Ⅰ 怎樣將微生物菌落分析的宏基因組數據上傳到NCBI上
宏基因組學（Metagenomics）又叫微生物環境基因組學、元基因組學。它通過直接從環境樣品中提取全部微生物的DNA,構建宏基因組文庫，利用基因組學的研究策略研究環境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。它是在微生物基因組學的基礎上發展起來的一種研究微生物多樣性、開發新的生理活性物質（或獲得新基因）的新理念和新方法。其主要含義是： 對特定環境中全部微生物的總DNA（也稱宏基因組，metagenomic）進行克隆，並通過構建宏基因組文庫和篩選等手段獲得新的生理活性物質；或者根據rDNA資料庫設計引物，通過系統學分析獲得該環境中微生物的遺傳多樣性和分子生態學信息。
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臨床微生物檢驗的快速診斷技術研究進展
關鍵詞：分子生物 來源： CHKD期刊全文庫《當代醫學》2099年第16期
（本文作者：解放軍第二五二醫院 李蘇利）
目前感染性疾病仍然是危害人類健康的重大隱患。隨著新發和突發感染性疾病的涌現，曾已被控制的感染性疾病的卷土重來，造成感染性疾病的微生物種類日益復雜，常見的病原微生物的威脅不僅沒有消除而且出現了大量耐葯菌株，加上新的病原微生物的出現，給臨床診斷和治療帶來了極大的困擾。嚴峻的現實給病原微生物的檢測和診斷提出了更高的要求。世界衛生組織(WHO)對臨床微生物實驗室提出:臨床微生物實驗室盡可能把目標集中在快速診斷方面。利用一切手段將實驗室數據轉化為臨床有用的信息。
1 自動化鑒定技術的應用
臨床微生物的實驗室檢查以染色、培養、生化鑒定等為主，尤其是分離培養，目前仍然是許多病原體檢測的「金標准」。但是，由於細菌的生長繁殖需要一定時間，使檢測周期難以縮短。此外，很多病原體的培養受營養要求、抗生素應用及病原體含量等因素的影響，用傳統人工方法操作復雜、檢測周期長，敏感性與特異性也有限。為解決這一問題，各種自動化培養和鑒定系統不斷產生，隨著計算機的發展和應用，先後出現了許多自動與半自動細菌鑒定與葯敏系統，統稱為「微生物鑒定專家系統」，這些系統大大提高了臨床實驗室的工作效率和檢測的准確性，傳統鑒定方法也在逐步改進，並在一定程度內加快了檢測速度。
2 免疫學方法
免疫學技術是利用特異性抗原抗體反應，檢測病原微生物，簡化了病原微生物的鑒定步驟，備受關注。各大文獻資料庫提供的數據顯示，幾乎建立了所有病原體的血清學檢測方法，表明該方法已成為一種微生物實驗室常用的成熟的檢測技術。
2.1 凝集技術 常用的凝集技術有乳膠凝集技術和血清凝集技術。用於微生物的初步診斷、分型、鑒定，例如霍亂弧菌和志賀菌的分型，大腸桿菌O.57：H7、腦膜炎球菌等，短時間內就可完成鑒定。該診斷法具有操作簡便、快速、准確、特異性強、陽性率高等特點。
2.2 熒光抗體技術 熒光抗體技術是根據抗原抗體反應具有高度的特異性，把熒光素作為抗原標記物，在熒光顯微鏡下檢查呈現熒光的特異性抗原抗體復合物及其存在部位。熒光抗體技術的主要特點是特異性強、速度快。呂治林等報道由美國同行所作的用炭疽桿菌細胞壁(CW-DFA)和莢膜抗原(CAP-DFA)特異的熒游標記的單克隆抗體，可快速鑒別炭疽桿菌。
