1. 大腸桿菌沒有細胞器,怎樣合成干擾素和胰島素
大腸桿菌有核糖體細胞器,把干擾素和胰島素的基因通過基因工程導入大腸桿菌,能表達的話就能合成干擾素和胰島素。大腸桿菌沒有細胞器不對。
2. 基因工程的方法是怎麼生產干擾素的
已知干擾素基因則可直接化學合成法合成,也可通過PCR方法得到干擾素基因序列,在目的基因兩端加上粘性末端,連接到有相同粘性末端的原核生物表達質粒載體上(載體上含抗某一抗生素的基因),將質粒轉導入感受態菌株,搖菌1小時後塗平板(平板中加入該抗生素,篩選成功導入質粒的菌株),挑單克隆搖菌過夜,然後鑒定導入的質粒是否成功表達干擾素。菌種可凍存於-80度。發酵罐大量培養後,取發酵液離心收集、純化干擾素。
3. 為什麼可以用大腸桿菌生產干擾素
根據生物學書中的定義,干擾素是哺乳動物細胞在誘導物的誘導下產生的一種特異糖蛋白,由此可知,由哺乳動物細胞分泌的天然干擾素是糖蛋白,但是這並不意味著由基因工程技術生產的重組人干擾素就一定是糖蛋白。
據科學家的研究資料顯示,用大腸桿菌生產出來的干擾素是沒有糖鏈的,但同樣能夠抑制病毒在細胞內的增殖,加強巨噬細胞的吞噬作用和對癌細胞的殺傷作用。由此可知,該假設對於大腸桿菌表達系統並不成立,大腸桿菌可以生產干擾素,但沒有證據表明大腸桿菌能生產糖蛋白。
既然基因工程方法生產出來的干擾素沒有糖鏈也能發揮作用,那哺乳動物細胞為何要「多此一舉」給干擾素加上糖鏈呢?糖鏈之於糖蛋白的意義是什麼?一方面,真核細胞的糖基化體系給蛋白加上糖鏈後,能夠幫助蛋白折疊成正確的構像,同時糖蛋白分子表面的極性糖鏈有助於蛋白質的溶解,防止蛋白聚集沉澱,從而能使糖蛋白分泌到細胞外。而在大腸桿菌表達系統中,由於缺乏糖基化體系,表達的非糖基化蛋白常常會在細菌體中聚集成不溶性的包涵體(inclusion body)。所謂包涵體,是指由於表達部位的低電勢以及外源蛋白分子的特殊結構如Cys含量較高、低電荷、無糖基化等,使得外源蛋白與其周圍的雜蛋白、核酸等形成的不溶性聚合體。包涵體中的蛋白是沒有生物活性的,需要通過後續的溶解、純化、復性等操作幫助變性的包涵體蛋白折疊成有生物活性的蛋白。科學家用基因工程的方法在大腸桿菌細胞內獲得的干擾素就是以包涵體的形式存在的,因此,最初獲得的干擾素是沒有活性的,通過之後的純化、復性等一系列的操作,科學家才得到了有生物活性的重組人干擾素。另一方面,糖鏈對蛋白的穩定性和半壽期(half life,一種物質其質量的一半被代謝或排出所需的時間)有一定的影響,一些糖蛋白在去除糖鏈後雖然仍具有一定的生物活性,但是易被蛋白酶降解。因此,真核細胞表達的干擾素需要糖鏈來穩定結構、幫助溶解,並通過轉運系統分泌到細胞外,進入血液循環系統,以發揮其抗病毒抗腫瘤的生物功效。
大腸桿菌是不是就一定不能生產糖蛋白呢?在上個世紀,也許不可能,但是現在,隨著科學技術的發展和科學研究的進一步深入,科學家們發現在一種名為Campylobacter jejuni的細菌里存在生產糖蛋白的基因簇,即pgl基因簇,此基因編碼的蛋白能夠起糖基轉移酶的作用,科學家用基因工程方法將這套基因克隆至大腸桿菌共表達,使得大腸桿菌也能夠生產相應的糖蛋白。雖然大腸桿菌生產糖蛋白與真核細胞生產糖蛋白在合成機理、糖鏈結構等方面有很多差異,而且用大腸桿菌生產糖蛋白還處於實驗室探索研究的階段,但相信隨著這方面研究工作的不斷開展,有希望在不久的將來研發出一套成本低、產量高、質量好的大腸桿菌重組糖蛋白表達系統。
4. 有人嘗試將干擾素基因與大腸桿菌的質粒重組,轉入大腸桿菌體內後,形成工程菌,此操作能制備到干擾素嗎
可以。
基因工程的基本原理:將一種生物的基因——外源基因,結合到另一種生物的基因組DNA中並表達,產生人類所需要的產物。如,將人類的胰島素基因,導入大腸桿菌細胞並表達,使大腸桿菌產生人類胰島素。基因工程是經過預先設計的,其結果使生物獲得新的遺傳性狀或創造出新的生物類型。
步驟:
(1) 提取目的基因
方法:
①從生物體細胞中分離。先定位,在用限制酶切取。
②化學方法人工合成
(2)目的基因與運載體重組
用相同限制酶切割含目的基因的DNA和質粒,再用DNA連接酶使兩者形成形成重組質粒。
(3)重組質粒導入受體細胞
受體細胞大多數是微生物,也可以是植物細胞和動物細胞;
動物基因工程通常以動物的受精卵為受體細胞,用顯微注射方法將目的基因
導入受精卵;
重組質粒必須導入活細胞,藉助活細胞的代謝才能使目的基因表達。
篩選含目的基因的受體細胞
重組質粒導入受體細胞的概率極低,因此重組質粒是否導入,以及導入後目的基因是否表達,都必須經過檢測加以篩選;
為了便於篩選,作為運載體的質粒必須帶有標記基因,如抗生素抗性基因,這樣,若導入目的基因的受體微生物能在含抗生素的培養基中生長,說明目的基因已成功導入,若檢測到人類所需要的基因產物則說明目的基因已成功表達;
將篩選出的受體菌培養成工程菌,通過微生物的發酵大量生產人類需要的基因產品。
在工業上的應用:利用微生物繁殖快、結構簡單、遺傳操作較容易等優點,在制葯業,通過工程菌生產胰島素、干擾素等葯物,不僅成本低,而且產量高。
5. 用基因工程生產干擾素的具體過程
1. 設計合成干擾素基因的兩端引物(完全的),每條引物內或5'-端最好有內切酶酶切位點。
2. 有葯物誘導細胞,如佛波酯,使細胞表達干擾素升高。
3. 破碎細胞,提取細胞總mRNA.
