1. 高通量測序中如何判斷土壤微生物數量的多少
在陸地生態系統中，在土壤中生活有數量龐大的微生物種群，包括原核微生物如細菌、藍細菌、放線菌及超顯微結構微生物, 以及真核生物如真菌、藻類( 藍藻除外) 、地衣等。它們與植物和動物有著明確的分工，主要扮演「分解者」的角色，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學反應，擔負著地球C、N、P、S 等物質循環的「調節器」[1 ]、土壤養分植物有效性的「轉化器」和污染環境的「凈化器」等多方面生態功能[2 ]。土壤微生物是氣候和土壤環境條件變化的敏感指標，土壤微生物群落結構和多樣性及其變化在一定程度上反映了土壤的質量。土壤微生物多樣性一般包括微生物分類群的多樣性、遺傳(基因) 多樣性、生態特徵多樣性和功能多樣性[3 ]。由於土壤微生物的復雜性、土壤本身的多變性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人們對土壤微生物多樣性的研究與動、植物相比遠遠落後。隨著多聚酶鏈反應(PCR)、核酸測序等現代生物學分子生物學技術的迅速發展, 人們對土壤微生物多樣性有了更多的了解；高通量測序技術的發展則為研究土壤宏基因組提供了大量數據，為直接探究土壤中的微生物群落結構提供了客觀而全面的信息。
一、對土壤微生物進行研究的方法
1、微生物平板培養法
傳統的土壤生態系統中微生物群落多樣性及結構分析大多是將微生物進行分離培養，然後通過一般的生物化學性狀，或者特定的表現型來分析，局限於從固體培養基上分離微生物。
這種方法只限於極少量（0.1%-1%）可以培養的微生物類群，無法對絕大多數微生物的分類地位和系統發育關系的深入研究。
2、分子生物學技術結合測序的方法
在過去的20多年裡，分子生物學技術，尤其16SrDNA技術已經廣泛應用於鑒定未知菌的研究中。20世紀80年代以來, 逐步建立起了以分子系統發育分析為基礎的現代微生物分子生態學的研究方法, 如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、熒光原位雜交技術(FISH)、基因晶元(Microarry) 、磷脂脂肪酸圖譜分析( Phospholipid fatty acid, PLFA) 、穩定同位素探針( Stable Isotope Probing, SIP) 、PCR-DGGE/TGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 等, 使得研究者能夠在分子水平上對土壤微生物多樣性進行研究。
其中運用比較廣泛並被普遍認可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在於，檢測的DNA片段長度范圍以200bp ～900bp為佳，超出此范圍的片段難以檢測[4]，PCR 擴增所需G/C 鹼基對含量至少達40 % ，通常只能檢測到環境中優勢菌群的存在，只有占整個群落細菌數量約1％或以上的類群能夠通過DGGE檢測到[5]。TGGE 儀器所允許的溫度范圍為15 ℃～80 ℃，較大片段DNA 的Tm 值因為接近80 ℃而使檢測難度提高；若電泳條件不適宜，不能完全保證將有序列差異的DNA片段分開，從而出現序列不同的DNA 遷移在同一位置的現象。
3、高通量測序方法
近年來，16S rRNA/DNA為基礎的分子生物學技術已成為普遍接受的方法[6,7 ]。研究表明，400～600鹼基的序列，足以對環境中微生物的多樣性和種群分類進行初步的估計[8]，因此454高通量測序的方法因其讀長（400~500bp）長和准確性高的特點大量用於微生物多樣性的研究。
有了微生物16S rDNA序列，不論是全長還是部分，都可以提交到GenBank採用BLAST程序與已知序列進行相似性分析。Gen Bank將按照與測得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應的微生物種類，但更為精確的微生物分類還取決於系統發育分析(phylogenetic analysis)。
