微生物的分離包含哪些步驟

A. 自然界分離微生物的一般操作步驟是什麼

先確定要分離的微生物的種類
然後選取合適的選擇性培養基
然後接種，可以用直線，也可以用曲線法，然後在適合條件下培養，
重復幾次直至得到純的菌落

B. 微生物純種分離的方法有哪些

自然界中的微生物總是雜居在一起 即使一粒土或一滴水中也生存著多種微生物 要研究其中某一種微生物 首先必須將它分離出來 下面介紹幾種純種微生物的分離方法
平板劃線分離 將已經熔化的培養基倒入培養皿中製成平板 用接種環沾取少量待分離的材料 在培養基表面平行或分區劃線（圖5-5）然後 將培養皿放入恆溫箱里培養 在線的開始部分 微生物往往連在一起生長 隨著線的延伸 菌數逐漸減少 最後可能形成純種的單個菌落
液體稀釋法 將待分離的樣品經過大量稀釋後 取稀釋液均勻地塗布在培養皿中的培養基表面 培養後就可能得到單個菌落
利用選擇培養基進行分離 不同的微生物對不同的試劑 染料 抗生素等具有不同的抵抗能力 利用這些特點可配製出適合某種微生物生長而限制其他微生物生長的選擇培養基 用這種培養基來培養微生物就可以達到純種分離的目的
菌絲尖端切割 這種方法適於絲狀真菌 用無菌的解剖刀切取位於菌落邊緣的菌絲的尖端 將它們移到合適的培養基上培養後 就能得到新菌落

C. 選擇性分離微生物育種的步驟大致有哪些

一、微生物工業對菌種的要求

(一)、微生物工業的生產水平由三個要素決定：生產菌種的性能、發酵及提純工藝條件、生產設備。其中生產菌種的性能是最重要的因素。

（二）、微生物工業對菌種的要求是：

（1）菌株高產，在較短的時間內發酵產生大量發酵產物的能力;

（2）在發酵過程中不產生或少產生與目標產品相近的副產品及其他產物;

（3）生長繁殖能力強，較強的生長速率，產孢子的菌種應該具有較強的產孢子能力;

（4）能夠高效地將原理轉化為產品;

（5）能利用廣泛的原材料，並對發酵原料成分的波動敏感性小;

（6）對需要添加的前體物質有耐受能力，並且不能將這些前體物質作為一般碳源利用;

（7）在發酵過程中產生的泡沫要少;

（8）具有抗噬菌體的能力；

（9）遺傳穩定性，

二、工業用微生物菌種的來源及選育

（一）微生物菌種的來源

一般通過以下幾個途徑收集菌種、採集樣品和分離篩選：

（1）是根據資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；

（2）從大自然中採集樣品分離；

（3）從一些發酵製品中分離篩選目的菌株。

當前發酵工業所用菌種總趨勢是從野生菌轉向變異菌，自然選用轉向代謝育種，從誘發基因突變轉向基因重組的定向育種。

（二）微生物工業菌種的分離

1、野生菌株的分離、篩選過程

（1）新菌種分離與篩選的步驟

菌種分離的流程如下：

標本採集 →標本材料的預處理→富集培養→菌種初篩→ 菌種復篩→性能鑒定→ 菌種保藏

①采樣

采樣季節：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。

采土方式：在選好適當地點後，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，紮好，標記，記錄采樣時間、地點、環境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。

②標本預處理

④純種分離：採用劃線分離法、稀釋分離法等純化方法獲取單菌落。

⑤高產菌株的篩選：這一步是採用與生產相近的培養基和培養條件，通過三角瓶的容量進行小型發酵試驗，獲得適合於工業生產用菌種。還要對菌種進行發酵性能測定，

⑥毒性試驗：據有的國家規定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑麴黴、米麴黴和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。

