用於微生物學的明膠Pka是多少

1. 食品微生物學的課後答案

微生物(microorganism簡稱microbe)是包括細菌、病毒、真菌以及一些小型的原生動物等在內的一大類生物群體，它個體微小，卻與人類生活密切相關。微生物在自然界中可謂「無處不在，無處不有」，涵蓋了有益有害的眾多種類，廣泛涉及健康、醫葯、工農業、環保等諸多領域。

原核：細菌、放線菌、藍細菌、支原體、立克次氏體、衣原體。
真核：真菌、藻類、原生動物
非細胞類：病毒和亞病毒

一般地，在中國大陸地區的教科書中，均將微生物劃分為以下8大類：細菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體。
微生物的定義
一切肉眼看不見的或看不清的微小生物的總稱
1 特點: 個體微小,一般<0.1mm
構造簡單,有單細胞的,簡單多細胞的,非細胞的
進化地位低
2 分類 原核類: 三菌,三體
真核類: 真菌,原生動物,顯微藻類
非細胞類: 病毒,亞病毒 ( 類病毒,擬病毒,朊病毒)
3 五大共性: 體積小,面積大
吸收多,轉化快
生長旺,繁殖快
適應強,易變異
分布廣,種類多
二、微生物的類群
1 細菌:
(1)定義:一類細胞細短,結構簡單,胞壁堅韌,多以二分裂方式繁殖和水生性強的原核生物
(2)分布:溫暖,潮濕和富含有機質的地方
(3)結構:主要是單細胞的原核生物,有球形,桿形,螺旋形

細胞壁
基本結構 細胞膜
細胞質
結構 擬核

鞭毛
特殊結構 莢膜
芽孢
(4)繁殖: 主要以二分裂方式進行繁殖的
(5)菌落: 單個細菌用肉眼是看不見的,當單個或少數細菌在固體培養基啊行大量繁殖時,便會形成一個肉眼可見的,具有一定形態結構的子細胞群落.
菌落是菌種鑒定的重要依據.不同種類的細菌菌落的大小,形狀光澤度顏色硬度透明毒都不同.
2 放線菌
(1)定義:一類主要成菌絲狀生長和以孢子繁殖的陸生性較強的原核生物
(2)分布:含水量較低,有機物較豐富的,呈微鹼性的土壤中
(3)形態構造:主要由菌絲組成,包括基內菌絲和氣生菌絲(部分氣生菌絲可以成熟分化為孢子絲,產生孢子)
(4)繁殖:通過形成無性孢子的形式進行無性繁殖
無性繁殖 有性繁殖
(5)菌落:在固體培養基上:乾燥,不透明,表面呈緻密的絲絨狀,彩色乾粉
3 病毒
(1) 定義:一類由核酸和蛋白質等少數幾種成分組成的」非細胞生物」,但是它的生存必須依賴於活細胞.
(2)結構:
(3)大小:
一般直徑在100nm左右
最大的病毒直徑為200nm的牛痘病毒
最小的病毒直徑為28nm的脊髓灰質炎病毒
(4)增殖:以 噬菌體為例:
吸附 侵入 增殖 裝配 釋放
第二節微生物的營養
一、微生物的化學組成
C,H,O,N,P,S以及其他元素
二、微生物的營養物質
1 水和無機鹽
2 碳源:凡能為微生物提供生長繁殖所需碳元素的營養物質
來源
作用
3氮源:凡能為微生物提供所必需氮元素的營養物質
來源
作用:主要用於合成蛋白質,核酸以及含氮的代謝產物
4 能源:能為微生物生命活動提供最初能源來源的營養物質或輻射能
根據碳源和能源分類:
5生長因子:微生物生長不可缺少的微量有機物

能引起人和動物致病的微生物叫病源微生物有八大類：
1.真菌:引起皮膚病。深部組織上感染。
2放線菌：皮膚，傷口感染。
3螺旋體：皮膚病，血液感染 如梅毒，鉤端螺旋體病。
4細菌：皮膚病化膿，上呼吸道感染 ，泌尿道感染，食物中毒，敗血壓症，急性傳染病等。
5立克次氏體：斑疹傷寒等。
6衣原體：沙眼，泌尿生殖道感染。
7病毒：肝炎，乙型腦炎，麻疹，艾滋病等。
8支原體：肺炎，尿路感染。
生物界的微生物達幾萬種，大多數對人類有益，只有一少部份能致病。有些微生物通常不致病，在特定環境下能引起感染稱條件致病菌。 能引起食品變質，腐敗，正因為它們分解自然界的物體，才能完成大自然的物質循環。
有些人誤將真菌當作細菌，是一種比較普遍的誤解。尤其以80年代以前未受過系統生物學教育者。

