微生物質譜分析儀怎麼使用

A. 應用質譜儀鑒定細菌需要多長時間

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是20世紀80年代發展起來的一種新型軟電離有機質譜, 作為一種新興的蛋白質組學檢測技術, 現已廣泛應用於生命科學及相關領域。同時作為一項新興的微生物鑒定技術, 受到了國內外的廣泛關注。與傳統的生化表型鑒定方法和分子生物學方法相比, MALDI-TOF MS具有操作簡單、快速、准確和經濟的特點。早在1975年, ANHALT等[1]利用質譜儀結合高溫裂解技術第1次完成了細菌的鑒定, 從此拉開了質譜鑒定細菌的「 序幕」 。隨著質譜檢測技術的不斷完善和發展, 近年來, MALDI-TOF MS已經成功應用於微生物的鑒定, 顯示了其在細菌、酵母菌等鑒定方面均具有良好的應用價值。眾多的研究表明, MALDI-TOF MS技術對培養出的純菌落進行菌種鑒定具有很高的穩定性及准確性, 對常見細菌和酵母菌的屬的鑒定率能達到97%~99%, 種的鑒定率也能達到85%~97%; 另外, MALDI-TOF MS大大縮短了細菌鑒定的時間, 而且其成本也較常規鑒定方法低[2, 3]。除此之外, MALDI-TOF MS已經能夠成功地用於部分微生物亞種水平的鑒定和細菌耐性的檢測, 但這種方法在大多數情況下是應用於培養出的純菌落的鑒定[3]。

如果能夠從臨床樣本中直接檢測細菌/真菌, 突破細菌/真菌培養陽性率低、培養時間長的瓶頸, 為細菌/真菌感染性疾病的診療提供更快、更准確的病原學依據, 將對臨床及時控制細菌/真菌感染性疾病起到更大的作用。國內外學者已嘗試將質譜技術應用於臨床樣本的直接檢測, 並取得了顯著的進展。本文就MALDI-TOF MS技術在臨床樣本的直接檢測應用作一綜述。

一、MALDI-TOF MS檢測原理

MALDI-TOF MS技術用於微生物鑒定的實質就是檢測具有屬、種或亞型特異性的生物標志的質量信號, 主要是微生物菌體內高豐度、表達穩定和進化保守的核糖體蛋白。MALDI-TOF MS 儀器主要由基質輔助激光解吸離子源(MALDI)和飛行時間質量檢測器(TOF)兩部分組成。MALDI的原理是用一定強度的激光照射樣本與基質形成的共結晶薄膜, 基質從激光中吸收能量而汽化, 並迅速降解, 使樣本分解吸附, 基質和樣本之間發生電荷轉移從而使樣本分子發生電離; TOF的原理是帶有電荷的樣本分子在電場作用下加速飛過飛行管道, 因為離子的質荷比與離子的飛行時間呈正比, 所以不同質量的離子因達到檢測器的飛行時間不同而被檢測, 以離子峰為縱坐標、離子質荷比為橫坐標形成特徵性的質量圖譜。將不同種屬微生物經MALDI-TOF分析所形成的質量圖譜與資料庫中的參考圖譜進行比較, 從而實現對目標微生物種或菌株的區分和鑒定[2]。

二、MALDI-TOF MS直接檢測臨床樣本的流程

臨床樣本直接檢測的流程主要包括3個部分:臨床樣本的預處理、樣本上機檢測和對比蛋白質指紋圖譜資料庫得出鑒定結果。由於目前報道最多的臨床樣本是陽性血培養瓶和中段尿樣本, 下面將以這二者為例介紹其直接檢測的流程, 其它臨床樣本的檢測流程與之類似。

(一)臨床樣本預處理

MALDI-TOF MS直接用於臨床樣本的檢測有2個基本的要求:(1)臨床樣本中細菌的量。為了得到准確的鑒定圖譜, MALDI-TOF MS技術對置於靶板上的細菌的最低檢測限約為(1× 10^4)~(1× 10^6)cfu/mL。若要直接檢測擬似血流感染的血液樣本以及擬似泌尿系統感染的中段尿等臨床樣本中的病原菌, 首先必須富集細菌; (2)臨床樣本的質。由於血液和血培養瓶中的大分子成分如血紅蛋白和其它蛋白成分、尿液中的白細胞等有機成分會干擾細菌的譜峰, 所以直接檢測前需要採取預處理措施去除這些干擾因素。