2.3 酶免疫技術 酶聯免疫技術現已被廣泛地應用於多種病原微生物的檢測，可檢測樣本中病原體抗原，也可檢測機體中的抗體成分。應用單克隆抗體結合硝酸纖維膜上的斑點ELISA技術，已成功地自患者的咽拭標本中同時檢出可能存在的肺炎支原體、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒。Gehring等用酶聯免疫化學發光法(ELIMCL)測定大腸桿菌O.57：H7。許多疾病的檢測都已有商品化的試劑盒出現。
3 分子生物學技術
隨著分子生物學技術的迅速發展，使人們對微生物的認識從外部表型逐漸轉向內部基因結構特徵，微生物的檢測也從生化、免疫方法轉向基因水平檢測，對於那些難培養和不可能培養的微生物，可直接通過獲得基因信息，給微生物學的檢測帶來嶄新的領域，為科學快速發展提供了新的機遇。
3.1 PCR技術 PCR具有高度敏感性和特異性，在病原體檢測上，對形態和生化反應不典型的微生物鑒定，常規方法常難以准確檢測，即使出現大量死菌PCR也能做出准確的鑒定；不受混合標本的影響，可輕易從含有大量正常菌群的標本中鑒定病原菌；對於生長緩慢或難於培養的微生物鑒定，如分枝桿菌、幽門螺桿菌、支原體、衣原體、螺旋體等，目前其他方法陽性檢出率很低，PCR技術對這類菌株的鑒定有重要意義。
但是常規PCR技術也存在一些問題，如出現假陽性、形成引物二聚體，檢測操作也比較繁瑣，中間污染環節多，易出現假陽性或假陰性結果。為了克服這些不足，一些新的PCR技術漸衍生出來並被用於實踐，如巢式PCR、逆轉錄PCR、多重PCR、通用引物PCR(UP-PCR)、PCR單鏈構象多態性分析、隨機引物DNA多態性擴增(RAPD)、限制性長度多態性分析(RFLP)、實時熒光定量PCR等。
3.2 基於16S rRNA與GyaB的檢測技術
3.2.1 以16S rRNA為靶基因進行檢測 16S rRNA存在於所有原核生物細胞中，它們相對穩定且有較高的拷貝數，其序列中含可變區及高度保守區，因此可設計群、屬、種特異性的探針。現階段各種常見細菌的16S rRNA基因幾乎全部測序完成，16SrRNA編碼基因的這些特點使之成為較理想的細菌基因分類的靶序列，逐漸成為細菌鑒定、分類的「金標准」。
3.2.2 以促旋酶(g yras e)B亞單位基因靶基因進行檢測GyaB除了具有16S rRNA所具有的優點外，其基因進化率高於核糖體基因，還有GyaB在近乎全部細菌中呈單拷貝形式。有研究表明，基於GyaB序列構建的進化圖譜與基於DNA-DNA雜交的相一致。因此，GyaB的分析特別適合於菌株的區別和鑒定。Fukushima等以GyaB基因為靶基因設計基因晶元來檢測分枝桿菌屬，實驗結果顯示此晶元鑒別分枝桿菌達到種水平，並且能區別密切相關的菌種，這對臨床治療具有重要的參考價值，說明分析GyaB基因序列對於在菌種水平鑒別細菌是快速而有效的方法。
3.3 多位點序列分型 多位點序列分型(MLST)是近年來發展很快的分子生物學分析方法，具有很高的分辨能力，既適於分子流行病學研究，也可用於分子進化學的研究。MLST越來越多地被作為能進行國際間菌株比較的常用工具，建立一種更為准確的分析系統方法，並且用於研究出現的不同的抗生素抵抗株，相關特殊基因型及新的變異株引起的疾病流行病學分析和種群結構的研究。