2. 明膠凍力分幾級，180.160.150.120ps怎麼分 它的凍力受什麼因素影響

以新鮮牛皮和豬皮為原料，採用全套不銹鋼設備，嚴格篩選鮮骨皮，通過反復洗浸、脫脂中和、蒸煮液化、滅菌過濾、濃縮烘乾等幾十道工序流水線製成。生產出的明膠為一種無味、無色（略帶淺黃色）、半透明、堅硬的非晶態物，其不溶於有機溶劑，它吸水性強、粘度高，明膠是肽分子聚合物質，是膠原蛋白質的水解產物，所以可作為一種添加劑，我們生產的食用明膠因其具有許多獨特的理化性能和較高的營養價值，富含人體必須的18種氨基酸,它可以直接製成濃湯、肉皮凍子、肉食罐頭,水晶凍、色拉、蛋黃汁、糖霜、奶油糖、香味醬、巧克力、飲料、啤酒等供人們食用。我廠生產的工業明膠為無色至淡黃色透明或半透明等薄片或粉粒。無味，無臭。在冷水中吸水膨脹。廣泛用於紡織、印刷、印染、塑料、電子、國防、航空,砂布砂紙、火柴、墨、橡膠填料、工藝品粘貼、木器傢具、皮革上光、染織上漿、冶金鍍液、紙鈔塗質、化妝發膠、等工業和部門中。 其中有用於提取水解動物蛋白質的低粘度低灰份的工業明膠還有專用於飼料添加劑的工業明膠。它的分子量為1-7萬,高級明膠分子量在10-15萬以內。明膠是一種含硫氨酸很低而內氨酸、甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸等含量很高.明膠不易溶於冷水,但能吸收冷水的重量卻是自身的5-10倍,易溶於溫水,冷卻形成凝膠,膠熔點在24-28°C之間,其溶解度與凝固溫度相差很小,易受水份、溫度、濕度的影響而變質。
從動物的膠原質中，通過部分酸法水解(A型)，或者部分鹼法水解(B型)，甚至還可以通過酶解，提純而獲得的膠原蛋白。
明膠(Gelatin)是膠原的水解產物，是一種無脂肪的高蛋白，且不含膽固醇，是一種天然營養型的食品增稠劑。食用後既不會使人發胖，也不會導致體力下降。明膠還是一種強有力的保護膠體，乳化力強，進入胃後能抑制牛奶、豆漿等蛋白質因胃酸作用而引起的凝聚作用，從而有利於食物消化。
【分類】
明膠按用途可分為照相、食用、葯用及工業四類。
【性狀】
本品為淡黃色至黃色、半透明、微帶光澤的粉粒或薄片；無臭；潮濕後，易為細菌分解；在水中久浸即吸水膨脹並軟化，重量可增加5 ～10倍。 本品在熱水、醋酸或甘油與水的熱混合液中溶解，在乙醇、氯仿或乙醚中不溶。
【類別】
賦形劑。
【貯藏】
密閉，在乾燥處保存。
【制劑】
吸收性明膠海綿
【來源】
淡黃至白色，透明帶光澤的粉粒，無臭無肉眼可見的雜質。明膠以動物皮加工而成，骨膠以動物骨頭加工製成：應用於醫葯、膠囊、片劑；食品：糕點、糖果、冰糕、香腸、粉絲、飼料加工；工業：膠合板、紗布、砂石、印刷、粘合劑等。
[編輯本段]明膠成分與特性
成分：
（1）食用明膠是由豬、牛、騾、馬的皮子之角料，（其它動物皮除外）經除雜、消毒、蒸煮形成汁子，再經脫水、製造形成的膠條、膠片、粉粒狀物（一般常用粉粒狀膠）。
（2）葯用明膠是選用動物皮、骨和筋腱，經復雜的理化處理製得的無脂肪高蛋白易被人體吸收的高級膠品。具有粘度高、凍力高、易凝凍等物理特點。
特性：
⑴、葯用明膠是選用動物皮、骨和筋腱，經復雜的理化處理製得的無脂肪高蛋白易被人體吸收的高級膠品。具有粘度高、凍力高、易凝凍等物理特點。外觀為淡黃色至黃色細粒,應保持乾燥、潔凈、均勻,無夾雜物。應通過孔徑4mm標准篩網。
⑵、食用明膠為淡黃色至黃色細粒,應保持乾燥、潔凈、均勻,無夾雜物。本品是由豬、牛、騾、馬的皮子之角料，（其它動物皮除外）經除雜、消毒、蒸煮形成汁子，再經脫水、製造形成的膠條、膠片、粉粒狀物（一般常用粉粒狀膠）。應通過孔徑4mm標准篩網即5目。本品含有18種氨基酸和90%的膠原蛋白,富保健美容效果,具有優良的膠體保護性、表面活性、粘稠性、成膜性、懸乳性、緩沖性、浸潤性、穩定性和水易溶性。
明膠的組成和性質
組成明膠的蛋白質中含有18種氨基酸，其中7種為人體所必需。除16％以下的水分和無機鹽外，明膠中蛋白質的含量佔82％以上，是一種理想的蛋白源。明膠的成品為無色或淡黃色的透明薄片或微粒。明膠不溶於冷水，但可緩慢吸水膨脹軟化，明膠可吸收相當於其重量5—10倍的水。依據來源不同，明膠的物理性質也有較大的差異，其中以豬皮明膠性質較優，透明度高，可塑性強。
明膠可溶於熱水，形成熱可逆性凝膠，它具有極其優良的物理性質，如膠凍力、親和性、高度分散性、低粘度特性、分散穩定性、持水性。被覆性、韌性及可逆性等，因此明膠是一種重要的食品添加劑，如作為食品的膠凍劑、穩定劑。增稠劑、發泡劑。乳化劑、分散劑、澄清劑等，被廣泛應用。
[編輯本段]明膠應用
食用明膠可用於醫用軟硬膠囊、外科敷料、止血海棉、肉凍、食品添加劑、罐頭、糖果、冰糕、火腿腸、皮凍、汽水懸浮劑、檢劑、淀劑、雪糕等食品行業等、執行國家標准GB6783-94。
葯用明膠主要用於軟硬膠囊、片劑糖衣的原材料。
工業明膠主要用於膠合板、紗布、砂石、印刷、粘合劑等。
[編輯本段]明膠測定與鑒別
【鑒別】
(1) 、取本品約0.5g，加水50ml，加熱使溶解後，取溶液5ml ，加重鉻酸鉀試液4 份與稀鹽酸1 份的混合液數滴，即生成桔黃色絮狀沉澱。
(2) 、取鑒別(1) 項下剩餘的溶液1ml ，加水100ml ，搖勻後，加鞣酸試液數滴，即發生渾濁。
(3)、 取本品，加鈉石灰後，加熱，即發生氨臭。
【檢查】
酸度取本品1.0g，加入100ml 熱水中，充分振搖使溶解，放冷至35℃，
依法測定（附錄Ⅳ H），pH值應為3.6～7.6 。
【透明度】
取本品5.0g，加水90ml使膨脹後，在65～70℃水浴中加熱溶解，取出，加水使成100ml ；分取5ml ，置25ml納氏比色管中，立即與同體積的對照液（精密量取標准氯化鈉溶液30ml，置50ml量瓶中，加硝酸與硝酸銀試液各1ml ，用水稀釋至刻度，在暗處放置5 分鍾，必要時可用焦糖溶液調色）比較，不得更渾濁。
【亞硫酸鹽 】
取本品20g ，置長頸圓底燒瓶中，加水50ml，放置使膨脹後，加稀硫酸50ml，即時連接冷凝管，用水蒸氣蒸餾，餾液導入過氧化氫試液（對甲基紅－亞甲藍混合指示液顯中性）20ml中，至餾出液達80ml，停止蒸餾；餾出液中加甲基紅－亞甲藍混合指示液數滴，用氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液顯草綠色，並將滴定的結果用空白試驗校正，消耗氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)不得過1.0ml 。
【乾燥失重】
取本品約1g，置經105 ℃乾燥至恆重的不銹鋼或鋁制器皿（直徑約75mm）中，精密稱定，加水10ml，放置，使膨脹後，置水浴上加熱溶解，蒸干，在105 ℃乾燥至恆重，減失重量不得過16.0％（附錄Ⅷ L）。
【灰分】
取本品1.0g，置熾灼至恆重的坩鍋中，精密稱定，緩緩熾灼至完全炭化時，逐漸升高溫度至600 ～700 ℃，使完全灰化並恆重，遺留灰分不得過2.0 ％。
【重金屬 】
取灰分項下遺留的殘渣，加鹽酸2ml 與硝酸0.5ml ，置水浴上蒸干，加水5ml,再蒸干，加醋酸鹽緩沖液(pH3.5)5ml與水20ml，溫熱數分鍾，加水適量使成50ml。分取20ml，加水5ml ，依法檢查（附錄Ⅷ H第一法），含重金屬不得過百萬分之五十。
【砷鹽 】
取本品1.0g，加澱粉0.5g與氫氧化鈣1.0g，加水少量，攪拌均勻，乾燥後，先用小火熾灼使炭化，再在500 ～600 ℃熾灼成灰白色，放冷，加鹽酸8ml 與水20ml溶解後，依法檢查（附錄Ⅷ J第一法），應符合規定（0.0002％）。
【凝凍濃度】
取本品1.10g ，置稱定重量的錐形瓶中，加水80ml，在15～18℃放置 2小時，使完全膨脹後，置60℃水浴中加熱溶解，取出，稱重，加水適量使內容物成100g，取10ml，置內徑13mm的試管中，在0℃冰浴中冷凍6 小時，取出，倒置10秒鍾，應不流下。
[編輯本段]明膠在糖果中的應用
據報道，全世界的明膠有60％以上用於食品糖果工業。在糖果生產中，明膠用於生產奶糖。蛋白糖、棉花糖，果汁軟糖、晶花軟糖，橡皮糖等軟糖。明膠具有吸水和支撐骨架的作用，明膠微粒溶於水後，能相互吸引、交織，形成疊疊層層的網狀結構，並隨溫度下降而凝聚，使糖和水完全充塞在凝膠空隙內，使柔軟的糖果能保持穩定形態，即使承受較大的荷載也不變形。明膠能控製糖結晶體變小，並防止糖漿中油水相對分離，作為乳化劑，黏合劑用於糖果製造中，可減少脆性，有利於成型，便於切割，從而防止了各類型糖果的破碎，提高成品率。
明膠在糖果中的一般加量為5％～10％。在晶花軟糖中明膠用量6％時效果最好，在橡皮糖中明膠的添加量為6．17％，在牛軋糖中為0．16%～3％或更多些，在糖果粘液的濃糖漿中加量為1．15%～9％，糖味錠劑或棗子糖果的配料要求含明膠2％～7％。
在糖果生產中，使用明膠較澱粉、瓊脂更富有彈性．韌性和透明性，特別是生產彈性充足、形態飽滿的軟糖、奶糖時，需要凝膠強度大的優質明膠。
食用明膠
一、 技術標准
食用明膠乾燥、潔凈、均勻 , 無夾雜物，通過孔徑 4mm 標准篩網即 5 目。加工成 10-120 目狀如奶粉。含有 18 種氨基酸和 90% 的膠原蛋白 , 富保健美容效果 , 具有優良的膠體保護性、表面活性、粘稠性、成膜性、懸乳性、緩沖性、浸潤性、穩定性和水易溶性 , 用於肉凍、罐頭、糖果、香腸、粉絲、方便麵、雪糕等食品行業 , 執行國家標准 GB6783-94, 可指定辦理 SGS 、 TTS 品質證和 CIQ 獸醫衛生證及放行的換證憑條。
二、技術標准
食用明膠的理化微生物質量符合GB/T6783-1994技術標准
水分 % ≤14.0；膠凍強度(按水分12%商品膠6.67%)Bloom g ≥220；勃氏粘度(按水分12%商品6.67%)m≥3.0；透明度 mm ≥300；水不溶物 % ≤0`2；二氧化硫 mg/kg ≤40；PH值=4.5-6.5；重金屬(以Pb計) mg/kg ≤50；細菌總數 個/g ≤1000
三、用途
明膠按用途可分為照相、食用、葯用及工業四類。食用明膠作為一種增稠劑廣泛使用於食品工業的添加如果凍、食用色素、高級軟糖、冰淇淋、干酷、酸奶、冷凍食品等。在化工行業主要用作粘合、乳化和高級化妝品等製作的原料。
四、使用說明
使用前須用冷水浸泡數小時（可避免加熱時產生大量氣泡和末完全膨脹所產生的僵塊），待完全膨脹後再隔水加熱，膠液溫度控制在70°C以下。使其完全溶解後方可使用。尚末用完的膠液應貯於冷庫或通風陰涼處，以免膠阮水解變質，影響使用效果。
五、包裝、貯存
本品採用紙塑復合袋包裝，通常包裝規格為每袋25kg。本品應密封貯藏於乾燥、通風、陰涼處、不得露天堆放，防止受潮、受熱和曝曬。常溫下保質期為二年。
[編輯本段]照相明膠
明膠在膠卷生產的每一步驟都起著非常關鍵的作用，它既能維持感光銀鹽的穩定分散, 以能讓乳劑成熟更易於控制，同時還影響膠卷曝光和沖曬的效果。是國內照相企業主要的供應商，特別是彩膠已大量地被應用於彩色照片的製造沖印。
照相明膠是明膠中的高檔產品，是感光材料生產中三大重要材料之一，由於它的物理化學性能獨特，至今在銀鹽感光材料中做為載體，還沒有可以全面取代明膠的物質。照相明膠可以廣泛地應用於生產各種膠片、膠卷、醫用X光膠片、印刷片、相紙等感光工業中。照相明膠分為彩色感光照相明膠和黑白照相明膠。
彩色感光照相明膠：彩色感光材料是當今高科技精細化工的精華，目前世界上僅有極少數國家能夠生產。彩色感光材料生產所使用的照相明膠（簡稱「彩膠」），又是照相明膠中的高檔次產品，它不僅具有更高的物理性能，對重金屬等微量元素含量有更嚴格的控制要求，還具備更優良的感光性能。
黑白照相明膠：除用於黑白正負片、相紙、醫用和工業用X光膠片外，還廣泛用於報紙和書刊的印刷膠片。
[編輯本段]葯用明膠
明膠的凝膠性、固水性、粘結性和溶解性等多種特性，令明膠在醫葯行業有關廣泛的用途，其中最主要的有硬膠囊、軟膠囊、代血漿和包衣等。
硬膠囊生產工藝
壁 厚
長 度
主要缺陷A
主要缺陷B
次要缺陷C 2.5
印字主要缺陷 0.15.m
印字次要缺陷 1.5
壁厚、長度、日視缺陷的判斷標准及AQL值參照GBl3731和GB2828的規定
規格尺寸：長度、壁厚尺寸參考金域膠囊公司企標准或有供需雙方商定。
A類缺陷：影響充填機正常運長轉葯物充填不足的缺陷。
B類缺陷：可能會影響膠囊充填機正常運轉葯物充填不足的缺陷。
C類缺陷：僅影響膠囊外觀的缺陷。
印字主要缺陷：道致印字圃案不能碓定或不能辨認的印字缺陷。
細菌總數 個/g 1000 1000 1000
大腸桿菌 不得驗出 不得驗出 不得驗出
黴菌 個/g 100 100 100
葯用明膠質量標准
理化項目 類型250LB 類型240LB 類型220LB 類型200LB 類型250PS 類型240PS
膠凍強度（6.67%，10oC）, Bloom g ≥250 g ≥240 g ≥220 g ≥200 g 250±10 g 240±10 g
勃氏粘度（6.67%，60oC）,mPa·s 4.7~5.1 mPa.s 4.7~5.1 mPa.s 4.4~5.2 mPa.s 4.4~5.2 mPa.s ≥3.5 mPa.s ≥3.5 mPa.s
粘度下降（6.67%，37oC）,% ≤5% ≤5% ≤5% ≤6% ≤10% ≤10%
pH（1.0%，35oC） 5.5~5.9 5.5~5.9 5.5~5.9 5.5~5.9 4.5~6.5 4.5~6.5
灰分，% ≤1% ≤1% ≤1% ≤1% ≤1.5% ≤1.5%
水分，% ≤13% ≤13% ≤13% ≤13% ≤14% ≤14%
透過率450mm ≥88% ≥86% ≥80% ≥78% ≥70% ≥70%
透過率620mm ≥96% ≥95% ≥93% ≥92% ≥86% ≥86%
水不溶物，% ≤0.1% ≤0.1% ≤0.1% ≤0.1% ≤0.1% ≤0.1%
二氧化硫，mg/kg ≤40mg/kg ≤40mg/kg ≤40mg/kg ≤40mg/kg ≤40mg/kg ≤40mg/kg
砷，mg/kg ≤0.8mg/kg ≤0.8mg/kg ≤0.8mg/kg ≤0.8mg/kg ≤0.8mg/kg ≤0.8mg/kg
重金屬（Pb計），mg/kg ≤30mg/kg ≤30mg/kg ≤30mg/kg ≤30mg/kg ≤50mg/kg ≤50mg/kg
顆粒尺寸（ASTM網篩） 8目(2.36mm) 8目(2.36mm) 8目(2.36mm) 8目(2.36mm) 8目(2.36mm) 8目(2.36mm)
細菌總數，個/g ≤100個/g ≤100個/g ≤100個/g ≤100個/g ≤500個/g ≤500個/g
大腸菌群，個/100g 10g中不得檢出 10g中不得檢出 10g中不得檢出 10g中不得檢出 10g中不得檢出 10g中不得檢出
沙門氏菌，10g中 25g中不得檢出 25g中不得檢出 25g中不得檢出 25g中不得檢出
[編輯本段]明膠軟糖的製作要點
明膠的纖維狀蛋白，極易受酸、鹼的破壞，直至失去纖維的特徵，改變明膠的性能。明膠受酸鹼作用發生的變化以水為介質，這一過程可使明膠變成蛋白腖和氨基酸，因此，要注意軟糖物料中酸的存在對明膠凝膠力的影響。
選擇明膠時，要注意凝膠強度，優質明膠1％以下濃度也會凝膠，濃度為4％～5％時，凝膠強度每平方厘米承受約500g負重，明膠生產以黏度來控制明膠的質量，吸水率高，黏度也就大，所以選用的明膠強度要達到生產適用標准。
明膠軟糖配方中要注意的問題是明膠的用量和抗結晶物質的選擇。
【 配方】
砂糖40kg檸檬酸0.5kg澱粉糖漿32.5kg檸檬酸鈉0.1kg轉化糖漿15kg各種水果香精適量干明膠4.8kg各種著色劑適量配方2砂糖20kg檸檬酸0.35kg澱粉糖漿35kg檸檬酸鈉——轉化糖漿——各種水果香精適量干明膠4kg各種著色劑適量明膠的用量直接影響軟糖的組織，量少組織柔軟，量多彈性增加，韌性也增強，但韌性太大，食覺也會感到不舒服，所以明膠的用量一定要適當控制。一般柔軟性軟糖的明膠用量為5％左右，較有彈性的軟糖用量為8％左右，如果軟糖富有較大韌性，明膠用量就要在10％以上。
軟糖所用的抗結晶物質，基本上都採用澱粉糖漿，而明膠軟糖常常採用轉化糖漿。這是因為明膠溶膠黏度很大，澱粉糖漿黏度也較大，當稍加冷卻後，糖漿黏度往往影響澆模成型，所以用轉化糖漿來代替部分澱粉糖漿，就能降低軟糖糖漿的黏度。
明膠為一種蛋白質膠體，所以一般酸、鹼、溫度對蛋白質的影響作用，對明膠都會產生一定影響。在軟糖的製作中，一般都以水果味為主，物料的溶化、脫水過程都在加溫條件下完成，對明膠強度、黏度不可避免的造成影響。因此，在明膠軟糖的實際製作過程中，控制好物料的pH，加熱溫度與時間，選擇合適的明膠投入量。投入時間，選擇合適的酸味劑及投入時間、投入量，要根據產品的不同設計要求，反復試驗，才能製造出符合設計要求的合格產品。

