A. 急切求解WB,IHC的意思！
(一)WB
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然後利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。
一、原理
與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，「探針」是抗體，「顯色」用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用於檢測蛋白水平的表達。
二、試劑准備
1、SDS-PAGE試劑:見電泳實驗。
2、勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。
3、轉膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。
5、膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1.0g 溶於20ml的0.01M PBS中。
6、顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；H202 1.0μl。
三、操作步驟
（一）蛋白質樣品獲得：細菌誘導表達後，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細胞，真核細胞加勻漿緩沖液，機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然後4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。
（二）電泳：制備電泳凝膠，進行SDS-PAGE。
（三）轉移：（半乾式轉移）
1、電泳結束後將膠條割至合適大小，用轉膜緩沖液平衡，5min×3次。
2、膜處理：預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉膜緩沖液中10min。
3、轉膜：轉膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多餘的液體吸干。接通電源,恆流1mA/cm2，轉移1.5hr。轉移結束後，斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色，放入膜染色液中50s後，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然後用雙蒸水洗，風干夾於兩層濾紙中保存，留與顯色結果作對比。
（四）免疫反應：
1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。
2、加入包被液，平穩搖動，室溫2hr。
3、棄包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。
4、加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4℃ 放置12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其餘步驟與實驗組相同。
5、棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。
6、加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋），平穩搖動，室溫2hr。
7、棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。
8、加入顯色液，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。
四、注意事項
1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經過預實驗確定最佳條件。
2、顯色液必須新鮮配置使用，最後加入H2O2。
3、DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細。
（二）IHC
免疫組織化學 IHC
免疫組織化學又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結合起來，藉助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。 免疫組化技術近年來得到迅速發展。50年代還僅限於免疫熒光技術，50年代以後逐漸發展建立起高度敏感，且更為實用的免疫酶技術。
免疫組織化學的全過程包括：1.抗原的提取與純化；2.免疫動物或細胞融合，制備特異性抗體以及抗體的純化；3.將顯色劑與抗體結合形成標記抗體；4.標本的制備；5.免疫細胞化學反應以及呈色反應；6.觀察結果。
免疫組化基礎知識
免疫組織化學的概念：
免疫組化是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學。
免疫組化實驗所用的抗體有哪些？
免疫組化實驗中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物制備。多克隆抗體是將純化後的抗原直接免疫動物後，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產生的抗體混合物。
免疫組化實驗所用的組織和細胞標本有哪些？
實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織晶元）和冰凍切片，後者包括組織印片、細胞爬片和細胞塗片。其中石蠟切片是製作組織標本最常用、最基本的方法，對於組織形態保存好，且能作連續切片，有利於各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片製作過程對組織內抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中首選的組織標本製作方法。
石蠟切片為什麼要做抗原修復？有哪些方法？
石蠟切片標本均用甲醛固定，使得細胞內抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發生交聯而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進行IHC染色時，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯破壞，而恢復抗原的原有空間形態。
常用的抗原修復方法有微波修復法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。
免疫組化常用的染色方法有哪些？
根據標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法，後者是以一種物質對某種組織成分具有高度親合力為基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利於微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗體交叉反應的原因：
指抗體除與其相應的抗原發生特異性反應外還與其它抗原發生反應。產生的原因有以下幾個方面：
1. 抗原特異性指用於免疫動物的抗原性物質中含有多種抗原分子，它引起動物產生針對多種抗原分子特異性的相應抗體。任何其它物質只要含有一種或多種與上述物質相同的抗原分子，必將與上述多特異性的抗血清發生交叉反應。
2. 共同決定簇即兩種抗原分子中都含有相同的抗原決定簇。
3. 決定簇相似，兩種不同的抗原決定簇，如果結構大致相同，由於空間構象關系，某一決定簇的相應抗體可以與大致相同的決定簇發生交叉反應。當然抗原一抗體之間構象相似時的結合力小於吻合時的結合力。
多抗和單抗特性比較：
1.均一性。一種單抗中，每個抗體的化學結構和氨基酸順序都相同，只有一種Ig亞類。即單抗是一種純度很高的均一抗體。而從不同動物，不同時期所得到的多抗，各有不同的化學組成。多抗是多種種類和亞類Ig的混合物。
2. 穩定性。單抗的穩定較差，對PH變化敏感，對熱不穩定，提純過程中易變性，而多抗的穩定性則較好。
3. 特異性。單抗是單一地針對抗原的某一決定簇，所以用它進行血清學反應時，特異性強，敏感性高，一般不發生交叉反應。而多抗能與抗原上的多種抗原決定簇結合，所以特異性較差，較易引起交叉反應。
4.重復性。單抗的重復性好，而多抗每批都不一樣。
5. 沉澱反應。多抗由於與抗原多價結合容易形成網路樣沉澱，而單抗只與抗原結合產生二聚體，不能直接形成抗原抗體沉澱物。
抗體的保存：
抗體儲存容器應由不吸附蛋白質的材料製成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲存的抗體中蛋白濃度很低（10-100mg/L），就應另加隔離蛋白以減少容器對抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。絕大多數已稀釋的抗體應存在4℃-8℃條件下，以免凍融對抗體蛋白產生有害效應。抗體原液和已分離的免疫球蛋白組分應保存於-20℃條件下，並避免反復凍融。冷凍的抗體溶液應置於室溫中緩慢地解凍，應絕對避免用高溫快速解凍。被細菌污染的抗體常會出現假陽性結果，應將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細菌污染，可於抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉。抗體經真空冷凍乾燥後置-20℃以下可保存3-5年。保存稀釋後的單抗應加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數稀釋抗體可進行冷凍保存，少數抗體可能會丟失抗原活性。大多數單抗，只要蛋白濃度適當，可在4℃下保存數月。
希望你能滿意 謝謝！！！o(∩_∩)o... ^_^