抗體如何標記生物素

『壹』 如何用生物素標記抗體

緩沖溶液的作用主要就是pH穩定性和離子強度的適合，還有避免緩沖溶液中的成分與樣品分子發生共價鏈接，主要就是考慮這些。
鏈接很容易，就用EDC或者CMC等碳二亞胺，是最容易在羧基和氨基之間催化形成醯胺鍵，反應條件就是0到4度，過夜，用磁力攪拌子溫和攪拌，pH<7反應快，不過pH=7或稍微pH>7也關系不大。EDC或者CMC等碳二亞胺催化活性極高，而且一般的蛋白質的分子表面總有Lys,Arg,Asn,Gln，所以游離在分子表面的羧基和氨基總是不少的，參與反應的兩種蛋白質用大致10：1的比例混合（哪種蛋白質便宜，哪種蛋白質的物質的量就大些，但是這不是全部原因），反應樣品濃度就按照平時使用時的濃度或略微更低濃度（別用儲存液的濃度）即可。很容易反應，而且EDC或者CMC等碳二亞胺是零臂連接試劑，用於空間位阻，形成多分子交聯可能較小，即使形成了也很容易用分子篩層析按照分子量區分開。
參與反應的兩種蛋白質用大致10：1的比例混合（哪種蛋白質便宜，哪種蛋白質的物質的量就大些，但是這不是全部原因），為了避免兩種蛋白質之間發生交聯成為串聯，因為一種蛋白質形成串聯的可能性低一些；即使要形成串聯的蛋白質串珠，最好也不要是價格高的那種；另外，EDC或者CMC等碳二亞胺催化活性極高，室溫下即會催化，所以要在0到4度，過夜，用磁力攪拌子溫和攪拌，一方面避免碳二亞胺催化活性太高形成串聯的蛋白質串珠，另一方面，保護蛋白質不變性；反應樣品濃度就按照平時使用時的濃度或略微更低濃度（別用儲存液的濃度）即可，為什麼？因為濃度高了更易形成串聯的蛋白質串珠結構，濃度低了，沒有反應成功，通過分子篩層析還可以分離出來接著連接，如果形成了醯胺鍵再要專一性切開就沒有那麼容易了。

『貳』 酶聯免疫檢測的方法及原理是什麼

（1）酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）：是將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。
（2）夾心法（sandwich assay）:將已知的特異抗體包裝在固相載體（塑料板凹孔或紙片上），加入待檢標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結合，洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結合的酶標抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。
間接法（indirecr ELISA）常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標本（可能含有相應抗體），再加入酶標抗Ig的抗全（即第二抗體），經加底物顯色後，根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。
（3）BAS-ELISA：近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素（avidin）分子可以結合4個生物素分子（biotin）。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合，而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統（biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA），它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統，同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。

『叄』 如何純化生物素標記的IgG

如何純化生物素標記的IgG
EMSA結合反應：(1) 如下設置EMSA結合反應陰性對照反應：Nuclease-Free Water 7微升EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) 2微升細胞核蛋白或純化的轉錄因子 0微升標記好的探針 1微升總體積 10微升樣品反應：Nuclease-Free Water 5微升EMSA/Gel-Shift結合...
BAS-ELISA是在常規ELISA原理的基礎上，結合生物素(B)與親和素(A)間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統。生物素很易與蛋白質(如抗體等)以共價鍵結合。這樣，結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應，既起到了多級放大作用，又由於酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。
BAS用於檢測的基本方法可分為三大類。
第一類是標記親和素連接生物化大分子反應體系，稱BA法，或標記親和素生物素法(LAB)。

『肆』 免疫組化的操作步驟

一 免疫組化（SP法）操作步驟
1． 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步後進行
2.緩沖液洗 3min/2 次。
3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鍾。
4. 緩沖液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鍾以封閉非特異性的背景染色。
（註：孵育不要超過 10 分鍾，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）
6. 緩沖液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定）
8. 緩沖液洗 5min/2 次。
9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer（增強子），在室溫下孵育 20 分鍾。
10 ．緩沖液洗 5min/2 次。
11 ．滴加 HRP Polymer（酶標二抗） ，在室溫下孵育 30 分鍾。
（註：HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露並儲存在不透明的小瓶中。）
12 ．緩沖液洗 5min/2 次。
13 ．向 1ml DAB Plus Substrate （或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen），混勻後滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鍾。（具體時間由染色深淺決定。）
14 ．自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。 ⑴、石蠟切片脫蠟至水。
⑵、 3%H 2 O2 室溫孵育 5-10 分鍾，以消除內源性過氧化物酶的活性。
⑶、蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鍾 x2 （如需抗原修復，可在此步後進行）。
⑷、 5-10% 正常山羊血清（PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鍾，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。
⑸、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。
⑹、滴加適量 生物素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鍾。
⑺、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。
⑻、滴加適量的 辣根酶或鹼性磷酸酶標記的鏈霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鍾。
⑼、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。
⑽、顯色劑顯色 3-15 分鍾（DAB 或 NBT/BCIP）
⑾、自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。 冰凍切片 4-8μm ，室溫放置 30 分鍾後，入 4 ℃丙酮固定 10分鍾，PBS洗，5分鍾x3，用過氧化氫孵育5-10分鍾，消除內源性過氧化物酶的活性。