3.4 環介導等溫擴增技術(LAMP) 環介導等溫擴增技術(LAMP)，是近年來發展出的一種敏感、特異、方便快捷的核酸擴增技術。與傳統方法相比，不需要熱循環為等溫擴增，且由於反應中產生大量的副產物-白色焦磷酸鎂沉澱，擴增產物可不經過電泳，通過肉眼觀察或濁度計即可判定結果。因此LAMP是一種不需要熱循環儀、肉眼即可判定結果的高度特異和敏感的DNA擴增方法。該法針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用一種鏈置換聚合酶在恆溫條件(65℃左右)保溫約60min即可完成核酸擴增反應，擴增出特徵性梯狀條帶。還可通過設計兩條環引物可使反應速度提升1/2～1/3。LAMP技術可用於病原微生物的現場快速檢測、戰時野外及基層普及應用。
4 分子生物感測器
分子生物感測器是將新興的感測器技術和分子診斷技術相結合而成的一種新技術，是現代臨床診斷發展的一個新方向。由於生物感測器檢測准確、操作簡便等特點，近年來已經在許多領域取得了很大的進展，在感染類疾病診斷、葯物篩選、未來戰爭生物戰劑監測等領域獲得了廣泛的應用，其中臨床中用於病原體檢測的以DNA生物感測器最為常見。華裔科學家陳建柱最新製成的生物感測器，僅需20s時間即可檢測出微量SARS病毒、天花病毒及炭疽桿菌等的存在，從而達到早期診斷的目的。
5 基因晶元
基因晶元是高通量的群體指標分析系統，基因晶元技術是一項全新的技術，它以一次性檢查上萬個基因的優勢，被譽為是基因功能研究中最偉大的一項發明。它以許多特定的寡核苷酸片斷或基因片斷作探針，有規律地排列、固定在諸如矽片、 玻璃片、尼龍膜等固相介質上形成生物分子點陣，以達到一次試驗同時檢測多種疾病或多種樣品的目的。基於高通量、微型化和平行分析的特點，基因晶元在微生物病原體檢測、種類鑒定、功能基因檢測、基因分型、突變檢測和基因組監測等研究領域中發揮著越來越重要的作用。目前，許多細菌、病毒等病原體的基因組測序已經完成，將許多代表各種微生物的特殊基因製成1張晶元，經反轉錄就可檢測樣本中有無病原體基因的表達及表達水平，由此判斷病人感染病原、感染進程以及宿主反應等，這樣就大大提高了檢測效率。
6 蛋白指紋圖譜技術
蛋白質指紋圖譜技術是隨著蛋白質組學興起的一種新技術。近年來，越來越多的學者意識到有必要從蛋白質水平來研究微生物。蛋白質是細菌功能的執行者，細菌種類繁多，不同的蛋白種類決定細菌千變萬化的功能和特徵。1996年，Clayin等採用MALDITOF MS質譜成功鑒定了革蘭陰性和革蘭陽性細菌，表明不同屬種的細菌具有不同的蛋白指紋圖譜，同一種細菌具有相似的蛋白指紋圖譜，根據細菌蛋白指紋圖譜可對細菌進行快速鑒定。中科院微生物所唐宏研究員等利用「蛋白質質譜指紋圖譜」最新技術及其檢測辦法，可以分析得出SARS與非SARS病人血清中的蛋白質成分變化。這種檢測SARS病毒方法經北京天壇醫院臨床證實，陽性率接近95%，特異性將近96%，能在病人發燒的第一天即可以得出滿意的檢測結果。有專家稱蛋白質指紋圖譜技術標志著一種劃時代的診斷模式的誕生。
隨著計算機技術的不斷發展，臨床病原菌檢測將向著高度自動化和開發簡便的快速檢測技術兩個方向發展。分子生物學技術通過自動化儀器的使用，將在病原菌診斷、鑒定和耐葯基因檢測方面發揮巨大的的作用。隨著多學科交叉時代的到來，最終將徹底改變臨床病原菌檢測的現狀和傳統觀念，實現高效高質、快速統一。
Ⅲ 轉錄組測序所得的數據，怎樣傳到NCBI的SRA資料庫
xshell連接NCBI伺服器 輸入命令 ftp
連接成功後輸入賬號 密碼
mkdir命令創建一個文件夾，以你的BioProject accession命名
FTP 連接成功後連接成功後
進入剛才建立的BioProject文件夾
把原始數據拖進去即可
傳輸過程中，如果一定時間（五分鍾？）沒有激活傳輸界面，可能會導致連接斷開