3. 微生物學中的TVB-N是什麼東西

關於揮發性鹽基總氮的概念揮發性鹽基總氮是指肉食品的水浸液中在鹼性條件下能與水蒸氣一起蒸餾出來的總氮量(t.tazv.zatilebasienitr.gen即TvB-N).目前揮發性鹽基氮（TVB-N)值是國標中用於評價肉質鮮度的唯一理化指標.

4. 用於基因分型的熒光探針PCR原理是什麼

基因擴增技術（PCR）聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction簡稱PCR）又稱無細胞分子克隆系統或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法，是基因擴增技術的一次重大革新。可將極微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或對每10萬個細胞中僅含1個靶DNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學、微生物學、醫學及遺傳學等多領域廣泛應用和迅速發展。由於PCR具有敏感性高、特異性強、快速、簡便等優點，已在病原微生物學領域中顯示出巨大的應用價值和廣闊的發展前景。
PCR技術是由Cetus公司和加利福尼亞大學1985年聯合創造的，主要貢獻者為Kary B mulis和HeneryA、Erlich。該方法首先被應用於人β-珠蛋白DNA的擴增及鐮刀狀紅細胞貧血病的產前診斷。自85年首次報道PCR方法以來，PCR被廣泛應用於分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、性傳播性疾病及法醫判定和考古研究等多領域、並發揮了越來越大的作用。因而發明人Kary B、mulis獲1993年諾貝爾化學獎。
為了使PCR技術在臨床上迅速得以普及，我們對該技術的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技術變得簡單、微量化、不易發生污染，從而使PCR技術常規化成為可能。我們的方法迅速在全國各大醫院得到推廣。
一、PCR的基本原理和基本程序
PCR擴增DNA的原理是：先將含有所需擴增分析序列的靶DNA雙鏈經熱變性處理解開為兩個寡聚核苷酸單鏈，然後加入一對根據已知DNA序列由人工合成的與所擴增的DNA兩端鄰近序列互補的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴增的DNA片段，一般需20-30個鹼基對，過少則難保持與DNA單鏈的結合。引物與互補DNA結合後，以靶DNA單鏈為模板，經反鏈雜交復性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP）為原料按5'到3'方向將引物延伸、自動合成新的DNA鏈、使DNA重新復製成雙鏈。然後又開始第二次循環擴增。引物在反應中不僅起引導作用，而且起著特異性的限制擴增DNA片段范圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補序列，並又可作為下一輪聚合反應的模板。如此重復上述DNA模板加熱變性雙鏈解開—引物退火復性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環過程，使每次循環延伸的模板又增加1倍，亦即擴增DNA產物增加1倍，經反復循環，使靶DNA片段指數性擴增。
PCR的擴增倍數Y=（1+E）n,這里Y是擴增量，n為PCR的循環次數。E為PCR循環擴增效率。設PCR擴增效率E為100%、循環次數n=25次，靶DNA將擴增到33554432個拷貝，即擴增3355萬倍：若E為80%、n=20、則擴增數量將下降到1408865拷貝，即擴增產物約丟失93%，若E=100%，n=20，則擴增數量減少1048576個拷貝，擴增產物約減少97%。可見PCR循環擴增效率及循環次數都對擴增數量有很大影響。PCR擴增屬於酶促反應，所以，DNA擴增過程遵循酶促動力學原理。靶DNA片段的擴增最初表現為直線上升，隨著靶DNA片段的逐漸積累，當引物—模板/DNA/聚合酶達到一定比值時，酶的促化反應趨於飽和，此時靶DNA產物的濃度不再增加，即出現所謂平台效應。PCR反應達到平台期的時間主要取決於反應開始時樣品中的靶DNA的含量和擴增效率，起始模板量越多到達平台期的時間就越短、擴增效率越高到達平台期的時間也越短。另外酶的含量，dNTp 濃度，非特異性產物的擴增都對到達平台期時間有影響。
二、PCR的特點
（一）特異性高：首次報導的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃會變性失活，需每次PCR循環都要重新加入Klenow大片段，同時引物是在37℃延伸（聚合）易產生模板—引物之間的鹼基錯配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩定的Taq DNA聚合酶，在熱變性處理時不被滅活，不必在每次循環擴增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續反應，顯著地提高PCR產物的特異性，序列分析證明其擴增的DNA序列與原模板DNA一致。擴增過程中，單核苷酸的錯誤參入程度很低、其錯配率一般只有約萬分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測病婦宮頸刮片細胞可以發現部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。
（二）高度敏感：理論上PCR可以按2n倍數擴增DNA十億倍以上，實際應用已證實可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴增到足夠檢測分析量的DNA。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞，或對諸如病人口液等只含一個感染細胞的標本或僅含0.01pg的感染細胞的特異性片段樣品中均可檢測。
（三）快速及無放射性：一般在2小時內約可完成30次以上的循環擴增，加上用電泳分析。只需3-4小時便可完成，不用分離提純病毒，DNA粗製品及總RNA均可作為反應起始物，可直接用臨床標本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發、細胞、活體組織等粗製的DNA的提取液來擴增檢測，省去費時繁雜的提純程序，擴增產物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，無放射性易於推廣。
（四）簡便：擴增產物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去常規方法中須先進行克隆後再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測。如在PCR引物端事先構建一個內切酶位點，擴增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應酶切位點的載體中。
（五）可擴增RNA或cDNA：先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉錄酶將mRNA轉變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進行PCR擴增，即使mRNA轉錄片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能經PCR擴增1ng有242鹼基對長度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長的DNA中，難以將整段DNA大分子擴增和做序列分析。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對外顯子的擴增並進行序列分析。
三、PCR方法
（一）試劑
（1）引物：決定擴增的特異性。根據檢測的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生
物都有自己特異的引物。
（2）耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。
（3）10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購買。
（4）5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合並，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度最好用UV吸收法精確測定。現用dNTP溶液均有商品化產品。
（5）DNA模板：用處理液將待測標本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標本中被檢測的DNA。
（二）操作程序
過去標準的PCR操作程序是將PCR必需反應成份分別加入一微量離心管中，然後置於一定的循環參數條件下進行循環擴增。具體如下：
（1）向一微量離心管中依次加入
DNA模板 102-105拷貝
引物 各1μmol/L
dNTP 各200μmol/L
10×PCR緩沖液 1/10體積
ddH2O 補到終體積（終體積50μl-100μl）
混勻後，離心15s使反應成分集於管底。以上步驟僅在實驗研究用，現在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應體積為20-25μl，只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。
（2）加石蠟油50-100μl於反應液表面以防蒸發。置反應管於97℃變性10min。
（3）冷至延伸溫度時，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應液充分混合。現在臨床使用試劑酶通常已加入反應液中。
（4）PCR的循環程序為：94℃變性30s，55℃退火20s，然後在72℃延伸30s，共循環30-35次。最後一次循環結束後，再將反應管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。
PCR尚可用於組織標本DNA的擴增。由於固定組織標本的DNA常發生降解，就給常用的分析方法如Southern轉印雜交等帶來一定困難。87年Impraim等人首先將PCR技術引入固定包埋組織內DNA分析。他們先從組織標本中提取DNA，再用PCR進行特異性的DNA擴增，應用這種方法，他們成功地從保存30至40年之久的組織標本DNA中擴增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA，操作比較繁瑣。1988年Shibata等人對Impraim的方法進行了改進。他們將固定包埋的組織塊製成5-10um厚，0.4cm大小的切片。將切片放入容積為500μl的Eppendorf管內。加入400μl二甲苯脫脂，離心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去殘餘二甲苯。離心除盡乙醇、加入100μlPCR反應基質，將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然後按前述PCR方法進行DNA擴增。
在應用PCR方法檢測RNA病毒時，首先應將RNA轉化成cDNA才能進行擴增，因為PCR只能對DNA模板進行擴增，我們把這種RNA的PCR反應稱為反轉錄PCR，簡稱RT-PCR。把由RNA轉化成DNA的過程叫做反轉錄，反轉錄需要在反轉錄酶的作用下完成。
四、PCR反應的基本條件及其對PCR的影響
（一）模板核酸
PCR可以以DNA或RNA為模板進行核酸的體外擴增。不過RNA的擴增首先逆轉錄成cDNA後才能進行PCR循環。不同來源的核酸標本必須經處理後才能用於PCR的擴增，處理不當或處理過程中DNA掉失都會導致PCR擴增失敗。採集標本方法不當，未能獲得所要檢測的靶DNA都會導致出現假陰性。但是如果待擴增標本中模板DNA濃度太高也會導致擴增失敗。
（二）引物
PCR結果的特異性取決於引物的特異性，擴增產物的大小也是由特異引物限定的。因此，引物的設計與合成對PCR的成功與否起著決定性的作用。合成的引物必須經聚丙烯醯胺凝膠電泳或反向高壓液相層析（HPLC）純化。因為合成的引物中會有相當數量的「錯誤序列」，其中包括不完整的序列和脫嘌呤產物以及可檢測到的鹼基修飾的完整鏈和高分子量產物。這些序列可導致非特異擴增和信號強度的降低。因此，PCR所用引物質量要高，且需純化。凍干引物於-20℃至少保存12-24個月，液體狀態於-20℃可保存6個月。引物不用時應存於-20℃保存。
PCR反應中引物的量也影響PCR擴增效果，當PCR引物量太低，則產物量降低，會出現假陰性。引物濃度過高會促進引物的錯誤引導非特異產物合成，還會增加引物二聚體的形成。非特異產物和引物二聚體也是PCR反應的底物，與靶序列競爭DNA聚合酶，dNTP底物，從而使靶序列的擴增量降低。一般認為PCR反應中引物的終濃度為0.2～1μmol/L為宜，但我們實驗發現，最適濃度遠遠低於此濃度。
（三）緩沖液
PCR反應的緩沖液的目的是給Taq DNA聚合酶提供一個最適酶催反應條件。目前最為常用的緩沖體系為10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一種雙極性離子緩沖液，20℃時其pKa值為8.3，△pKa值為-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在實際PCR中，pH變化於6.8-7.8之間。改變反應液的緩沖能力，如將Tris濃度加大到50mmol/L，pH8.9,有時會增加產量。
反應混合液中50mmol/L以內的KCl，pH8.9有利於引物的退火，50mmol/l NaCl或50 mmol/L以上的KCl則抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反應液中以NH+4代K+，其濃度為16.6mmol/L。反應中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明膠（0.01%）或Tween 20（0.05% ～0.1%）有助於酶的穩定，反應中加入5mmol/l 的二硫蘇糖醇（DTT）也有類似作用，尤其在擴增長片段（此時延伸時間長）時，加入這些酶保護劑對PCR反應是有利的。
（四）Mg2+
Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實性，這是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它還影響著引物的退火，模板與PCR產物的解鏈溫度，產物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，通常會導致非特異性擴增產物的累積。PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTp 的磷酸基團均可與Mg2+結合，降低Mg2+實際濃度。因為Taq DNA聚合酶需要的是游離Mg2+。
（五）三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）
四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反應中dNTP含量太低，PCR擴增產量太少、易出現假陰性。過高的dNTP濃度會導致聚合將其錯誤摻入（即所謂的「熱力背信」），因此應當避免。一般認為最適的dNTP濃度為50～200μmol/L。dNTP的質量也直接影響PCR反應的成敗。
（六）耐熱DNA聚合酶
PCR之所以能得到廣泛應用，主要是因為Taq DNA聚合酶取代了大腸桿菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是從水生棲熱菌Thermus Aquaticus（Taq）中分離出的熱穩定性DNA聚合酶，使用Taq DNA聚合酶不僅簡化了PCR程序，也極大地增加了PCR特異性及PCR擴增效率。該酶的最適溫度很高（79℃），使引物在高溫下進行退火和延伸，這樣便增加了反應的總強度並減少了與錯配引物的延伸。在PCR反應中，每100μl反應液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶為佳，酶的濃度太低會使擴增產物產量降低，如果酶的濃度太高則會出現非特異性擴增。Taq DNA聚合酶保存不當而失活是PCR實驗失敗的常見原因。
（七）溫度循環參數
1．變性溫度與時間
PCR反應中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產物雙鏈完全解開，才能有效的和引物結合。這種結合是PCR擴增的基礎。變性溫度越高，時間越長變性就越充分。但溫度過高、時間過長又會影響Taq DNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應中第一個循環變性最重要，需時間較長，因模板DNA的鏈比較長。
2．復性溫度與時間
變性溫度是PCR反應成敗的關鍵，復性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復性越好，但是容易出現引物與靶DNA的錯配，增加非特異性結合，溫度太高不利於復性，大多數PCR反應的復性溫度在55℃左右。確定了復性溫度後，復性時間並不是關鍵因素。但復性時間太長會增加非特異的復性。
3．延伸溫度與時間
引物延伸溫度一般為72℃。這個溫度即考慮了Taq DNA聚合酶的活性，又考慮到引物和靶基因的結合。不合適的延伸溫度不僅會影響擴增產物的特異性，也會影響其產量，72℃時，核苷酸的合成速度為35-100個核苷酸/S，這取決於緩沖體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質。72℃延伸1min對於長達2kb的擴增片段是足夠的。然而，延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對很低濃度底物的擴增，延伸時間要長些。
4．循環數：
循環數決定著擴增的產量。在其它參數都已優化條件下，最適循環數取決於靶序列初始濃度。靶序列的初始濃度較低時、要增加循環次數。另外，酶活性不好，或量不足時也要增加循環次數、以便達到有效的擴增量。
五、PCR標本的制備
在將Taq DNA聚合酶引入PCR反應，並使之達到自動化之後，PCR反應已變得十分的簡單了。但是PCR樣品的採集及制備卻並非同樣簡單，而且，許多PCR的失敗都歸因於標本的制備不當。用於PCR的標本必須經適當處理後才能使用，因為標本中的許多雜質能抑制Taq DNA聚合酶的活性。另外，處理標本可使待擴增DNA暴露，能與引物復性。關於PCR標本制備各種專業書中介紹了許多，我們實驗發現操作復雜、不慎便容易造成污染，且不實用。現介紹一種簡單快速的處理方法即3%異硫氰酸胍和待檢標本混合100℃，10min，離心取上清作為PCR模板即可。
六、PCR實驗中常見問題對策
所有實驗結果都有成功或失敗，實驗的失敗可能是應該出結果而沒有出，我們把它稱作假陰性，不該出結果而出了結果我們把它稱為假陽性。PCR實驗中最常見的問題就是假陰性和假陽性問題。
（一）假陰性：出現假陰性結果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設計不合理；提取的模板質量或數量不過關以及PCR系統欠妥當；循環次數不夠。所以在實驗中出現假陰性失敗時，首先在原來擴增的產物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環，一般都會獲得成功。如果沒有成功應檢查PCR擴增儀的溫度是否准確，採集標本是否有問題。為了防止假陰性的出現在選用Taq DNA聚合酶時，要注意用活力高質量好的酶。同時在提取PCR模板時，應特別注意防止污染抑制酶活性物質（如酚、氯仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機試劑的污染。PCR擴增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補，尤其是要絕對保證引物的3′端與靶基因的互補。對變異較大的擴增對象，宜採用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進行PCR操作時應注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應的各溫度點的設置要合理。
（二）假陽性：PCR結果的假陽性是對被檢測標本而言，而反應系統中所擴增的產物是真實的。因為PCR技術高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會造成大量擴增，而造成結果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽性的主要根源。PCR的污染主要是標本間的交叉污染和擴增子的污染。出現假陽性結果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時要隔離不同操作區、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。
七、PCR擴增產物的分析法
PCR擴增DNA片段只是一個重要手段。擴增片段的檢測和分析才是目的，根據研究對象和目的的不同而採用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴增產物的大小，有助於擴增產物的鑒定，點雜交除可鑒定擴增產物外，還有助於產物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴增產物中鑒定出特異產物的大小，增加檢測的特異性與敏感性，最近發展的一系列產物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助於產物的精確分析。
（一）凝膠電泳分析法
PCR產物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，以前者最常用，通過電泳可以判斷擴增產物的大小。在臨床檢測中，僅通過凝膠電泳判斷擴增片段大小即可滿足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內溶解，稍冷後倒入電泳槽。
電泳後，用溴化乙淀染色20min，然後用去離子水漂洗2次，每次15min，於UV燈下觀察結果並拍照。
凝膠電泳不僅可以鑒定產物的大小，檢測擴增的情況，還可以用來純化擴增產物。
（二）點雜交
當擴增產物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。點雜交還有助於檢測突變DNA的突變類型，用於人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對人們認識某些疾病與基因變異的關系起了很大的作用。但是，由於同位素不穩定和放射性危害，不能常規用於臨床或法醫檢驗，用非放射性物質（生物素、熒光素和地高辛等）標記的寡核苷酸探針分析PCR產物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標記物質穩定性高，使用方便、安全、檢測速度快。
（三）微孔板夾心雜交法
該法是通過一固定於微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特異雜交使產物間接地固定於微孔板上。然後，再用一生物素等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一區域雜交，漂洗後顯色即可判斷結果，該法需要兩個雜交過程來檢測一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用於HBV的檢測，其敏感度可達5個HBv DNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡便、快速、避免了同位素標記探針的危害，顯色反應類似於臨床常規應用的ELISA,適於臨床實驗室常規應用。
（四）PCR-ELISA法
本法避免了電泳和雜交的步驟，適於常規ELISA記數儀檢測。因為5'端修飾後仍可進行常規PCR擴增特異靶序列。因此，可以通過修飾一個引物的5′端使其攜帶便於PCR產物固定的功能基因，而通過另一引物5′-端的修飾使產物便於檢測。