『伍』 商品化抗體一般都是生物素標記的么

商品化抗體一般都是生物素標記的
在做western blot或免疫組化時我們常使用一抗二抗來放大、顯示抗原,用酶或熒游標記二抗.生物素化的抗體,是在抗體上連接生物素（biotin）,生物素能和親和素（avitin）特異性高親和性結合,親和力是抗原抗體結合的一萬倍,而且一個avitin可以結合四個biotin,這樣又起到級聯放大的作用.所以能更加靈敏的顯示微量抗原.這種方法也叫親和免疫組化.

『陸』 熒光二抗標記用HRP、AP、FITC、生物素法各發什麼顏色熒光

這四個不是一碼事，HRP和AP是酶，二抗上掛了酶，要給相應的底物才能顯色，顯色方式可以通過發熒光也可以不發熒光（例如給予ECL底物，其中的H2O2和魯米諾在HRP的作用下，能在黑暗中發出熒光；也可以給予雙氧水和DAB，反應產生棕色不溶於水的物質）；FITC為異硫氰酸熒光素，本身就是黃綠色熒光，二抗結合後可直接在熒光顯微鏡下觀察；生物素一般也是掛在二抗上的，利用卵白素分別連接生物素標記的第二抗體和生物標記的酶，由酶催化底物，生成終產物，這個終產物也是不溶於水的。

『柒』 ELISA的夾心法和競爭法的區別

1、標記不同

競爭，標記抗原，與檢測樣品中的抗原競爭抗體。

夾心：標記抗體，固相抗原與液相抗原（樣品）競爭標記抗體。

2、模型不同

競爭法的模型：包被抗原，用HRP-抗體與樣本一起加入。樣本中的Ag與Solid-Ag競爭HRP-Ab，固相吸附的HRP-Ab與樣本中的Ag濃度成反比。

夾心法的模型：包被抗體，用HRP-抗原與樣本一起加入。樣本中的Ag與HRP-Ag競爭Solid-Ab，固相吸附的HRP-Ag與樣本中的Ag濃度成反比。

基本原理

①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。

②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。

以上內容參考：網路-酶聯免疫吸附測定法

『捌』 過生物素標記的流式抗體及鏈霉親和素標記的熒光素嗎

過生物素標記的流式抗體及鏈霉親和素標記的熒光素
抽血檢測，一般用三代酶聯合免疫法 酶聯免疫法，簡稱ELISA。 它的中心就是讓抗體與酶復合物結合，然後通過顯色來檢測。 步驟：ELISA用血清來檢測，首先血液要經過至少半個小時的凝集，然後取血清（這是有些網友不理解為什麼醫院抽完了血對血置之不理的原因，其實是誤會）。將酶復合物用稀釋液稀釋後，加血清及陰性、陽性對照，還有就是質控品（這是嚴格的要求，它的范圍必須在質控范圍內）。經過一個小時的孵育，然後洗板，加底物，半個小時避光反應後加終止液即完成反應部分，然後就是讀數。由數值來判斷結果的陰性或陽性。嚴格的講，如果第一次檢測為陽性的話，無論是哪個實驗室，必須按照CDC的HIV操作規程來進行第二次檢測，第二次的方法必須與第一次的不同，如還是陽性，將送確認實驗室確認。有的醫院很不負責，將初篩陽性的報告發出後就不管了，這是不對的。必須經過確認實驗室確認後才可出陽性診斷。祝大家。PS，第一次檢測為陽性的話，一定要去確認實驗室再做一次，勇敢的去面對，也許結果就不一樣了。 基本原理是：使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。

『玖』 有一個抗體產品，用於做ELISA實驗，描述如下，是說這個抗體是生物素標記嗎

是的，生物素標記的，小鼠單抗，可以做ELISA