進度可能會一直停在99%，重新連接成功後，也一直卡在99%，不過似乎數據還是上傳成功了的
傳輸成功的會顯示linked，同時FTP里對應的文件會消失 傳輸成功的會顯示linked，同時FTP里對應的文件會消失
全部文件夾都傳輸成功了會變成queued
然後就等NCBI處理了
Ⅳ 環境微生物測序采樣指南
隨著高通量測序技術飛速發展，人們對微生物的認知也在逐漸深入。凌恩生物每天都會接到全國各類型微生物測序樣本，上到山巔土壤，下至深海底泥；有老師研究植物根際和葉內微生物，也有老師關注動物昆蟲腸道生理代謝的奧秘。為了得到能夠研究的測序結果，規范標準的取樣及送樣是成功的前提。
在樣本送測前，我們要注意以下幾點：
1、取樣使用的工具及容器必須經過滅菌處理；
2、取樣後及時做好標記，記錄取樣相關信息；
3、樣本送測前做好備份，防止意外發生丟失珍貴樣本；
4、送測樣本使用標准容器承裝，在容器上標記清晰，送樣不宜過多；
5、寄送時保持低溫環境，建議使用乾冰配送；
6、可使用凌恩微生態樣本保真液，高品質樣本是決定高品質研究成果的第一步。
常規土壤類樣本取樣方法-農田/森林/草原土壤等
(1) 取樣方法
按實驗設計確定采樣范圍，取樣器具需事先消毒滅菌處理。采樣時應去除地表雜質，根據需要挖取相應深度（如5~20 cm）的土壤，置於冰磨拍掘上運至實驗室。去除可見雜質，建議過2 mm無菌篩網。同一樣方多點樣本等量混合均勻後取5~10 g，保存無菌EP管中，進行核酸提取，或-80℃保存備用。若不能自行提取，可置於乾冰寄送至公司。
註：建議戴一次瞎核性手套、口罩，進行嚴格賀敬取樣和操作，盡可能減少人為的污染。
根際土壤樣本取樣方法-作物/蔬菜/草木根系等
（1）作物類（含草地等矮小植物）根際土壤取樣方法
a. 採集植物植株，去除根部大塊土壤，置於冰上運輸至實驗室；
b. 晃動根部，去除根部鬆散的土壤後，使用無菌刷子從根部收集殘留土壤；
c. 同一樣方多點取樣土壤樣本等量混合均勻後，液氮速凍，置於-80℃冰箱保存。
（2）林木類根際土壤取樣方法
a. 採集地面下 10-20 cm 根際土壤，置於冰上運輸至實驗室；
b. 過 2-5 mm 孔徑無菌篩網；
c. 同一樣方多點取樣土壤樣本等量混合均勻後，液氮速凍，置於-80℃冰箱保存。
若不能自行提取，可置於乾冰寄送至公司提取。
註：取樣器具請事先消毒滅菌處理。若為真菌根際土壤，請務必盡可能去除菌絲體殘留，減少對 DNA/RNA 提取的干擾。
植物表面微生物取樣方法
（1）取樣方法
依據實驗設計，進行樣方設置，每一樣方進行多點取樣，同一樣方點等量混勻成一個樣本。植物根部組織可以通過搖晃振盪或無菌刷子去除根表粘附土壤。
（2）樣本前處理
將植物組織浸沒於無菌PBS溶液，180rpm孵育20min；取出植物組織，再次加入無菌PBS溶液，180rpm孵育20min，取出植物組織，再次加入無菌PBS溶液，超聲波洗滌10min（參數：160 W，30s/30s），最後取出植物組織至於-80度冰箱保存備用。
將三次洗滌液匯總，過0.2um濾膜（或12000g離心10min，收集沉澱），收集濾膜至於-80度冰箱保存。
植物內部微生物取樣方法
（1）依據實驗設計，進行樣方設置，每一樣方進行多點取樣，同一樣方點等量混勻成一個樣本。
（2）對植物組織進行表面消毒操作或者使用上一步「 植物表面微生物取樣」中處理過的植物組織，液氮速凍後，研磨成粉，即可用來進行核酸的提取。
植物組織表面消毒具體操作如下：