5. 微生物學課件資料

一 、 微生物學
⒈定義: 研究微生物在一定條件下的形態結構，生理生化，遺傳變異以及微生物的進化，分類，生態等生命活動規律及其應用的一門科學。
2.研究對象——微生物
1）微生物與我們
微生物無處不在，我們無時不生活在「微生物的海洋」中。
細菌數億/g土壤，土壤中的細菌總重量估計為：10034 × 10 12 噸；
每張紙幣帶細菌：900萬個
人體體表及體內存在大量的微生物：
皮膚表面：平均10萬個細菌/平方厘米；
口腔：細菌種類超過500種；
腸道：微生物總量達100萬億，
糞便乾重的1/3是細菌，每克糞便的細菌總數為：1000億個；
每個噴嚏的飛沫含4500-150000個細菌，重感冒患者為8500萬
少數微生物也是人類的敵人！
鼠疫；天花；艾滋病；瘋牛病；埃博拉病毒；
可以說，微生物與人類關系的重要性，你怎麼強調都不過分，微生物是一把十分鋒利的雙
刃劍，它們在給人類帶來巨大利益的同時也帶來「殘忍」的破壞。它給人類帶來的利益不僅是享受，而且實際上涉及到人類的生存。
微生物的特點：
（1）體積小， 面積大：測量單位：微米或鈉米
桿菌的平均長度：2 微米；1500個桿菌首尾相連= 一粒芝麻的長度；10-100億個細菌加起來重量 = 1毫克； 面積/體積比：人 = 1，大腸桿菌 = 30萬；
這樣大的比表面積特別有利於它們和周圍環境進行物質、能量、信息的交換。微生物的其它很多屬性都和這一特點密切相關。
對1cm3固體做10倍系列三維分割後的比面值變化
（2）吸收多 ，轉化快：
微生物獲取營養的方式多種多樣，其食譜之廣是動植物完全無法相比的！
纖維素、木質素、幾丁質、角蛋白、石油、甲醇、甲烷、天然氣、塑料、酚類、氰化物、各種有機物均可被微生物作為糧食一頭500 kg的食用公牛，24小時生產 0.5 kg蛋白質,
而同樣重量的酵母菌，以質量較次的糖液（如糖蜜）和氨水為原料，24小時可以生產 50000 kg優質蛋白質
（3）生長旺，繁殖快
大腸桿菌一個細胞重約10 –12 克，平均20分鍾繁殖一代
24小時後： 4722366500萬億個後代，重量達到：4722噸
48小時後：2.2 × 10 43個後代，重量達到2.2 × 10 25 噸
相當於4000個地球的重量！
（4）適應強，易變異：
抗熱：有的細菌能在265個大氣壓，250 ℃的條件下生長；自然界中細菌生長的最高溫度可以達到113 ℃ ；有些細菌的芽孢，需加熱煮沸8小時才被殺死；
抗寒：有些微生物可以在―12℃ ~ ―30℃的低溫生長；
抗酸鹼：細菌能耐受並生長的pH范圍：pH 0.5 ~ 13
耐滲透壓：蜜餞、腌製品，飽和鹽水（NaCl, 32%)中都有微生物生長；
抗壓力：有些細菌可在1400個大氣壓下生長
個體小、結構簡、且多與外界環境直接接觸繁殖快、 數量多（突變率：10-5 – 10-10）短時間內產生大量的變異後代。
（5）分布廣，種類多：
（6）起源早，發現晚：38億年前，生命在海洋中出現300多年前人們才真正發現微生物的存在26億年前，陸地上就可能存在微生物，雖然目前已定種的微生物只有大約10萬種，遠較動植物為少，但一般認為目前為人類所發現的微生物還不到自然界中微生物總數的1%
級界寬
（7）休眠長：世界上最古老的活細菌（芽孢）：2.5億年
3.在生物界中的地位
微生物在生物五（六）界系統中的地位

Wittaker(1969): 五界系統
Woes(1977，1990): 三原界分類系統，包括細菌，古生菌，真核生物
4.內容及分科
二、微生物的發現和微生物學的建立和發展
（一）微生物的發現：我國8000年前就開始出現了曲櫱釀酒，；制醬，醋
4000年前埃及人已學會烘製麵包和釀制果酒；
2500年前發明釀醬、醋，用曲治消化道疾病；
公元六世紀(北魏時期)賈思勰的巨著「齊民要術」；
公元2世紀，張仲景：禁食病死獸類的肉和不清潔食物；
公元前112年-212年間，華佗：「割腐肉以防傳染」；
公元九世紀痘漿法、痘衣法預防天花；
1346年，克里米亞半島上的法卡城之戰(靼坦人-羅馬人)；
16世紀，古羅巴醫生G.Fracastoro：疾病是由肉眼看不見的生物(living creatures)引起的；
1641年，明末醫生吳又可也提出「戾氣」學說
顯微鏡的發明：列文虎克（荷蘭）：1664年，英國人虎克（Robert Hooke）曾用原始的顯微鏡對生長在皮革表面及薔薇枯葉上的黴菌進行觀察，
首次看見並描述微生物：1676年，微生物學的先驅荷蘭人列文虎克（Antony van leeuwenhoek）首次觀察到了細菌。他沒有上過大學，是一個只會荷蘭語的小商人，但卻在1680年被選為英國皇家學會的會員。列文虎克利用業余時間製造過400多架單式顯微鏡和放大鏡，放大率一般為50~200倍。
（二）微生物學的建立和發展

2、微生物學的奠基
法國人巴斯德（Louis Pasteur）（1822～1895）
(1) 發現並證實發酵是由微生物引起的；
(2) 徹底否定了「自然發生」學說；
著名的曲頸瓶試驗無可辯駁地證實，空氣內確實含有微生物，是它們引起有機質的腐敗。
(3) 免疫學——預防接種
首次製成狂犬疫苗
(4)其他貢獻
巴斯德消毒法：60～65℃作短時間加熱處理，殺死有害微生物

德國人柯赫（Robert Koch）（1843～1910）
（1）微生物學基本操作技術方面的貢獻
a）細菌純培養方法的建立
土豆切面 → 營養明膠 → 營養瓊脂（平皿）
b）設計了各種培養基，實現了在實驗室內對各種微生物的培養
c）流動蒸汽滅菌
（2）對病原細菌的研究作出了突出的貢獻：
a）具體證實了炭疽桿菌是炭疽病的病原菌
b）發現了肺結核病的病原菌；（1905年獲諾貝爾獎）
c）證明某種微生物是否為某種疾病病原體的基本原則
——著名的柯赫原則

3、微生物學發展過程中的重大事件
1890 Von Behring��制備抗毒素治療白喉和破傷風
1892 Ivanovsky 提供煙草花葉病毒是由病毒引起的證據；
1928 Griffith發現細菌轉化；
對其機理的研究導致DNA是遺傳物質的確證；外源遺傳物質導入各種細胞的基因重組技術的建立；
1929 Fleming 發現青黴素；
1944 Avery等證實轉化過程中DNA是遺傳信息的載體；
1953 Watson和Crick��提出DNA雙螺旋結構；
1970～1972 Arber、Smith和Nathans發現並提純了DNA限制性內切酶
1977 Woese提出古生菌是不同於細菌和真核生物的特殊類群 Sanger首次對f×174噬菌體DNA進行了全序列分析；
1982～1983 �Prusiner�發現朊病毒(prion)；
1983～1984 �Mullis 建立PCR技術；
1995 第一個獨立生活的細菌(流感嗜血桿菌)全基團組序列測定完成；
1996 第一個自養生活的古生菌基因組測定完成
1997 第一個真核生物(啤酒酵母)基因組測序完成
4、20世紀的微生物學
十九世紀末到二十世紀中期：
微生物學：鑒定病原菌、研究免疫學及其在預防疾病中的作用、尋找化學治療葯物、分析微生物的化學活性。
普通生物學：細胞的構造及其在繁殖和發展中的作用、植物和動物的遺傳和進化的機制。
20世紀40年代後，微生物自身的特點使其成為生物學研究的「明星」，微生物學很快與生物學主流匯合，並被推到了整個生命科學發展的前沿，獲得了迅速的發展，在生命科學的發展中作出了巨大的貢獻。
微生物學與生物學發展的主流匯合、交叉，獲得了全面、深入的發展
5、21世紀微生物學展望
與其他學科實現更廣泛的交叉，獲得新的發展學科交叉永遠是科學創新的源泉！
微生物基因組的序列測定和分析；
微生物的快速檢定；
微量熱技術對生命過程的研究
計算機技術與微生物學的結合。
三、 微生物學對生命科學的促進
1. 多學科交叉促進微生物學的全面發展
2. 促進重大理論問題的突破
3. 對生命科學研究技術的貢獻
4. 微生物與人類基因組計劃