高通量測序的優越性體現在：測序序列長，可以覆蓋16S /18S rDNA、ITS等高變區域； 測序通量高，可以檢測到環境樣品中的痕量微生物；實驗操作簡單、結果穩定，可重復性強；無需進行復雜的文庫構建，微生物DNA擴增產物可以直接進行測序，實驗周期短；測序數據便於進行生物信息分析。
該方法得到頂級期刊的認可（Nature等），已成為土壤微生物多樣性檢測的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，為客戶提供的土壤樣本進行高通量測序並進行生物信息學分析。高通量測序因其數據量大，操作過程簡單，盡可能避免了繁瑣的實驗操作過程所造成的樣本損失，能夠相對客觀的反應出土壤樣本的真實情況。
二、高通量測序在土壤微生物研究中的應用
1、 研究土壤微生物的物種多樣性
微生物物種多樣性主要從對微生物類群即細菌、真菌和放線菌這三大類群的數量及其比例組成來描述微生物多樣性，或者按照微生物在生態系統中的作用將其劃分成不同的功能群(function group)，通過某一功能群中物種的分類及其數量來研究土壤微生物多樣性，如對土壤中的產甲烷細菌、固氮菌、根瘤菌等的多樣性進行研究。以下是幾篇具有代表性的文章。
Roesch等[9]採用454測序法對西半球的一個大的橫斷面的4類土壤進行檢測和統計學評價。結果表明，這4種土壤中，最豐富的微生物類群擬桿菌綱、β-變形菌綱和α-變形菌綱。與農業土壤相比，森林土壤的微生物多樣性更為豐富，然而檢測結果表明森林土壤中的古生菌多樣性較少，僅為該位點所有序列的0.009%，而農業土壤的比例則為4% -12%。
土壤中細菌的多樣性差距非常大，因土壤結構的不同土壤中的細菌群體也呈現出多樣化。Triplett等[10]基於焦磷酸測序法來對16S rRNA的V2-V3區域進行測序，估測9個草地土壤中的菌群的整體和垂直特性。對所有752,838條數據序列進行聚類分析，探索菌群在豐度、多樣性和組成成分等方面的特異性。作者發現在不同的土壤層中，細菌系統發生的種群或者亞群的不同分配是與土壤的性質有關的，包括有機碳含量、總含氮水平或者微生物生物量。
2、研究土壤微生物功能多樣性
土壤微生物功能多樣性指包括微生物活性、底物代謝能力及與N、P、S 等營養元素在土壤中轉化相關的功能等, 通過分析測定土壤中的一些轉化過程, 如有機碳、硝化作用以及土壤中酶的活性等來了解土壤微生物功能。
氨氧化反應是硝化作用的第一步，也是全球氮循環中由微生物活動形成硝化鹽的重要進程。Leininger[11]檢測了3個氣候區域12塊原始和農業用地的土壤里編碼氨單加氧酶(amoA)的一個亞基的基因豐度。採用反向轉錄定量PCR研究及無需克隆的焦磷酸測序技術對互補DNA測序，證實古細菌的氨氧化活性要遠高於細菌，證實Crenarchaeota可能是土壤生態系統中最富有氨氧化活性的微生物。
Urich等[12]採用基於RNA的環境轉錄組學方法同時獲得土壤微生物種群結構和功能信息。結果認為，通過該方法可以同時研究微生物生種群結構與功能從而避免其他方法所造成的偏差。群落基因組學分析可以通過研究微生物基因組序列與某些表達特徵之間的關系，獲得一些微生物功能方面的信息。但同時也需要運用其他方法將特定功能與具有這種特定功能的微生物群落結構對應起來。對rRNA表達基因和與環境因素相關的主要酶類的基因進行定量化和比較分析，將能了解微生物結構與特定功能之間的關系，如硝化、反硝化和污染物降解。
反硝化作用是參與到氮流失和溫室氣體排放等氮循環過程的重要流程之一。通過宏基因組測序的方法，結合分子檢測和焦磷酸測序，Ryan等分離鑒定了操縱編碼反硝化過程的酶類。通過篩選77,000個土壤宏基因組文庫中得到的克隆，最終分離並鑒定了9個參與反硝化作用的酶簇[13]。
3、 研究環境的突然變化對土壤微生物菌群的影響
環境的突然改變會導致微生物群落的結構和功能發生變化。Zachary等[14]以重水穩定同位素探測技術（H218O-SIP）鑒定與土壤增濕相關的細菌。通過液相色譜/質譜（LC-MS），作者確定H218O中的氧原子結合到了所有的DNA結構成分中。盡管這種結合不是均勻的，還是可以明顯的將標記了18O和未標記的DNA區分開來。作者發現DNA和細胞外的H2O中的氧原子在體外沒有發生交換，表明摻入DNA的18O是相對穩定的，並且摻入到細菌DNA中的18O的比例較高（48-72h）。土壤增濕後，對土壤中16S rRNA進行高通量測序，發現Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相對比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例則降低。作者通過控制土壤濕度的動態變化，對微生物菌群的結構發生變化進行研究和生態類群的劃分。
