① 生物上基因診斷的步驟是什麼
1、核酸雜交:酸雜交是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的傳統方法。其原理是核酸變性和復性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開,而在條件恢復後又可依鹼基配對規律形成雙邊結構。雜交通常在一支持膜上進行,因此又稱為核酸印跡雜交。根據檢測樣品的不同又被分為DNA印跡交(Southern blot hybridization )和RNA印跡雜交(Northern blot hybridization)。其基本過程包括下列幾個步驟。
(1)制備樣品:首先需要從待檢測組織樣品提取DNA或RNA。DNA應先用限制性內切酶消化以產生特定長度的片段,然後通過凝膠電泳將消化產物按分子大小進行分離。一般來說DNA分子有其獨特的限制性內切酶圖譜,所以經酶切消化和電泳分離後可在凝膠上形成特定的區帶。再將含有DNA片段的凝膠進行變性處理後,直接轉印到支持膜上並使其牢固結合。這樣等檢測片段在凝膠上的位置就直接反映在了轉印在膜上。RNA樣品則可直接在變性條件下電泳分離,然後轉印並交聯固定。
(2)制備探針:探針是指一段能和待檢測核酸分子依鹼基配對原則而結合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。在核酸雜交實驗中,探針需要被標記上可直接檢測的元素或分子。這樣,通過檢疫與恩印膜上的核酸分子結合上的探針分子,既可知道被檢測的核酸片段在膜上的位置,也就是在電泳凝膠上的位置,也就知道了它的分子大小。
(3)雜交:首先要進行預雜交,即用非特異的核酸溶液封閉膜上的非特異性結合位點。由於轉印在膜上的核酸分子已經是變性的分子,所以雜交過程中只需變性標記好的探針,再讓探針與膜在特定的溫度下反應,然後洗去未結合的探針分子即可。
(4)檢測:檢測的方法依標記探針的方法而異。用放射性同位素標記的探針需要用放射自顯影來檢測其在膜上的位置;而如果是用生物素等非同位素方法標記的探針則需要用相應的免疫組織化學的方法進行檢測。
② 如何鑒定DNA和RNA(生物)具體做法
高中粗鑒定:用吡羅紅(DNA)和甲基綠(RNA)鑒定.
DNA的鑒定
(1)配製二苯胺試劑:取0.1 mL B液;滴入到10 mL A液中,混勻.
(2)鑒定:取4 mL DNA提取液放入試管中,加入4 mL二苯胺試劑,混勻後觀察溶液顏色(不變藍).用沸水浴(100℃)加熱10 min.在加熱過程中,隨時注意試管中溶液顏色的變化(逐漸出現淺藍色).
附1:研磨液的配製方法
Tris:10.1 g(相對分子質量為121.4),先加50 mL蒸餾水溶解,用物質的量濃度為2 mol/L的鹽酸調至pH=8.0,再加下述葯品.
NaCl:8.76 g(相對分子質量58.44)
EDTA:37.2 g(相對分子質量372.24)
SDS:20 g(相對分子質量288.3)
待上述葯品全部溶解後,再用蒸餾水定溶至1000 mL.
若在室溫低於20℃時配製葯液,SDS呈沉澱析出,此時需要加溫,才能將SDS溶解.如果提前配製的研磨液出現了沉澱,則應加溫使沉澱溶解後再使用.
附2:研磨液中幾種葯品的作用
SDS(十二烷基磺酸鈉):可使蛋白質變性,與DNA分離.
EDTA(乙二胺四乙酸二鈉):為DNA酶的抑制劑,可以防止細胞破碎後DNA酶降解DNA.
物質的量濃度為0.15 mol/L的氯化鈉溶液:能很好地溶解DNA.
Tris/HCl:提供緩沖體系,DNA在這個緩沖體系中呈穩定狀態.(Tris為三羥甲基氨基甲烷)
RNA的鑒定
取RNA沉澱約O.2 g,加2 ml 10%H2SO4→沸水浴中加熱2 min→加1.5 ml地衣酚試劑→沸水浴中加熱→觀察顏色變化。