四、我國微生物學界面臨的機遇和挑戰

思 考 題：
• 試根據微生物的特點，談談為什麼說微生物既是人類的敵人，更是人類的朋友。
• 為什麼說巴斯德和柯赫是微生物學的真正奠基人？

6. 明膠,果膠,瓊脂有什麼區別

一、成分不同

1、明膠：主要成分為蛋白質。

2、果膠：其組成有同質多糖和雜多糖兩種類型。

3、瓊脂：主要成分是膳食纖維、蛋白質。

二、性質不同

1、明膠：可溶於熱水，不溶於冷水。

2、果膠：在酸性溶液中較在鹼性溶液中穩定，通常按其酯化度分為高酯果膠及低酯果膠。

3、瓊脂：具有凝固性、穩定性，能與一些物質形成絡合物等物理化學性質。

三、用途不同

1、明膠：全世界的明膠有60%以上用於食品糖果工業。

2、果膠：果膠作為一種高檔的天然食品添加劑和保健品，可廣泛應用於食品、醫葯保健品和一些化妝品中。商業化生產果膠的原料主要是柑橘皮及蘋果皮。國內果膠資源豐富，但加工利用率低，大部分原料都被直接丟棄，如能加以綜合利用，將會帶來巨大的經濟效應。

3、瓊脂：廣泛用於製造粒粒橙及各種飲料、果凍、冰淇淋、糕點、軟糖、罐頭、肉製品、八寶粥、銀耳燕窩、羹類食品、涼拌食品等等。瓊脂在化學工業，醫學科研，可作培養基，葯膏基及其他用途。

7. 柯赫對微生物學的貢獻 柯赫原則有哪些

貢獻：⑴對微生物學基本操作技術方面的貢獻 a）細菌純培養方法的建立 土豆切面 → 營養明膠 → 營養瓊脂（平皿） b）設計了各種培養基，實現了在實驗室內對各種微生物的培養 c）流動蒸汽滅菌 d）染色觀察和顯微攝影 ⑵對病原細菌研究的貢獻： a）具體證實了炭疽桿菌是炭疽病的病原菌 b）發現了肺結核病的病原菌（1905 年獲諾貝爾獎）
柯赫原則： ① 在每一相同病例中都出現這種微生物 ②要從寄主分離出這樣的微生物並在培養基中培養出來 ③用這種微生物的純培養接種健康而敏感的寄主，同樣的疾病會重復發生 ④從試驗發病的寄主中能再度分離培養出這種微生物來

8. 瓊脂、魚膠粉和明膠有什麼區別

主要區別有，性質不同、特點不同、應用不同，具體如下：

一、性質不同

1、瓊脂

瓊脂，又名洋菜、海東菜、凍粉、瓊膠、石花膠、燕菜精等，是以藻類的石花菜屬及江蘺屬製成的產品，為最常用的微生物培養基的固化劑。

二、特點不同

1、瓊脂

瓊脂的凝點和熔點之間的溫度相差很大。它在水中需加熱至95℃時才開始熔化，熔化後的溶液溫度需降到40℃時才開始凝固，所以它是配製固體培養基的最好凝固劑。用瓊脂配製的固體培養基，可用以進行高溫培養而不熔化，在凝固之前接種時，也不致將培養物燙死。

2、魚膠粉

魚膠粉有抗氧化的作用，能促進細胞的新陳代謝，是純蛋白質成份，不含澱粉，不含脂肪，不但是低熱量的健康低卡食品，更可以補充肌膚大量的膠原蛋白。

3、明膠

食用明膠是膠原的水解產物，是一種無脂肪的高蛋白，且不含膽固醇，是一種天然營養型的食品增稠劑。食用後既不會使人發胖，也不會導致體力下降。明膠亦是一種強有力的保護膠體，乳化力強，進入胃後能抑制牛奶、豆漿等蛋白質因胃酸作用而引起的凝聚作用，從而有利於食物消化 。