2. 檢測土壤中的微生物實驗的土壤採集詳細步驟
1、根據研究設計選擇具有代表性的土壤，確定采樣地。了解該地區的生物氣候等情況，確定采樣時間，避免雨季采樣。
2、選擇未經人為擾動的區域采樣，耕地樣品要在施肥前採集。
3、采樣時要對土壤、生物、氣候等環境因子進行調查記錄，如地形、植被、土壤剖面結構、土壤水熱狀況、酸鹼度、有機質含量等、
4、采樣時所有工具、塑料袋或其他物品都要事先滅菌，或用採取的土壤擦拭。
5、采樣程序如下：除去地面植被和枯枝落葉；鏟除表面1cm左右的表土；多點採取重量相當的土壤進行混勻，去除石礫等雜質後再取一定量土壤裝袋；取樣深度依照研究設計而定，在同一剖面中分層取樣時，應在挖好剖面後，先取下層土樣，然後再取上層土樣，以避免上下混雜。
3. 土壤微生物中的真菌DNA應用什麼方法提取，提取應注意哪些細節~
CTAB法可以的，通用於真菌DNA提取，
第一步使用液氮研磨破壁，非常重要，後面都是抽提掉蛋白等雜質。
如果資金充足就購買試劑盒提取，速度快。
4. 求助提取土壤微生物總DNA的方法
植物提取物提取
目前提取植物提取物用溶劑提取、超聲波提取、微波提取酶提取超臨界流體萃取、微波輔助提取等則作新提取技術廣泛使用
溶劑提取
溶劑提取用溶劑固體原料提取效所用溶劑必須具備與所提取溶質互溶特性植物材料粉碎放入適合容器內加入數倍量溶劑採用浸漬、滲漉、煎煮、流連續提取進行提取巴科丹參提取物用溶劑提取提取精油類物質用溶劑提取
溶劑提取提取工藝程溶劑濃度、料液比、提取溫度、提取間直接影響效提取率Cristina Juan等通溶劑萃取提取米赭麴黴素A用熒光探測液相色譜確定OTA含量研究表明適宜料液比、提取溫度提取間情況提取物OTA含量高4.17ng/gMonte D. Holt等採用溶劑萃取熟麥種提取烷基間苯二酚實驗表明採用溶劑萃取能夠節約提取間
超聲波提取
超聲波提取利用超聲波產強烈振空化效應加速植物細胞內物質釋放、擴散並溶解進入溶劑同保持提取物質結構物性發變化超聲波提取原理主要物理程近逐漸受重視較新提取數說超聲波提取較規溶劑提取能幅縮短提取問消耗溶劑少浸率高具較高提取效率
超聲波提取工藝程溶劑選擇濃度、料液比、提取溫度、提取間直接影響提取率Ling Zhou等利用超聲波提取提取五味主要研究超聲提取率影響素實驗研究提取率隨著溫度升高升高隨著功率增增Hong Van Le等利用超聲波提取櫻桃維素E酚類化合物主要比較超聲提取酶提取提取間、提取率差異實驗結表明超聲波提取間比酶提取縮短6倍超聲波提取提取率酶提取2～3倍鍾等利用超聲波萃取鮮竹葉葉綠素用光光度計定量測定所萃取葉綠素含量結表明：與用機溶劑提取相比超聲波萃取僅萃取率高、速度快、效率高且室溫提取需加熱節約能源
超臨界流體萃取
超臨界流體提取(supercriticalfluid extractionSFE)種較新型提取離技術般採用CO2作提取劑超臨界流體萃取原理利用超臨界流體獨特溶解能力物質超臨界流體溶解度壓力溫度變化非敏特性通升溫降壓手段（或兩者兼用）超臨界流體所溶解物質離達離提純目兼精餾提取兩種作用具性易失、產品質量高、提取離程同步完等優點認綠色環保高新離技術特別適合於穩定產物理性物質離與精製
20世紀80代期超臨界CO2提取技術逐步應用於植物性提取離研究應用較功項新技術Ruey Chi Hsu等CO2乙醇溶劑採用超臨界流體提取技術提取靈芝效研究結表明：超臨界流體提取保證靈芝提取物流性且受溫度影響Monica Waldeb.ck等採用加壓流體萃取技術提取橄欖角鯊烯α-育酚兩種實驗結表明：溶劑乙醇、提取溫度190℃、提取間10min提取效YI QI ANG GE等採用超臨界CO2提取技術麥胚芽提取維素E主要研究提取前處理提取工藝條件產率影響實驗研究表明：粒30網、壓力4000～5000psi、提取溫度40～50℃、CO2流體流速2.0mL/min提取率高