2、菌種的分離方法

（1）施加選擇性壓力分離法

主要是利用不同種類的微生物其生長繁殖對環境和營養的要求不同，如溫度、pH、滲透壓、氧氣、碳源、氮源等，人為控制這些條件，使之利於某類或某種微生物生長，而不利於其他種類微生物的生存，以達到使目的菌種占優勢．而得以快速分離純化的目的。如可以控制培養時的氧，可將好氧微生物和厭氧微生物分開；通過控制溫度，可將嗜熱微生物和非嗜熱微生物分開；控制pH，可將嗜酸、嗜鹼微生物分離等。在分離培養基中也可以加入不同的抗生素或試劑來增加選擇性。如在分離放線菌和細菌時，可加入抗真菌抗生素；分離真菌時，可加入抗細菌葯物。

（2）隨機分離方法

有些微生物的產物對篩選沒有直接的選擇性指示作用，因此常採用隨機分離方法分離。

A、抗生素產生菌的分離

抗生素產生菌的分離常用抑菌圈法。實驗必須用工具菌：採用抗生素的敏感菌，傳統上常用金黃色葡萄球菌和枯草桿菌。

Ｂ、抗腫瘤葯物產生菌的分離

抗腫瘤葯物產生菌的分離常用方法：生化誘導法、SOS生色檢測法、DNA修復能力突變株。原理是利用DNA的損傷，微生物發生突變。

B1、生化誘導法：將大腸桿菌的lacZ基因連接在λ噬菌體的PL啟動子下，當DNA損傷時，誘發λ阻遏物CI分解，PL啟動子啟動lacZ基因轉錄，測定表達的ß-半乳糖苷酶活性，來檢測葯物的存在。

B2、SOS生色檢測法：利用當DNA損傷時，可活化yecA蛋白，進而分解噬菌體的阻遏蛋白，再引起sifA基因啟動lacZ基因轉錄，測定表達的ß-半乳糖苷酶活性，來檢測葯物的存在。

Ｃ、生長因子產生菌的分離

以氨基酸產生菌為例，介紹篩選方法。首先將待試菌接入加了抗真菌的化合物（如亞胺環己酮）的分離培養基中生長，然後採用影印法，將菌落復印到能支持氨基酸產生菌生長的培養基中。

D. 如何從土壤中分離得到一個微生物的純培養體

首先你需要確定你分離的是什麼微生物，然後按照以下步驟
1.
選擇合適的富集培養基，加入土壤把目標菌屬富集
2.
選擇合適的選擇性培養基把目標菌屬分離出來。
3.
通過稀釋平板塗布，培養三天後，觀察不同的菌落，在平板反面用記號筆編號不同的菌落。
4.
把標記的菌落在培養基上劃線分離，每一個編號劃線三個平板
5.
待平板長出單菌落後，顯微鏡鏡檢，觀察目標菌是否單一。
單一菌落即為微生物的純培養體。

E. 從自然界分離篩選微生物菌種的基本程序包括哪些

⑴采樣:從適合微生物生長的環境采樣
⑵富增:根據其特性選擇性的富集目的微生物
;⑶初篩:採用平板對富集的目的微生物純種分離,確定其活性選出高產菌種,一般200株;
⑷復篩:對第一次分離的微生物菌種,再次篩選,一般40株;
⑸二級復篩:從40株選出5株⑹確定菌種,進行生產性能測定.

F. 微生物分離實驗

：

從復雜的
群體中獲得只含有一種或某一株
的過程稱為
的分離與純化。常用的方法有
1、簡單
挑取法
2、平板分離法
此次實驗採取的是平板分離法，該方法操作簡單，普遍用於微生物的分離與純化。其原理包括兩方面：
1、在適合於待分離微生物的生長條件（如營養、
、溫度與氧等）下培養微生物，或加入某種
造成只利於待分離微生物的生長，而抑制其他微生物生長的環境，從而淘汰一些不需要的微生物。
2、微生物在
上生長形成的單個
可以是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取
而獲得
。獲得
的方法可通過稀釋
平板或平板劃線等方法完成。
但是從微生物群體中經分離生長在平板上的單個
並不一定保證是
。因此，
的確定除觀察其
的特徵外，還要結合
檢測個體形態特徵後才能確定。有的微生物的純培養要經過一系列分離與純化過程和多種特徵鑒定才能得到。
土壤是微生物生活的
，它所含微生物無論是數量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微
的重要場所，是發掘
的重要基地，可以從中分離純化的到許多有價值的
。此實驗將從土壤中分離兩種細菌。