三、應用不同

1、瓊脂

廣泛用於製造粒粒橙及各種飲料、果凍、冰淇淋、糕點、軟糖、罐頭、肉製品、八寶粥、銀耳燕窩、羹類食品、涼拌食品等等。

2、魚膠粉

魚膠粉的用途非常廣泛，不但可以自製果凍，更是製作慕斯蛋糕等各種甜點不可或缺的原料。

3、明膠

食用明膠作為一種增稠劑廣泛使用於食品工業的添加如果凍、食用色素、高級軟糖、冰激凌、乾醋、酸奶、冷凍食品等。

9. 聚合酶鏈反應的反應體系

PCR基本原理示意圖（如右圖）：
在一個典型的PCR反應體系中需加入：適宜的緩沖液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐熱性多聚酶、Mg2 和兩個合成的DNA引物。模板DNa 94℃變性1min，引物與模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循環前模板預變性3～5min；在末次循環後，樣品仍需繼續延伸3～5min以上，確保擴增的DNA為雙鏈DNA。為便於了解PCR反應中各成份的組成，加入量和反應條件，使人們以此為基礎，對不同的研究對象逐項改變來找到最佳反應條件，特列舉Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA試劑盒提供的典型反應條件供參考。 用於PCR的標准緩沖液見PCR操作範例。於72℃時，反應體系的pH值將下降1個單位，接近於7.2。二價陽離子的存在至關重要，影響PCR的特異性和產量。實驗表明，Mg2 優於Mn2 ，而Ca2 無任何作用。
1．Mg2 濃度Mg2 的最佳濃度為1.5mmol/L（當各種dNTP濃度為200mmol/L時），但並非對任何一種模板與引物的結合都是最佳的。首次使用靶序列和引物結合時，都要把Mg2 濃度調到最佳，其濃度變化范圍為1～10mmol/L。Mg2 過量易生成非特異性擴增產物，Mg2 不足易使產量降低。
樣品中存在的較高濃度的螯合劑如EDTA或高濃度帶負電荷的離子基團如磷酸根，會與Mg2 結合而降低Mg2 有效濃度。因此，用作模板的DNA應溶於10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。
dNTP含有磷酸根，其濃度變化將影響Mg2 的有效濃度。標准反應體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L，低於1.5mmol/L的Mg2 濃度。因此，在高濃度DNA及dNTP條件時，必須相應調整Mg2 的濃度。
2．Tris -HCl緩沖液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl緩沖液，很少使用其他類型的緩沖液。Tris緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液，pKa為8.3(20℃),△pKa為0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)時，在典型的熱循環條件下，真正的pH值在7.8～6.8之間。
3．KCl濃度K 濃度在50mmol/L 時能促進引物退火。但研究表明，NaCl濃度在50mmol/L時，KCl濃度高於50mmol/L將會抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl對PCR結果沒有太大影響。
4．明膠明膠和BSA或非離子型去垢劑具有穩定酶的作用。一般用量為100μg/ml，但現在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR結果，影響不大。
5．二甲基亞碸（DMSO）在使用Klenow片段進行PCR時DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利於減少DNA的二級結構，使（G C）%含量高的模板易於完全變性，在反應體系中加入DMSO使PCR產物直接測序更易進行，但超過10%時會抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多數並不使用DMSO。 在PCR反體系中dNTP終濃度高於50mmol/L會抑制Taq酶的活性，使用低濃度dNTP可以減少在非靶位置啟動和延伸時核苷酸錯誤摻入，高濃度dNTPs易產生錯誤摻入，而濃度太低，勢必降低反應物的產量。PCR常用的濃度為50～200μmol/L，不能低於10～15μmol/L。四種dNTP的濃度應相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會誘導聚合酶的錯誤摻入，降低合成速度，過早終止反應。
決定最低dNTP濃度的因素是靶序列DNA的長度和組成，例如，在100μl反應體系中，4×dNTPs濃度若用20μmol/L，基本滿足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μgDNA，而200μmol/L足以合成25μg/DNA。
購自廠商的dNTP溶液一般均未調pH，應用1mol/l NaOH將dNTP貯存液pH調至7.0，以保證反應的pH值不低於7.1。市購的游離核苷酸凍乾粉，溶解後要用NaOH中和，再用紫外分光光度計定量。 典型PCR反應混合物中，所用酶濃度為2.5U/μl，常用范圍為1～4U/100μl。由於DNA模板的不同和引物不同，以及其它條件的差異，多聚酶的用量亦有差異，酶量過多會導致非特異產物的增加。
由於生產廠家所用兵配方、製造條件以及活性定義不同，不同廠商供應的TaqDNA聚合酶性能也有所不同。
Cetus公司酶定義是：1個酶單位是指在以下分析條件下，於74℃，30min內使10nmmol的dNTP摻入酸不溶性成分所需的酶。測定時間為10min，折算成30min摻入量。
分析條件為25nmol/L TAPS（三羥基-甲基-氨基丙烷磺酸鈉pH9.3.25℃），50mmol/l KCl，2mmol/L MgCl2.1mmol/L β-ME（巰基乙醇），dATP、dTTP、dGTP各200mmol/L，dCTP為100mmol/L(由不標記及α-32P標記混合)，12.μg變性鯡魚精子DNA，最終體積50μl。 單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過逆轉錄得到第一條cDNA。雖然PCR可以僅用極微量的樣品，甚至是來自單一細胞的DNA，但為了保證反應的特異性，還應用ng級的克隆DNA，μg水平的單拷貝染色體DNA或104拷貝的待擴增片段作為起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結合DNA的蛋白。
DNA的大小並不是關鍵的因素，但當使用極高分子量的DNA（如基因組的DNA時），如用超聲處理或用切點罕見的限制酶（如Sal1和Not1）先行消化，則擴增效果更好。閉環靶序列DNA的擴增效率略低於線狀DNA，因此，用質粒作反應模板時最好先將其線狀化。
模板靶序列的濃度因情況而異，往往非實驗人員所控制，實驗可按已知靶序列量逆減的方式（1ng，0.1ng，0.001ng等），設置一組對照反應，以檢測擴增反應的靈敏度是否符合要求。 在實際工作中常採用瓊脂糖凝膠電泳。一般情況下先在電泳緩沖液或凝膠中加1%溴化乙錠（EB）（每100ml加100μl），然後將已經制備好的1%～2%瓊脂糖凝膠（用電泳緩沖液配製）放入電泳槽內，加入待測樣品10μl，同時用分子量標准品作標記。瓊脂糖濃度應按分離DNA片段的大小進行選擇，一般用1.5%～2%，電泳電壓75V，待樣品進行凝膠內距膠末端1cm時，切斷電源，取出凝膠在紫外燈下直接觀察結果。
由於溴化乙錠可與雙鏈DNA形成結合物，在紫外燈下能發射熒光，使EB的熒光強度增強80～100倍，所以，電泳後凝膠在紫外燈下可直接觀察。一般肉眼觀察DNA量可達10ng，其熒光強度與DNA含量成正比。
DNA分子在凝膠中泳動速度決定於電荷效應及分子效應。前者由所帶凈電荷量決定，而後者與分子大小及構型有關。按照DNA分子大小，其凝膠濃度可做不同的調整。有條件的實驗室也可用聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）分析擴增的DNA片段。 PCR技術必須有人工合成的合理引物和提取的樣品DNA，然後才進行自動熱循環，最後進行產物鑒定與分析。引物設計與合成目前只能在少數技術力量較強的研究院、所進行，臨床應用只需購買PCR檢測試劑盒就可開展工作，PCR自動熱循環中影響因素很多，對不同的DNA樣品，PCR反應中各種成份加入量和溫度循環參數均不一致。現將幾種主要影響因素介紹如下。
一、溫度循環參數
在PCR自動熱循環中，最關鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作範例所示，其變性、退火、延伸的條件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30個循環，擴增片段500bp。在這里，每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度後開始計算。在自動熱循環儀內由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要30～60s，這一遲滯時間的長短取決於幾個因素，包括反應管類型、壁厚、反應混合液體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩步驟間的溫度差，在設置熱循環時應充分給以重視和考慮，對每一儀器均應進行實測。
關於熱循環時間的另一個重要考慮是兩條引物之間的距離；距離越遠，合成靶序列全長所需的時間也越長，前文給出的反應時間是按最適於合成長度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度的選擇作一介紹。
1．模板變性溫度變性溫度是決定PCR反應中雙鏈DNA解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會很快復性，因而減少產量。一般取90～95℃。樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時間過久沒有必要；反之，在高溫時間應盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶後最高變性溫度不宜超過95℃。
2．引物退火溫度退火溫度決定PCR特異性與產量；溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結合，DNA擴增效率下降；溫度低產量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產物增加。一般先由37℃反應條件開始，設置一系列對照反應，以確定某一特定反應的最適退火溫度。也可根據引物的（G C）%含量進行推測，把握試驗的起始點，一般試驗中退火溫度比擴增引物的融解溫度TTm低5℃，可按公式進行計算：
Ta = Tm -5℃= 4(G C) 2(A T)-5℃
其中A，T，G，C分別表示相應鹼基的個數。例如，20個鹼基的引物，如果（G C）%含量為50%時，則Ta的起點可設在55℃。在典型的引物濃度時（如0.2μmol/L）,退火反應數秒即可完成，長時間退火沒有必要。
3．引物延伸溫度溫度的選擇取決於Taq DNA聚合酶的最適溫度。一般取70～75℃，在72℃時酶催化核苷酸的標准速率可達35～100個核苷酸/秒。每分鍾可延伸1kb的長度，其速度取決於緩沖溶液的組成、pH值、鹽濃度與DNA模板的性質。擴增片段如短於150bp，則可省略延伸這一步，而成為雙溫循環，因Taq DNA聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成。對於100～300bp之間的短序列片段，採用快速、簡便的雙溫循環是行之有效的。此時，引物延伸溫度與退火溫度相同。對於1kb以上的DNA片段，可根據片段長度將延伸時間控制在1～7min，與此同時，在PCR緩沖液中需加入明膠或BSA試劑，使Taq DNA聚合酶在長時間內保持良好的活性與穩定性；15%～20%的甘油有助於擴增2.5kb左右或較長DNA片段。
4．循環次數常規PCR一般為25～40個周期。一般的錯誤是循環次數過多，非特異性背景嚴重，復雜度增加。當然循環反應的次數太少，則產率偏低。所以，在保證產物得率前提下，應盡量減少循環次數。
擴增結束後，樣品冷卻並置4℃保存。
二、引物引物設計
要擴增模板DNA，首先要設計兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實際上就是兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度，兩引物的5』端決定擴增產物的兩個5』末端位置。由此可見，引物是決定PCR擴增片段長度、位置和結果的關鍵，引物設計也就更為重要。
引物設計的必要條件是與引物互補的靶DNA序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為15～20個鹼基，可以用DNA合成儀合成與其對應互補的二條引物，除此之外，引物設計一般遵循的原則包括：
1．引物長度根據統計學計算，長約17個鹼基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現的機率的為1次。因此，引物長度一般最低不少於16個核苷酸，而最高不超過30個核苷酸，最佳長度為20～24個核苷酸。這樣短的寡核苷酸在聚合反應溫度（通過72℃）下不會形成穩定的雜合體。有時可在5』端添加不與模板互補的序列，如限制性酶切位點或啟動因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5』端生物素標記或熒游標記可用於微生物檢測等各種目的。有時引物不起作用，理由不明，可移動位置來解決。