微波輔助提取
微波輔助提取技術（microwave.assistedextractionMAE）利用微波能提高提取效率種新技術微波輔助提取利用微波加熱特性物料目標進行選擇性提取通調節微波參數效加熱目標利於目標提取與離微波輔助提取提取植物原理植物品微波場吸收量能量周圍溶劑則吸收較少細胞內部產熱應力植物細胞內部產熱應力破裂使細胞內部物質直接與相冷提取溶劑接觸進加速目標產物由細胞內部轉移提取溶劑強化提取程微波輔助提取技術原理與浸泡濾使用熱能提取植物提取物速度卻要比傳統快減少提取間同避免價值植物提取物破壞降解
目前微波輔助提取其快速提取速度較提取物質量植物性提取力工具微波輔助提取選擇性內加熱且要求處理物料具良吸水性換言待離產物所處位置容易吸水否則細胞難吸收足夠微波自身擊破產物難迅速釋放於液體提取體系要求溶劑物質具極性非極性溶劑微波作用敏Ti ng Zhou等採用微波輔助提取提取葯用植物提取黃酮類香豆素類化合物通交實驗研究品、料液比、提取溫度間提取率影響實驗研究表明：佳提取工藝條件提取率98.7%黎海彬等用微波輔助提取提取干羅漢羅漢皂苷結顯示微波輔助提取提取率70.5%比規水提取高45%間縮短50%
微波超聲波協同提取
微波種非電離電磁輻射輻射物質極性微波電磁場快速轉向及定向排列產撕裂相互摩擦引起發熱保證能量快速傳遞充利用具高效節能工業污染等優點微波穿透深度限（與其波同數量級）且強化提取程傳質功能並顯著超聲波種高頻機械波具湍效應微擾效應界面效應聚能效應等超聲波所產熱效應顯著且局限空化泡周圍極范圍兩者結合起協同作用利於破壁組釋放等即通微波－超聲波協同強化提取技術獲取種高效價廉污染物性物質提取HeJT等採用微波－超聲場協同葯提取水溶性物性均取較效羅鋒等採用微波超聲波協同提取甘草提取黃酮馬利華等研究傳統蒸餾與微波超聲波協同提取牛蒡類胡蘿卜素提取率影響並通交實驗確定佳提取條件白紅進等別水乙醇蒸餾水及水乙醇－蒸餾水(體積比1∶1)等溶劑採用微波超聲波協同提取蘆薈並採用食用油氧化穩定性測定儀別測定提取物菜籽油豬油棉籽油及葵花油抗氧化作用
酶提取
植物細胞壁由纖維素構其植物效往往包裹細胞壁內酶提取利用纖維素酶膠酶蛋白酶等（主要纖維素酶）破壞植物細胞壁促使植物效限度溶解離種酶提取提取工藝酶選擇、酶濃度、pH值、酶解溫度、酶解間都影響植物提取物提取率
E. BARZANA等採用酶提取萬壽菊提取類胡蘿卜素主要研究料液比、酶濃度、酶解間溫度等提取率影響研究結表明佳提取工藝：料液比1∶4、酶濃度0.3%、提取間1.5h、溫度25℃張清等採用酶提取提取銀杏性—黃酮並通交實驗找酶濃度、pH值、酶解溫度間等影響提取率佳工藝條件
5. 土壤總DNA提取的方法，詳盡說明，最好列出注意事項，謝謝
土壤總DNA的幾種提取方法
SDS 高鹽法(方案1)
具體步驟:
稱取1 g 土壤,放入研缽中,倒入適量的液氮,立即研磨;再倒入適量的液氮,研磨,重復3 次,使土壤顆粒研成粉末;
將13.5 ml 提取緩沖液(0.1 mol/L磷酸鹽[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl蛋白酶K(10 g/L ) 與5 g 土壤置於50 ml 的離心管中,放入37 ℃恆溫搖床上,225 r•min - 1振盪30 min ;
加入1.5 ml20 % SDS ,輕輕混勻,65 ℃水浴加熱2 h ,每隔15～30 min 輕輕搖勻1 次;5 000 r•min - 1離心10 min ,將上清液轉入新的50 ml 離心管中;取4.5 ml 提取緩沖液加入原離心管,搖勻泥漿,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同樣的離心速度離心10 min ,將上清液與原上清液合並;再重復此步驟1 次;
用與上清液等量的三氯甲烷於離心管中混勻,5000 r•min - 1離心20 min ;收集上清液,並加入0.6 倍體積的異丙醇,室溫靜置1 h ;25 ℃下12 000 r•min - 1離心20 min ,倒出上清液,乾燥後加入500μl 去離子水,溶解粘附於離心管壁的DNA 及其雜質,並收集於1.5 ml 的微型離心管中.