無菌水洗滌30s，70%無菌乙醇洗滌2min，2,5% NaClO（含0.1% Tween 80）浸泡5min後轉移至70%無菌乙醇浸泡30s，最後使用無菌水洗滌植物組織3次，即視為對植物組織表面進行無菌化。
表面無菌化的植物組織至於-80度冰箱保存備用或進行核酸提取。
植物根表面微生物取樣方法
（1）將所研究的物體放在事先滅好的無菌容器當中；
（2）加入PBS緩沖液後進行振盪，使得微生物從物體表面充分的脫落並聚集在PBS緩沖液當中,震盪至少2h以上；
（3）直接提取PBS緩沖液中的微生物或者將緩沖液用濾膜過濾之後再進行DNA的提取。
PBS濃度和PH有要求：濃度是用1x的，PH值是7.4，一般買回來的PBS是10x的，建議稀釋到1x。
注意： 建議優先使用超聲波洗滌 。
空氣樣本微生物取樣方法
使用空氣抽濾機，使空氣通過 0.22 μm 濾膜，濾膜上有可見覆蓋物（過濾時間越長，收集的空氣中的灰塵越多，菌數量越多），收集完成後取下濾膜。濾膜置於凍存管中，液氮速凍，乾冰寄送到實驗室。
注意：由於樣本特殊，微生物含量較少，建議多保管備份保存。
水體樣本微生物取樣方法
送樣量：擴增子直徑3-4cm濾膜1-2張；宏基因組直徑3-4cm濾膜>=2張；
（1）研究目的進行確定水體的取樣深度和范圍；
（2）采樣後進行濾膜過濾，選擇合適孔徑的濾膜，對於澄清水體或者略渾濁水體，選用0.22μm或者0.45μm的濾膜，取樣體積大於5L；對於渾濁水體，建議先用大孔徑的濾膜過濾一遍，再用小孔徑的濾膜過濾；
（3）水體泥樣的採集提供大於5g樣本；
（4）用大體積乾冰運輸，且要保證我方在收到樣品開箱檢驗時有足夠的乾冰剩餘。
注意：擴增子項目將2-3L水體過濾到1-2張濾膜（0.22或0.45um）後裝入到離心管中；宏基因組項目將10L水體過濾到>=2張濾膜（0.22或0.45um）後裝入到離心管中。
活性污泥與水體/地表沉積物類樣本取樣方法
（1）活性污泥
從活性污泥裝置中取大於10 ml的懸浮污泥樣本（約5-10 g沉降物），保存無菌EP管中，放入液氮或置於冰上，立即運至實驗室進行核酸提取，或-80℃保存備用。
註：若液態污泥樣本沉降物較少，可適當增加取樣量。
（2）水體/地表沉積物
取距離水底/地表0-10 cm（具體按實驗需要而定）的沉積物5~10 g，保存無菌取樣袋或EP管中，置於冰上運送至實驗室進行核酸提取，或-80℃保存備用。若不能自行提取，可置於乾冰寄送至公司提取。
Ⅳ 美吉微生物多樣性中如何上傳自己的環境因子
首先，登錄NCBI主頁面後點擊Submit進入到數據上傳頁面，然後選擇SRA資料庫點擊GO按鈕後接著點擊New submission；
第二步：填寫提交人的個人信息和單位信息；
第三步：填寫BioSample、BioProject和數據釋放時間（之前沒有創建BioSample、BioProject可以選擇NO）；
第四步：項目信息填寫，根據實際情況填寫（帶有*號的為必填，其它可以不填寫）；
第五步：樣本類型選擇；
第六步：樣本具體信息，需要我們下載表格填寫，表格中綠色的為必填，藍色的需要至少填一個，其它內容可以選填或者不填寫，如果是生物學重復需要添加一列replicate,填寫完成後需要將信息粘貼到文本文件中（TXT格式），然後上傳到網站上；
Ⅵ biolog微生物鑒定系統
Biolog微生物鑒定步驟
一 檢測原理