2．（G C）%含量引物的組成應均勻，盡量避免含有相同的鹼基多聚體。兩個引物中（G C）%含量應盡量相似，在已知擴增片段（G C）%含量時宜接近於待擴增片段，一般以40%～60%為佳。
3．引物內部應避免內部形成明顯的次級結構，尤其是發夾結構（hairpinstructures）。例如：
4．引物之間兩個引物之間不應發生互補，特別是在引物3』端，即使無法避免，其3』端互補鹼基也不應大於2個鹼基，否則易生成「引物二聚體」或「引物二倍體」（Primer dimer）。所謂引物二聚體實質上是在DNA聚合酶作用下，一條引物在另一條引物序列上進行延伸所形成的與二條引物長度相近的雙鏈DNA片段，是PCR常見的副產品，有時甚至成為主要產物。
另外，兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續6個以上相同鹼基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點；同樣，引物與待擴增靶DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個以上鹼基的同源序列。否則，引物就會與其它位點結合，使特異擴增減少，非特異擴增增加。
5．引物3』端配對DNA聚合酶是在引物3』端添加單核苷酸，所以，引物3』端5～6個鹼基與靶DNA的配對要求必須精確和嚴格，這樣才能保證PCR有效擴增。
引物設計是否合理可用PCRDESN軟體和美國PRIMER軟體進行計算機檢索來核定。
人工合成的寡核苷酸引於最好經過色譜（層析）純化或PAGE純化，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質。純化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生長；一般情況下，不用的引物應保存在-20℃冰箱中，在液體中引物能保存6個月，凍干後可保存1～2年。
三、DNA聚合酶
在1956年Kornberg等就從大腸桿菌提取液中發現了DNA聚合酶，並且得到了DNA聚合酶Ⅰ純品。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量為109000的一條多肽鏈構成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解為兩個片段，一個片段分子量為76000，有聚合酶活性，並有3』→5外切酶活力，即Klenow片段（Klenow fragment）。另一個片段分子量為34000，具有5』→』3』外切酶活力。因此，DNA聚合酶具有幾種功能：一是聚合作用，以DNA為模板，將dNTP中的脫氧單核苷酸逐個加到3-OH末端。二是有』3』→5』外切酶活力，能識別和消除錯配的引物末端，與復制過程中校正功能有關。三是5』→3』外切酶活力，它能從5』端水解核苷酸，還能經過幾個核苷酸起作用，切除錯配的核苷酸。1985年Mullis 等發明了PCR方法，以Klenow片段完成β-珠蛋白的PCR後，世界上許多實驗室就考慮用耐熱DNA聚合酶代替Klenow片段進行PCR，使耐熱多聚酶的研究得以迅速發展。人們從生活於60℃（B.Stearothermophilus）到87℃（S.Solfatavicus）的許多菌中分離純化出耐熱DNA聚合酶，但有些酶不能耐受DNA變性所需溫度，所以無法應用於PCR。
1．Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是使PCR普及應用的關鍵。Klenow片段不能耐受95℃的雙鏈DNA變性溫度，所以每次循環都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受93～95℃的高溫，避免了不斷補加多聚酶的繁瑣操作，同時使退火和延伸溫度得以提高，減少了非特異性產物和DNA二級結構對PCR的干擾，增進了PCR特異性、產量和敏感度，二者相比，其主要區別在於：①Klenow酶的最適溫度為37℃，擴增的產物並非全是目的序列，需用探針檢測。Taq酶則不僅產率高而特異性也高。它的最適溫度為74～75℃。因而使退火溫度可以提高，使退火嚴格性提高，減少錯配引物的延伸。②循環後期酶量漸感不足而產生平坡。到達平玻的循環次數，Klenow酶為20個（均用1μg基因組DNA開始）而Taq酶為30個。③延伸片段長度Taq酶為10kb以內，而Klenow酶為400bp以內。
Taq酶由水棲高溫菌（Thermusaquatics）YT1蓖株中分離而得。此菌於1969年由Brock分離自美國黃石公園溫泉，作為棲熱桿菌的標准菌株，其生長溫度為70～75℃。最初從中分離到分子量60～68KDa，比活性為2000～8000U/mg的DNA聚合酶。後來Cetus公司的Kary Mullis等又分離到比活為20萬U/mg的純酶，分子量為93910。此種9.4KDa酶的最適溫度為75～80℃，與單純核苷酸的結合率（Kcat）可達150核苷酸（nt）/s酶分子。以M13模板，用富含G C的30bp引物延伸，70℃時Kact>60nt/s；55℃可達24nt/s；37℃時為1.5nt/s，而22℃時低至0.25nt/s。高於90℃時DNA合成活性甚差，這種高溫條件下，引物與模板已不能牢固結合。
在PCR反應混合液中，Taq酶於92.5℃,95℃及97.5℃保持其50%活力的時間分別為130、40及5～6min，在50次循環的PCR中當管內最高溫度為95℃。每循環為20s時尚可保持65%活力。Taq 酶在95℃的半壽期為40min，故在PCR循環中選用的變性溫度，不宜高於95℃。
Taq酶現已可用基因重組的方法生產，商品名為Ampli Taq（Cetus公司）。Taq酶的完整基因長2499bp，在大腸桿菌中表達生產，含832個氨基酸。在氨基酸序列上與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ有38%是一致的，包括對dNTP結合，引物與模板作用區均存在於Taq酶中。
Taq酶具有依賴DNA合成的5』→』3』外切酶活性，因此，模板上有一段退火的3』-磷酸化的「阻斷物」，會被逐個切除而不會阻止來自上游引物鏈的延伸，而對於5』-32P標記的合成寡核苷酸引物，則無論是單鏈或是與模板復性，都未發現降解，所以該種活性不會影響PCR結果。Taq酶沒有3』→』5』外切酶活性，如果發生dNTP錯誤摻入，這種酶沒有校正能力，因此運用Taq酶進行PCR，產物中點突變較多，對克隆等不太有利。一般錯摻率為1.25×10-4~1×10-5(4×dNTPs濃度分別為200μmol/L，Mg2 為1.5mmol/L，在55℃退火)。但不含3』→5』外切酶活性對測序有利。
2．影響酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2 離子的影響。用鯡精DNA為模板，總dNTP濃度0.7～0.8mmol/L,Mg2 為2.0mmol/L時激活能力最高。濃度超過此值產生抑制。10mmol/l MgCl2抑制活力達40%～50%。dNTP能與Mg2 結合，故游離Mg2 只是結合後剩餘的量。若總dNTP濃度高至4～6mmol/L時，Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。
dNTP濃度低時PCR產率及特異性均增高，適合於用擴增摻入法標記生物素及放射性元素。當100μlPCR液中含dNTP各40μmol/L時就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）。
用鯡精DNA，70℃，10min內dNTP的摻入量計算，標准條件為100%。
純9.4KDa Taq酶不含3』→5』核酸外切酶活力。誤摻入率取決於dNTP濃度。但Taq酶具有DNA依賴的鏈移位5』→3』核酸外切酶活力。對5』→3』32P標記寡核苷酸單鏈，或與MB模板雜交時均只有極少的降解力。
中等濃度KCl能刺激Taq酶合成活力達50%～60%，最佳KCl濃度為50mmol/L，濃度更高有抑製作用，>200mmol/L的KCl可使酶失活。
加入50mmol/L NH4Cl或NH4Ac或NaCl,可產生中度抑制或無作用。
低濃度尿素、DMSO、DMF或甲醯胺影響不大，吐溫20/NP40可消除SDS（0.01%及0.1%）的抑製作用。
3．第二代耐熱DNA聚合酶Stoffel片段：Cetus公司的Stoffel將TaqDNA聚合酶的5』→3』外切酶活性片段（N端289個氨基酸）去除，稱為stoffel片段。其97.5℃的半衰期從Taq DNA聚合酶的5～6min提高到20min，同時該酶片段也對兩個或更多模板位點的擴增反應即復合PCR（Multiplex PCR）更為有利。
VentTMDNA多聚酶：是美國New England Biolabs公司從潛水艇排氣孔（Vent）中分離的超級嗜熱菌-能生長於98℃中的Thermococcus litoralis中分離純化得到的，故名Vent酶。它的一些酶學性質較Taq DNA聚合酶更為優越，它能耐100℃高溫且2h以上仍有活力，並且具有3』→5』外切酶活性的校正能力，錯誤擴增的機率比Taq酶降低一倍。後來該公司又從深水潛艇（2010m）排氣孔分離的能在104℃生長的Pyococcus菌GB-D株植入Deep Vent DNA聚合酶基因而表達的Deep Vent DNA聚合酶，在95℃的半壽期達23h（Vent酶為6.7h,Taq酶為1h）。
4．RTth逆轉錄酶（rTth Reverse Transcriptase）目前逆轉錄-PCR（RT-PCR）的發展很快，所以對耐熱的依賴於RNA的DNA多聚酶的研究也有進展。有實驗表明Taq DNA多聚酶有依賴於RNA的DNA聚合酶活性，但活性較弱。Cetus公司於1991年推出一種rTth Reverse Tran－scriptase,有很好的依賴於RNA的耐熱DNA聚合酶活性和依賴於DNA的耐熱DNA聚合酶活性，二種活性分別依賴於Mn2 Mg2 ，這樣就可分別控制酶活性。利用該酶只需250ng的總RNA即可有效地進行RT-PCR，得到特異的DNA片段，從而非常有利於逆轉錄PCR的發展。
耐熱DNA聚合酶的研究得到長足的發展，這在PCR發展中起到了重要的作用。相信隨著進一步的研究，將使人們對耐熱DNA聚合酶的認識和應用更進一步地發展。
我國的PCR研究發展很快，其關鍵試劑-耐熱DNA聚合酶-也已有幾個實驗室能夠分離純化，如復旦大學遺傳學研究所、華美公司、中國醫學科學院基礎醫學研究所。後二者的菌株為Thermus aquaticus YT-1。前者則是從自己篩選的嗜熱菌中分離純化，復旦大學遺傳所亦已成功地克隆了該聚合酶的基因並獲得了耐熱F4DNA聚合酶，其酶學性質非常接近於Taq DNA聚合酶，為中國PCR的開展提供了保證。
四、影響PCR特異性的因素
通過上述內容。可以看出有許多因素可以影響PCR的特異性，在此我們作一歸納，供大家參考：①退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。②減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發及錯誤延伸。③引物二聚體是最常見的副產品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發，尤其是引物的二聚化。④改變MgCl2(有時KCl)濃度可以改進特異性，這可能是提高反應嚴格性或者對Taq酶的直接作用。⑤模板中如果存在次級結構，例如待擴增的片段易自行形成發夾結構時，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脫氮-2』-脫氧鳥苷-5』-三磷酸（7-deaza-2』-deoxyguanosine-5』-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150μmol/l de7GTP 50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP，則可阻非特異性產物的生成。
五、擴增平坡
擴增反應並不是可以無窮地進行下去的，經過一定的循環周期後需擴增的片段不再按指數增多而逐漸進入平坡；進入平坡的循環次數，取決於起始時存在的模板拷貝數以及合成的DNA總量。所謂平坡就是批PCR循環的後期，合成產物達0.3～1pmol時，由於產物的堆積，使原來以指數增加的速率變成平坦的曲線。造成PCR進入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完畢、Taq酶失活，這幾中因素在標准反應中均不會出現。此外，還有幾種可能：
1．底物過剩因DNA合成量多於反應液中存在的Taq酶，在100μl反應液中含2.5Utaq酶而DNA合成量達1μg（3nmol脫氧核苷酸）時，開始變為底物過剩。延長延伸時間或添加Taq酶，可以克服之。但不實用，因每進行下一循環就要延長延伸時間一倍及多加一倍Taq酶，才能繼續保持指數增長。
2．非特異性擴增產物的競爭與上述情況密切相關，此時不需要的DNA片段與需要的片段同時競爭聚合酶，要克服這一情況是要提高反應特異性，使不需要片段不能大量積聚。
3．退火時產物的單鏈自己締合兩條單鏈的DNA片段在退火時除了與引物締合外，也可以自行締合，這也會阻止產品增多。當產物濃度到達10pmol/100μl時即可發生此現象，除稀釋外無法克服。
4．變性在高濃度產物條件下，產物解鏈不完全，以及最終產物的阻化作用（焦磷酸化，雙鏈DNA）。
總而言之，PCR的條件是隨系統的而異的，並無統一的最佳條件，先選用通用的條件擴增，然後稍稍改變各參數，可以達到優化，以取得優良的特異性和產率。