變性劑加SDS 高鹽法(方案2)
具體步驟：
取1 g 土樣和等量的滅菌石英砂在研缽中混合,加入1 ml 變性劑(4 mol/L異硫青酸胍,10mmol/L Tris-HCl [pH 7.0 ] ,1 mmol/L EDTA[pH 8.0 ] ,0.5 % 2-巰基乙醇) ;液氮冰凍,研磨至溶解,重復3 次;
轉入50 ml 離心管中,加入9 ml 提取緩沖液(0.1 mol/L磷酸鈉[pH 7.0 ] , Tris-HCl [ pH 7.0 ] , 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1 %CTAB ,2 %SDS) ;65 ℃水浴1 h ,每10 min 輕輕混勻1 次;5 000 r•min - 1 離心10 min ,取上清;
在原管中加入5 ml 提取緩沖液,混合後,65 ℃水浴10min ,離心,取上清,合入上述上清液;重復一次;加入等體積的氯仿混合,5 000 r•min - 1離心20 min ,取上清;加入0.6 倍體積的異丙醇,室溫沉澱1 h ;20～25 ℃,12 000 r•min - 1離心20 min ,TE 溶解沉澱.
SDS-酚氯仿抽提法（方案3）
稱取1g土壤樣品，加入1ml 0.1mol/l PH8.0 磷酸緩沖液，玻璃珠振盪1min。溶菌酶5mg，使終濃度為2.5mg/ml,室溫振盪15min,放置冰箱30min，加125ul 20%SDS振盪處理15min，離心，分裝EP管，加酚（1：1體積），抽提1次，氯仿-異戊醇（1：1體積），抽提2次，加0.6體積異丙醇，室溫放置1h,離心，70%乙醇清洗，200Ul TE 溶解。
凍融溶菌酶SDS裂解法（方案4）
取1g土壤樣品，加如0.5ml滅菌的抽提緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl , 100 mmol/L EDTA, 200 mmol/L NaCl, 1.0% PVP, 2.0%CTAB , PH8.0）, 加玻璃珠旋渦5~10 min，在液氮中冷卻1 min後迅速在沸水中煮2 min，如此重復3次，13 000r/min離心10 min。上清夜快速置於冰上備用，沉澱用於進一步裂解。將上述沉澱懸浮於0.2ml提取緩沖液中，旋渦10min，加入溶菌酶（100ml/l）50ul,輕輕混勻後，37C溫浴30min，再加入250ul SDS 緩沖液（100 mmol/l Tris-HCl, 200 mmol/l NaCl,2.0% SDS, PH8.0）,上下顛倒10min，13000 r/min離心10min,收集上清夜。
二、DNA純化
葡聚糖-200凝膠G離心層析純化
取2ml滅過菌的一次性塑料注射器，用注射器推桿將滅過菌的玻璃棉推到注射器筒底部，使其厚度約為0.5cm，然後向注射器筒中加入TE緩沖液浸透的葡聚糖凝膠G-200，製成簡式離心層析柱，再置於10ml的離心管中，於高速冷凍離心機上以3000r/min離心20min，去除葡聚糖凝膠G-200中的TE緩沖液，將離心層析柱再置於另一10ml的離心管中，在離心層析柱頂部加入50ul粗土壤DNA，以10 min為周期於3000r/min離心，分別收集層析液。層析液濃縮至50ul
三、DNA的瓊脂糖凝膠電泳
證明存在DNA。
四、DNA 的純度和定量檢測
用紫外分光光度計測量純化後的DNA 溶液在波長為230 nm、260 nm、280 nm 下的OD 值，分別算出A260/A230及A260/A280值。來估計DNA的純度。
五、純化後土壤DNA 的PCR擴增
PCR 反應體系為50μL ,模板為1μL 。PCR反應引物（放線菌通用引物）:
反應條件: 94 ℃ 3 min 預變性; 94 ℃ 1 min , 56 ℃1 min ,72 ℃1 min ,30 個循環;72 ℃補平5 min。PCR 產物用2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
六、檢測擴增結果
凝膠電泳，用溴乙錠染色，在紫外光下檢查結果。
6. 土壤微生物的檢測怎麼做，哪裡可以做
土壤微生物是土壤中一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱，嚴格意義上應包括細菌、古菌、真菌、病毒、原生動物和顯微藻類。其個體微小，一般以微米或毫微米來計算，通常1克土壤中有幾億到幾百億個，其種類和數量隨成土環境及其土層深度的不同而變化。它們在土壤中進行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等過程，促進土壤有機物的分解和養分的轉化；那土壤內的微生物如何測定呢，下面喆圖小編帶大家來了解一下。
一、培養方法
（1）稀釋平板塗抹法
具體操作如下：
①准確稱取 10g（精確到 0.001）採集的鮮土，倒入裝有 90 ml 無菌水的 500 ml 的三角瓶中，置於往返震盪機上（120r/min，常溫），震盪 20 min，使土壤充分分散成為土壤懸液。
②將上面的土壤懸液用無菌移液管吸取 5 ml 到 45 ml 稀釋液中，即為 10-2稀釋度，依次按 10倍法稀釋，製成 10-1~-~10-6稀釋度。注意:每次吸取懸液時,在稀釋液中反復吸入和吹出 3-~5 次,減少因管壁吸附而造成的誤差,並使懸液進一步分散,每個稀釋度需要更換無菌吸管吸取懸液。)
③根據各類微生物在土壤中的數量多少選擇適當稀釋度的懸液接種。本實驗選擇細菌的稀釋度為 10-~10-5,放線菌為 10~-10-4,真菌為 10-1~-10-3。 -3-2
④土壤懸液的接種方法:在無菌培養皿中倒入 15~20 ml 選擇性培養基,待凝固後,用 0.2 ml無菌移液槍吸取0.2 ml各稀釋度的土壤懸液,然後立即用塗抹棒將懸液均勻的塗抹於培養基表面。用同一支吸管接種時,從高稀釋度開始,依次接種到低稀釋度。
⑤接種了土壤懸液的培養皿,平放在超凈工作台 20~30 min,使得菌液滲透入培養基內,然後倒置於 28~-30°C 生化培養箱中培養一定時間:細菌 1~-3 天,放線菌 10-~14 天,真菌 3~-7 天。
⑥培養結束後,取出培養皿計數。
(2)稀釋培養法
一系列稀釋度的製作與稀釋平板法相同。根據各類微生物在土壤中數量的多少選擇適當的稀釋度,分別接種 1 ml 稀釋液與製作好的液體培養基中,根據需要做 3~4 次重復,適溫培養。2 三大類土壤微生物培養基的分離三大類土壤微生物的分離採用稀釋平板塗抹法,每個菌種要求做 3 個稀釋度,每個稀釋度做3-4次重復,選取細菌和放線菌的菌落在20~-200之間的培養皿、真菌的菌落在 10-~100 的培養皿計數,並計算三次重復的平均值。每克干土中微生物數量計算式:
每克干土中菌落數=(菌落平均數×稀釋倍數×100%)/(濕土質量×干土)
1, 細菌:牛肉膏蛋白腖培養基:牛肉膏 3g、蛋白腖 5g、瓊脂 18g、蒸餾水 1000 ml、pH 值 7.0-~7.2 。
2, 放線菌:改良高氏 1 號培養基:KNO3 1g,FeSO4·7H2O 0.01g,K2HPO4 0.5g,澱粉 20g,MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、瓊脂 18g、3%重鉻酸鉀溶液 3.3ml、蒸餾水 1000ml、pH 值 7.2~-7.4
3,真菌:馬丁氏培養基(虎紅瓊脂):蛋白腖 5g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、葡萄糖 10g、瓊脂 18.5g、孟加拉紅 0.033g、氯黴素 0.1g、蒸餾水 1000ml。