Biolog微生物鑒定系統測試的是微生物在鑒定板中利用或氧化化和物的能力。測試會產生特徵性的紫色孔模式，組成代謝指紋。所有必需的營養物質和生化試劑都預先加進96孔板中，四唑紫是一種氧化還原染料，指示碳源的利用情況。.鑒定步驟非常簡單，純化分離到的菌株經擴大培養，再製成接種液加到鑒定板中。在培養過程中，一些孔中的化學物質能被氧化並將顯色物質成紫色，對照孔（A-1）和陰性孔仍然為無色。鑒定板在相應的培養條件下培養4-6小時或16-24小時即可形成代謝模式。系統軟體自動和資料庫對比，如果能找到合適的匹配，就可以得出一個鑒定結果。
二 所需器材和消耗品：
培養基、接種液、巰基乙酸鈉、長棉簽、接種棒、儲液槽、八道移液器、移液器頭、濁度儀、濁度標准品、控溫培養箱和相應的鑒定板。其中接種液自行配製，接種棒、儲液槽可選用國產品牌代替。
三 鑒定步驟：
Biolog微生物鑒定樣品處理步驟
分離純化培養基
BUG+B
通用培養基加羊血
BUA+B
厭氧培養基加羊血
BUY
酵母培養基
2%ME
2%的麥芽汁提取物
革蘭氏染色和菌落菌株形態觀察
革蘭氏染色結果
革蘭氏陰性
革蘭氏陽性
厭氧菌
酵母菌
絲狀真菌
確認實驗
氧化酶反應陽性
氧化酶反應陰性、三糖鐵實驗A/A或K/A
需在巧克力培養基上或需要6.5% CO2培養
確認實驗
氧化酶反應陰性、三糖鐵實驗K/K或K/Aw
微生物類型
GN-NENT
非腸道菌
GN-ENT
腸道菌
GN-FAS
苛生菌
GP-COCCUS-ROD桿球菌、GP-COCCUS球菌、GP-ROD桿菌
GP-ROD
（芽孢桿菌）
AN
厭氧菌
YT
酵母菌
FF
絲狀真菌
擴大培養基
BUG+B
BUG+B
巧克力培養基
BUG+B
BUG+M+T
BUA+B
BUY
2%ME
培養溫度
30℃
35-37℃
35-37℃
35-37℃
30℃
35-37℃
26℃
26℃
培養氣體
空氣
空氣
6.5% CO2
空氣或6.5% CO2
空氣
無氫氣的厭氧環境
空氣
空氣
接種液類型
GN/GP-IF
GN/GP-IF+T
GN/GP-IF+T
GN/GP-IF+T
GN/GP-IF
AN-IF
水
FF-IF
接種濁度/
濁度標准管
52%T
GN-NENT
61%T
GN-ENT
20%T
GP-COC&GP-ROD&GN-FAS
20%T
GP-COC&GP-ROD&GN-FAS
28%T
GP-ROD SB
65%T
AN
47%T
YT
75%T
FF
鑒定板類型/
每孔菌懸液的量
GN2
150μl
GN2
150μl
GN2
150μl
GP2
150μl
GP2
150μl
AN
100μl
YT
100μl
FF
100μl
培養時間（小時）
4-6,16-24
4-6,16-24
4-6,16-24
4-6,16-24
4-6,16-24
20-24
24,48,72
24,48,72,96
第一步：
在用戶自己的培養基上純化菌株，如果菌株為凍干或冷凍樣品，需要傳代培養2-3代，讓菌株恢復活力。
對純化好的菌株做革蘭氏染色，確定菌株是革蘭氏陰性還是陽性。觀察菌落外部形態或用顯微鏡觀察菌株形態，確定是酵母還是絲狀真菌，是球菌還是桿菌。