1.陽性血培養瓶直接檢測 直接檢測陽性血培養瓶的細菌濃度常常需要1× 10^7 cfu/mL[2, 4]。由於在血流感染患者血液中的細菌量常常很低(最低可< 1~10 cfu/mL), 因此對血樣本的直接檢測需要一個增菌的過程, 即採用血培養瓶增菌。目前已報道的陽性血培養病原菌預處理程序各不相同, 但預處理過程主要包含了以下2個步驟:(1)將細菌從血細胞中分離出來。先應用溫和去污劑(如吐溫-80、十二磺基硫酸鈉、皂素等)將血液中的血細胞溶解, 然後通過不同的流程(離心、洗滌)去除其它的干擾因素, 純化要鑒定的細菌樣本; (2)將菌體中的蛋白質抽提出來。最常用的是混合溶劑處理法, 使用甲酸/乙腈溶液對樣本進行處理來抽提蛋白, 利用2種溶劑的混合作用將菌體表面的蛋白和存在於細胞

B. 病原微生物中細菌常見檢測方法有哪些

1、快速測試片技術法

快速測試片是指以紙片、紙膜、膠片等作為培養基載體，將特定的培養基和顯色物質附著在上面，通過微生物在上面的生長、顯色來測定食品中微生物的方法。

細菌總數檢測紙片的研製始於 20 世紀 80 年代，其主要優點是簡便、實用、經濟、操作性強。近年來以濾紙和美國某公司的 Petrifilm 為載體的測試片已開始被廣泛應用。

2、生物電化學方法

生物電化學方法是指通過電極測定微生物產生或消耗的電荷，從而提供分析信號的方法。微生物在滋生代謝過程中，培養基的電化學性質如電流、電位、電阻和電導等會發生變化，所以可以通過檢測分析這些電化學參量的變化來實現對微生物的快速測定。

常見的有：阻抗分析法、電位分析法、電流分析法等。生物電化學方法具有測量快速、直觀、操作簡單、測量設備成本低和信號的可控性等特點。

3、微菌落技術

微菌落是指細菌生長繁殖早期在固相載體上所形成的只能藉助於顯微鏡觀察的微小菌落。微菌落技術具有快速、經濟、實用的特點，其研究始於 20 世紀50年代，定量測定技術從 20 世紀 70 年代開始，國外已有報道將該法應用於水、食品中細菌總數的快速檢測。

4、氣相色譜法

氣相色譜應用到微生物的檢測中，主要是依據不同微生物的化學組成或其產生的代謝產物各異，利用上述色譜檢測可直接分析各種體液中的細菌代謝產物、細胞中的脂肪酸、蛋白質、氨基酸、多肽、多糖等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

5、高效液相色譜法

利用高效液相色譜檢測可分析各種體液中的細菌代謝產物、病原微生物等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

C. 細菌質譜儀原理

質譜目前應用在微生物檢驗上的為時間飛行質譜。
原理為:激光激發靶板上的細菌與基質讓細菌的蛋白在真空的飛行管中。檢測器通過檢測蛋白飛行時間的不同來建立一個曲線圖譜進而與資料庫中的信息比對，得出可能的菌的種。
結果解讀:目前微生物室使用的質譜都為此類，結果一般按照系統比對情況按照評分列出名單，一般為評分最高的最有可能(但要保證評分1.5/1.6以上才可取用，且評分規則為國際上的標准)。
以目前市場上的兩款產品BD布魯克公司與梅里埃公司所生產的產品為例。:BD建議評分為2.0。梅里埃與國際上大部分專家相同取用1.8。(評分越高可信度越強。)
質譜結果好壞還與資料庫的多少，解析度…有關。(目前這兩方面來說BD完全碾壓梅里埃的產品)
質譜優缺點:
優點:操作簡單，實驗時間短，大大縮短了一級報告的時間。(BD公司給出的數據為全程20分鍾即可，且符合實際操作結果。)
缺點:質譜歸根結底為檢測的蛋白質圖譜。所以像大腸和志賀…此類都鑒定不好。
其他方面:因此設備極貴，更應注意設備在使用中的硬體耗材及常規耗材成本。