所有培養基需在濕熱滅菌鍋中121°C滅菌 20-~30min
以上土壤微生物測定方案僅供參考，可以查詢專業公司進行檢測。
7. 土壤微生物做高通量 土壤dna濃度應該是多少
計算土壤微生物數量，常見的有兩種方法，一種是傳統的培養法，即平板法，將一定質量的土壤製成懸浮液，稀釋後塗到培養基上，培養18-24h，在顯微鏡下找菌落數目，乘以稀釋倍數，粗略估算細菌數量。但這種方法只能得到可培養的微生物數目，僅占土壤總細菌的1%，另外99%的微生物是不可培養的，用這種方法得到的值只是參考數值；
第二種方法是高通量測序的方法，提取土壤總DNA，通過測定土壤中所有DNA的鹼基序列，與細菌的鹼基序列資料庫比對，得到細菌的名稱（操作分類單位，OTU），根據序列的條數大概估算這類微生物所佔的比例。但這種方法無法區分死亡的細菌和活著的細菌，也有一定的局限性。
8. 土壤總DNA有哪些提取方法
SDS 高鹽法(方案1)
具體步驟:
稱取1 g 土壤,放入研缽中,倒入適量的液氮,立即研磨;再倒入適量的液氮,研磨,重復3 次,使土壤顆粒研成粉末;
將13.5 ml 提取緩沖液(0.1 mol/L磷酸鹽[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl蛋白酶K(10 g/L ) 與5 g 土壤置於50 ml 的離心管中,放入37 ℃恆溫搖床上,225 r·min - 1振盪30 min ;
加入1.5 ml20 % SDS ,輕輕混勻,65 ℃水浴加熱2 h ,每隔15～30 min 輕輕搖勻1 次;5 000 r·min - 1離心10 min ,將上清液轉入新的50 ml 離心管中;取4.5 ml 提取緩沖液加入原離心管,搖勻泥漿,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同樣的離心速度離心10 min ,將上清液與原上清液合並;再重復此步驟1 次;
用與上清液等量的三氯甲烷於離心管中混勻,5000 r·min - 1離心20 min ;收集上清液,並加入0.6 倍體積的異丙醇,室溫靜置1 h ;25 ℃下12 000 r·min - 1離心20 min ,倒出上清液,乾燥後加入500μl 去離子水,溶解粘附於離心管壁的DNA 及其雜質,並收集於1.5 ml 的微型離心管中.
更多方法生物幫上面有的， http://www.bio1000.com/zt/gene/jiyin.html 基因組學,基因的表達,基因工程葯,物基因療法,基因測序,基因檢測,基因克隆,基因突變,基因治療,基因破譯,基因與性狀,善惡基因,吝嗇基因,懶惰基因,孤獨基因 。
9. 關於土壤細菌基因組DNA做PCR的問題！！！
Mmmmmm，這個問題啊，從你的描述確實是模板的問題了，導致PCR失敗的模板問題無非兩種：濃度和純度，LS的兄弟說的不錯，模板濃度太大不行，稀釋做個梯度看看也許管用；另一方面，純度的控制就沒這么簡單了，從土壤中提取的基因組中包括肯定不止一種微生物的DNA，對任何一種微生物DNA來說，其他微生物的DNA都算是雜質而且無法去除，同時氛氯仿法提取的DNA通常純度不會太高，尤其你的介質又是土壤，難免有其他雜質除不幹凈，建議你用試劑盒純化一下你的模板，我常用的純化基因組的試劑盒是OMEga的PCR產物純化試劑盒，其實對模板進行稀釋，也就是對雜質進行稀釋，以期達到一種平衡，使得模板能夠作用而雜質不起作用，希望對你有幫助吧，另：我不是做廣告的
10. 我現在提土壤總DNA,DNA提不出來，可是用16srna可以擴出來，這是怎麼回事呢
你怎麼知道提不出來？提DNA時有沒有DNA被提取出來不能用眼睛判斷，即便用分光光度計測量或用電泳後染色也不一定行，主要要看土壤中的DNA的量的多少，PCR的靈敏度很高，因此只要有極其微量的微生物DNA，就能擴出來，當然你要排除是污染的。