如果是革蘭氏陰性菌，還需要最終確認是腸道菌、非腸道菌或苛生菌。方法是，氧化酶陽性或氧化酶陰性但三糖鐵實驗為K/K或K/Aw，則該菌株為非腸道菌(GN-NENT)，氧化酶陰性以及三糖鐵實驗為A/A或K/A，則該菌株為腸道菌(GN-ENT)。如果菌株①需要在巧克力培養基上或需要6.5% CO2培養，②在BUG+B培養基上生長非常差，形成針尖大小的菌落，那麼可以認為這些菌是苛生菌(GN-FAS)。大多數苛生菌都是從哺乳動物的呼吸道里分離出來的，如Actinobacillus, Alysiella, Brucella, Capnocytophaga, CDC Group DF-3, CDC Group EF-4, Eikenella, Haemophilus, Kingella, Moraxella, Neisseria, Simonsiella, Suttonella,和Taylorella。
如果是革蘭氏陽性菌，用革蘭氏染色可以很容易的區分球菌和桿菌，推薦再做一個過氧化氫酶實驗，最終確定是球菌還是桿菌。通過革蘭氏染色或觀察菌落形態可以區分出芽孢桿菌。
微生物的擴大培養應該用Biolog推薦的培養基和培養條件，以便使微生物達到最佳的代謝活性，進而准確的和資料庫中的代謝模式匹配。
微生物應該是新鮮的，確保其處於指數增長期，因為一些菌株在達到穩定期時會失去生存能力或代謝活性，推薦的培養周期為4-24個小時。
如果擴大培養的量不足以配製相應的濁度，可以培養多個平板，培養時間可以延長到48個小時。
第二步：
首先確定濁度儀沒開啟電源的時候，指針應指在0%，如果沒有，用螺絲刀調整。開啟電源，取未開蓋的裝有接種液的試管，擦乾凈管壁，放入濁度儀，指針應指在100%，如果沒有，旋動右方旋鈕。然後用濁度標准管檢驗，讀數在±2%都是正常的。要使用哪管接種液，就用相應的試管做100%校正，不要在濁度儀的光路中旋轉試管。
在鑒定革蘭氏陰性腸道菌和苛生菌的時候，在接種液里應該加准確三滴巰基乙酸鈉。巰基乙酸鈉的作用是抑制芽孢形成，並且可以部分或完全的抑制A-1或其它孔由於微生物利用自身分泌的聚多糖莢膜而出現的紫色。一些非腸道菌液需要添加巰基乙酸鈉。
按照下列步驟制備均勻的菌懸液：用接種液將棉簽稍微浸濕，用棉簽在菌落上面輕輕的滾動可以將菌落取到接種液中，從而不會將培養基或其它營養物質帶入接種液。先取單菌落，不夠再取生長緊密的菌落。在試管內壁接種液液面的上方，旋轉擠壓棉簽可以將菌落團分散。然後上下移動棉簽，將分散的菌落和接種液充分混合形成均一，無菌團的菌懸液。如果菌懸液有菌團，可以讓菌團沉到管底。
調整濁度直至達到允許的范圍，增加接種液或添加菌落可以降低或升高菌懸液的密度。
將菌懸液接種到鑒定板上，不要超過20分鍾。如果長時間部接種到鑒定板上，一些菌會失去代謝活性。
第三步：
將鑒定板編上相應的號碼。把菌懸液倒入儲液槽，不要全部倒入，因為試管底部可能有未分散的菌團。按照不同的鑒定板所需的加樣量進行移液器的程序選擇，將移液器頭安放到移液器上，必要時可以用手加固，以免造成上方漏氣。吸取菌懸液，觀察每個移液器頭中的液面是否一致，如果不一致，放出菌懸液，加固移液器頭。加完菌懸液後，蓋上蓋子。
第四步：
培養環境根據所鑒定的菌株種類而定。准備一個塑料容器，在底部鋪上濕紙巾，把鑒定板放在紙巾上，可以防止鑒定板外緣孔水分的蒸發。對於革蘭氏陰性陽性菌，鑒定板培養4-6個小時可以進行一次讀數，過夜培養（16-24個小時）可再進行一次讀數。厭氧菌在培養20-24個小時後進行一次讀數即可。酵母和絲狀真菌所需培養時間稍長，一般間隔24個小時讀一次數。
第五步：
開啟讀數儀和電腦，打開Biolog軟體，並對讀數儀進行初始化，設置好各項參數（培養時間、菌株名稱、菌株編號、菌株類型），用紙巾擦乾凈培養好的鑒定板底部，放入讀數儀，A-1孔位於左上方。即可點擊「Read This」進行讀數。鑒定結果自動顯示在屏幕下方，將所得數據進行保存即可。