D. 微生物生長曲線的檢測方法

生長量測定法
體積測量法：又稱測菌絲濃度法。
通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間（如5分鍾）和轉速（如5000 rpm），離心後，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。
稱乾重法：
可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速，進行離心，並用清水離心洗滌1-5次，進行乾燥。乾燥可用烘箱在105 ℃或100℃下烘乾，或採用紅外線烘乾，也可在80℃或40℃下真空乾燥，乾燥後稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾後用少量水洗滌，在40C下進行真空乾燥。稱乾重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常採用這種方法，如活性乾酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。
比濁法：
微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可採用一種特製的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用於發酵工業菌體生長監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600nm 處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.Coli的生長及誘導時間。
菌絲長度測量法：
對於絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度，或是利用一隻一端開口並帶有刻度的細玻璃管，到入合適的培養基，卧放，在開口的一端接種微生物，一段時間後記錄其菌絲生長長度，藉此衡量絲狀微生物的生長。
微生物計數法
血球計數板法:
血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平台，兩嵴的表比兩平台的表面高0.1 mm，每個平台上刻有不同規格的格網，中央0.1 mm面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜於單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，並且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。
染色計數法：
為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。藉助不同的染料對菌體進行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色後在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。
比例計數法：
將已知顆粒（如黴菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較粗放。並且需要配製已知顆粒濃度的懸液做標准。
液體稀釋法：
對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15隻裝培養液的試管中，經培養後記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然後查最大或然數表MPN（most probably number）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用於食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。
平板菌落計數法：
這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液塗布於已凝固的固體培養基平板上。保溫培養後，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。
試劑紙法：
在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色）待蘸取測試菌液後置密封包裝袋中培養。短期培養後在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標准紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷准確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。
膜過濾法：
用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。
生理指標法：
微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸鹼度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。
測定含氮量：
大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%，酵母為7.5%，黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱後產生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO2後即可測出N2的量。
測定含碳量：
將少量（乾重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 C下加熱30分鍾後冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標准樣品做標准曲線。
還原糖測定法：
還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用於大規模工業發酵生產上微生物生長的常規監測。方法是，離心發酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鍾，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點時加入澱粉溶液，繼續加Na2S2O3至終點，查表讀出還原糖的含量。
氨基氮的測定：
方法是，離心發酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應數刻，加入0.02N的使之變色，根據NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據培養液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。
其他生理物質的測定：
P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙醯胞壁酸）等含量以及產酸，產氣，產CO2（用標記葡萄糖做基質），耗氧，黏度，產熱等指標， 都可用於生長量的測定。也可以根據反應前後的基質濃度變化，最終產氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如我所在BMP-2的發酵生產上，隨時監測溶氧量的變化和酸鹼度的變化，判斷細菌的長勢。
商業化快速微生物檢測法：
微生物的檢測，其發展方向是快速，准確，簡便，自動化，當前很多生物製品公司利用傳統微生物檢測原理，結合不同的檢測方法，設計了形式各異的微生物檢測儀器設備，正逐步廣泛應用於醫學微生物檢測和科學研究領域。例如：
1、抗干擾培養基和微生物數量快速檢測技術結合解決了傳統微生物檢測手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測系統奠定了堅實的基礎。中科院廣州分院合作產業處提供的抗干擾微生物培養基，新型生化鑒定管，微生物計數卡，環境質量檢測試劑盒等，可方便的用於多項檢測。
2、BACTOMETER 全自動各類總菌數及快速細菌檢測系統可以數小時內獲得監測結果，樣本顏色及光學特徵都不影響讀數，對酵母和黴菌檢測同樣高度敏感原理是利用電阻抗法（IMPEDANCE TECHNOLOGY）將待測樣本與培養基置於反應試劑盒內，底部有一對不銹鋼電極，測定因微生物生長而產生阻抗改變。如微生物生長時可將培養基中的大分子營養物經代謝轉變為活躍小分子，電阻抗法可測試這種微弱變化，從而比傳統平板法更快速監測微生物的存在及數量。測定項目包括總生菌數，酵母菌，大腸桿菌群，黴菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌等。

E. 測定微生物的生物量有哪些主要方法

測定微生物的生物量有哪些主要方法
測定的方法主要有四種：

1.直接計數測定：根據微生物種類，有血球計數板和細菌計數板；

2.比濁法：根據菌懸液的濃度在一定范圍內與光密度成正比，可以用分光光度計測OD值，用OD值表示樣品菌液濃度；

3.核酸計數法：熒光定量PCR技術；

4.活菌計數法：MPN和平板計數法由於測定方法的限制。新鮮土樣經氯仿熏蒸後（24h），土壤微生物死亡細胞發生裂解，釋放出微生物生物量碳，用一定體積的LK2SO4溶液提取土壤，借用有機碳自動分析儀測定微生物生物量碳含量。根據熏蒸土壤與未熏蒸土壤測定有機碳的差值及轉換系數（KEC），從而計算土壤微生物生物量碳。