4. 用逆轉錄試劑盒逆轉錄,把總mRNA逆轉錄成cDNA
5. 以cDNA為模板、干擾素引物為引物,PCR,得到完全的干擾素基因的PCR產物
6. 提取載體(質粒、病毒等),雙酶切,再把干擾素基因的PCR產物用相應的酶酶切,用連接酶連接
7.連接完成後分離純化,測序,與原干擾素序列比對。
8.鑒定序列無誤後(無義突變也行),導入受體細胞,篩選
9.篩選出來後,提取重組產生的干擾素,活性測定
10.有活性再擴大規模培養,提取生產
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6. 如何提取干擾素
顧名思義,干擾素是一種能起干擾作用的物質。
1957年,美國的兩位科學家艾薩克斯和林登曼首先發現,當病毒感染人體後,受到病毒入侵的細胞里會產生和釋放出一種蛋白質進行「自衛反擊」,干擾和抑制病毒的「為非作歹」。這種蛋白質被稱為干擾素。
這一發現,極大地震動了全世界的科學界。許多國家的科研機構不惜資金投入研究,先後證明,用干擾素治療病毒引起的感冒、水痘、角膜炎、肝炎、麻疹等都有很好的療效。尤其令人注目的是,干擾素對癌細胞也有抑製作用。有些科學工作者還探明,干擾素對人體的免疫能力也有刺激作用,能喚起整個機體的防禦系統,提高它們的機能和作用,警覺地進入「戰備狀態」,從而大大地增強身體的抵抗力。有人預言,未來年代裡葯品的新秀可能將是干擾素的「天下」。
干擾素雖有如此神效,但是它的提取工作非常困難。因為干擾素只有在受到病毒入侵的細胞中才能產生,而且數量極少。1979年芬蘭紅十字會和赫爾辛基衛生實驗所用了4.5萬升(1升相當於1000cc)人血,才煞費苦心地提煉了0.4克干擾素。據法國醫療單位計算,治療一個感冒病患者要花費1萬法郎,而醫治一位癌症病人,那就需要花費5萬多法郎。可謂是世界上最昂貴的葯品之一了。
那麼,能不能從別的動物血液中提取呢?也不行。因為干擾素有很強的專一性,人體用的干擾素只能從人體細胞中取得;把從別的動物身上取得的干擾素用到人身上,數量再多也沒有效果。人們正在積極尋找新的辦法。前不久,美國和瑞士的科學工作者分別宣布,他們已經採用基因工程的辦法,把人干擾素基因移植到大腸桿菌細胞里去,使大腸桿菌在新移植來的基因的指導下,合成我們所需要的物質——人干擾素。
我們知道,繁殖快本來就是微生物的特點,而大腸桿菌在這方面更是首屈一指。它一般20-30分鍾就能繁殖一代,24小時可繁殖七十多代。而且大腸桿菌的食料簡單,來源豐富,培養並不困難。因此,用它們來生產干擾素,不僅產量高,而且價格低廉,一旦付諸實施,微生物又將為人類的健康事業作出新的貢獻。
7. 大腸桿菌中沒有內質網和高爾基體,為什麼用大腸桿菌以及酵母菌產生白細胞干擾素,如何實現糖基化
用轉基因技術,將相關基因導入大腸桿菌並使它表達,這樣的大腸桿菌就可以生產干擾素了。
至於如何實現糖基化,我推薦你讀一篇文章,講解非常詳細,我給你貼上網址:
http://www.pep.com.cn/gzsw/jshzhx/tbziy/kbshy/jcjxi_1/bxyi/201008/t20100831_839762.htm
8. 基因工程中,用大腸桿菌作受體,生產干擾素,為什麼不能以分泌物的形式獲得
應該是這樣的
大腸桿菌為原核生物,無高爾基體,所以干擾素不能以分泌物形式
而 酵母菌為真核生物,有高爾基體,所以干擾素能以分泌物形式
9. 是否可用基因工程,讓大腸桿菌合成干擾素
可以 但是干擾素得基因必須人工合成 不能用天然的
干擾素是淋巴因子 屬於真核生物體內的基因控制合成的 真核生物體內的基因是斷裂基因
有內含子 大腸桿菌是原核生物 轉錄時不能把內含子的那部分序列去掉 人工合成的基因不具有內含子 所以用人工合成的基因可以讓大腸桿菌合成干擾素
10. 怎樣讓大腸桿菌製造干擾素
通過基因工程給大腸桿菌增長產生干擾素的基因片斷