發芽，第二天再以同樣方法蒸煮和保溫過夜，如此重復3天即可在較低的滅菌溫度下同樣達到徹底滅菌的效果。

連續加壓蒸氣滅菌法:讓培養基在管道的流動過程中快速升溫、維持和冷卻，然後流進發酵罐。

梅拉特反應:高溫滅菌時，培養基中得氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白質）的游離氨基與羧基化合物（糖類）的羰基間發生復雜的化學反應，導致培養基褐變同時，還降低了有關營養物成分，故應設法避免。

石炭酸系數:一定時期內，被試葯劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度與達到同效果的石炭酸的最高稀釋度之比。

抗生素:一類有微生物或其他生物生命活動過程中合成的此生代謝產物或其人工衍生物，他們在很低濃度時就能一直或干擾他種生物的生命活力，因而可用作有兩的化學治療劑。

抗代謝葯物:一類在化學結構上與細胞內必要代謝物的結構相似，並可干擾正常代謝活動的化學物質。3種作用：1、與正常代謝物一起共同競爭酶的活性中心，從而使微生物正常代謝所需要的重要物質無法正常合成，例如磺胺類；2、「假冒」正常代謝物，使微生物合成出無法正常生理活動的假產物，如8-重氮鳥嘌呤取代鳥嘌呤而合成的核苷酸就會產生無正常功能的RNA；3、某些抗代謝葯物與某一生化合成途徑的終產物結構類似，可通過反饋調節破壞正常代謝調節機制，例如，6-巰基腺嘌呤可抑制腺嘌呤核苷酸的合成。

選擇毒力:大於病原菌具高度毒力而對其宿主基本無毒的化學物質來抑制宿主體內病源微生物的生長繁殖，藉以達到治療該宿主傳染病的一種措施。

❽ 微生物限度檢查法的結果判定

被檢培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數的比值大於70%，且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致。判該培養基的適用性檢查符合規定。計數方法的驗證當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所採用的方法適合於該產品的細菌、黴菌及酵母菌數的測定。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，計數方法應重新驗證。驗證時，按供試液的制備和細菌、黴菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證。菌種及菌液制備 同計數培養基的適用性檢查驗證方法 驗證試驗至少應進行3 次獨立的平行試驗，並分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。
（1）試驗組 平皿法計數時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml 和50～100cfu 試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。薄膜過濾法計數時，取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最後一次的沖洗液中加入50～100cfu 試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數。
（2）菌液組 測定所加的試驗菌數。
（3）供試品對照組 取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。
（4）稀釋劑對照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1ml 供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。結果判斷 在3 次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低於70%。若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率）均不低於70%，照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、黴菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低於70%，應採用培養基稀釋法、離心沉澱法、薄膜過濾法、中和法（表1）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物 可選用的中和劑或滅活方法戊二醛 亞硫酸氫納酚類、乙醇、吸附物 稀釋法醛類 稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽季銨類化合物（QACs）、對羥基苯甲酸酯、 卵磷脂、聚山梨酯汞類制劑 亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽雙胍類化合物 卵磷脂酒、洗必泰類 聚山梨酯鹵化物 硫代硫酸鹽 乙二胺四乙酸（EDTA） 鎂或鈣離子磺胺類 對氨基苯甲酸。
若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，那麼驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌污染。但是，供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑製作用，而對其他菌株沒有抑製作用。因此，根據供試品須符合的微生物限度標准和菌數報告規則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應採用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。計數方法驗證時，採用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那麼選擇回收情況最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。驗證試驗也可與供試品的細菌、黴菌及酵母菌計數同時進行。 取規定量供試液及10～100cfu 試驗菌加入增菌培養基中，依相應控制菌檢查法進行檢查。當採用薄膜過濾法時，取規定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最後一次沖洗液中，過濾後，注入增菌培養基或取出濾膜接入增菌培養基中。結果判斷 若上述試驗檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應採用培養基稀釋法、離心沉澱集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。供試品檢查供試品的控制菌檢查應按已驗證的方法進行，增菌培養基的實際用量同控制菌檢查方法的驗證。陽性對照試驗 供試品進行控制菌檢查時，應做陽性對照試驗。陽性對照試驗的加菌量為10～100cfu，方法同供試品的控制菌檢查。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。陰性對照試驗 取稀釋液10ml 照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應無菌生長。

❾ 微生物的傳統檢測方法有哪些

傳統檢測有三種方法

1、直接顯微鏡觀察，正常情況，在一定的培養條件下（相同的培養基、溫度以及培養時間），同種微生物表現出穩定的菌落特徵。可以通過顯微鏡觀察菌落特徵對微生物種類進行判斷。

2、選擇培養基培養微生物或人為提供有利於目的菌株生長的條件，選擇培養基，其作用是允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他微生物生長。選擇培養一般是通過觀察微生物的同化作用類型或某一特徵進行間接判斷，得到的微生物往往並不只有一種，但是能夠大致確定這些微生物存在的共有特徵從而對其分類。

3、鑒別培養基，根據微生物的代謝特點，在培養基中加入某種指示劑或化學葯品。與選擇培養相比，鑒別培養基的鑒別所得結果的范圍比較小，一般可直接測定某微生物的種類。

❿ 微生物的方法確認怎麼做

這在不同樣本中的確定方法是不同的，在實際工作中各種情況還是很復雜的，也需要比較多的經驗來進行判斷，並不是一句兩句就能說清楚的。
簡單說一下:
首先假設在樣本中檢測到明確為致病微生物的細菌，那麼就可以說明這些細菌，很可能是導致疾病的微生物，比如沙門氏菌志賀氏菌，金黃色葡萄球菌等。
在無菌體液中，比如血液，骨髓，腦脊液等檢測出來細菌那麼也可以明確這些細菌是導致疾病的微生物。
在含有正常菌群的體表或者體腔管道內，賤廚拉菲正常菌群，並且數量比較多的細菌，那麼這種細菌可能也是致病微生物。