10. 醫學微生物學題庫什麼是培養基分為幾類主要用途

培養基按其物理狀態可分為固體培養基、液體培養基和半固體培養基三類。 （高中只用掌握固體培養基和液體培養基就可以了。）
(1)固體培養基。是在培養基中加入凝固劑，有瓊脂、明膠、硅膠等。固體培養基常用於微生物分離、鑒定、計數和菌種保存等方面。
(2)液體培養基。液體培養基中不加任何凝固劑。這種培養基的成分均勻，微生物能充分接觸和利用培養基中的養料，適於作生理等研究，由於發酵率高，操作方便，也常用於發酵工業。
(3)半固體培養基。是在液體培養基中加入少量凝固劑而呈半固體狀態。可用於觀察細菌的運動、鑒定菌種和測定噬菌體的效價等方面。

培養基按其特殊用途可分為選擇性培養基、鑒別培養基和加富培養基。（高中只用掌握選擇性培養基和鑒別培養基就可以了。）
(1)選擇性培養基。是根據某一種或某一類微生物的特殊營養要求或對一些物理、化學抗性而設計的培養基。利用這種培養基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來。
(2)鑒別培養基。是在培養基中加入某種試劑或化學葯品，使培養後會發生某種變化，從而區別不同類型的微生物。
(3)加富培養基。是在培養基中加入血、血清、動植物組織提取液，用以培養要求比較苛刻的某些微生物。
其它種分法高中就不用掌握了。僅供參考。
如果你還想了解更多，可以網上搜索關鍵詞「培養基的種類」。