實驗器材、試劑與
：
1、器材：

、
、
、
、
、
、
、
、三角瓶、
、
、
、
、
杯、
、高溫
、
（槍頭）、
、
、
等。
2、 試劑：
配製

的原料（
、NaCl、
、
）、配置糖
的原料（
、K2HPO3、
、
、NaCl、
）、
（
）、
染液、番紅染液、碘液、95％乙醇、5％
染液、0.5％番紅水染液、3％
水溶液、1％鹽酸二甲基對苯撐二胺溶液、
等。
3、 土樣：取自
7號宿舍樓門前土壤，地下10cm左右。

實驗步驟：
1、配製
蛋白腖
：
1）配製
500ml （用於12個平皿和10支試管斜面）
牛肉膏 0.3% ………………………………… 1.5 g
蛋白腖 1% …………………………………… 5g
NaCl 0.5% ………………………………… 2.5g

2% …………………………………… 10g
pH ………………………………………… 7.0~7.2
2）倒12個平板和10支試管斜面，包紮，121℃滅菌20min.
2、制備土壤
：
稱取土樣10g，放入盛有100ml
的帶有
的三角瓶中，振盪搖勻10min 使土和水充分混合，然後用
從三角瓶中吸取1ml（此操作要求
），加入另一盛有9ml
的試管中，混合均勻，以此類推分別製成製成0.01、0.001、0.0001不同
的土壤溶液。
3、
培養：
以0.01以及0.0001兩個濃度的土壤
作為

的對象，將其分別塗布在3個牛肉膏蛋白腖
中，共6個培養基，標號，37°C溫箱培養48 h。
4、劃線分離（劃線培養）：
對兩種土壤溶液的
基進行觀察，記錄兩種區分明顯的細菌性狀。挑取此兩種細菌在新的培養基中劃線培養（每種
3個
），標號、37°C培養。
5、初步鑒定：
對兩種菌進行簡單染色、
以及
觀察，記錄結果。
6、試管斜面再培養：
將兩種純
接種分別接種在5支試管中，共10支試管。37°C培養（18－24h）。
7、對試管中培養的兩種菌進行生理生化鑒定：
1）
鑒定：
A
：

與許多
與其他細菌區分的主要依據是鑒定有無
。該酶可以把
分解為水與氧氣，氣體氧以氣泡跑出來，則為
實驗陽性。
和許多
在
酶實驗中呈現陰性。
B 步驟：
將培養新鮮的待測
（培養18－24h內）接在
上，滴一滴3％過
於菌體上。
2）糖發酵與氧化實驗
A
：
在細菌的分類鑒定中，糖發酵與氧化測定是一項重要的依據。絕大多數細菌都可以利用糖類作為能源以及碳源，但由於不同的菌存在酶系的差異，因而對糖類的發酵與氧化的能力就有所不同。有的在糖類發酵與氧化代謝中能分解糖類，產酸產氣，有的則只能產酸不可以產氣。酸的產生與否，以及是發酵型產酸還是氧化型產酸，可以由預先加在培養基中的
（
水溶液）呈現出來。這樣把接好
的培養基放在
或好氧的環境下培養，培養基有綠色變為黃色為產酸，是否產氣是通過觀察培養基中是否產生氣泡或培養基斷裂來測定。
B 步驟
① 配置糖
150 ml （
：、K2HPO3：、
、瓊脂：、NaCl：、蛋白腖：），分裝試管。
② 110°C滅菌培養基20 mins （同時滅菌一定量
，待用）。
③ 對兩種細菌進行「穿刺」培養，每種菌做5個試管：2個蓋管培養，2個開管培養，一個為蓋管
。在培養基的上方加入1－2cm厚的
，作為「蓋 管」，以提供菌體無氧的生長環境，開管則不加甘油，作為有氧的生長環境供菌體生長。
④ 在37°C下培養，並在培養24h後觀察培養基中顏色的變化，以及有無氣泡。
3）
測定
A 實驗原理

是
的一種，它在有分子氧以及
存在時，可以氧化二甲基對苯撐二胺，使之呈現
或暗紅色，在此基礎上還可以與a－
結合生成
酚蘭，出現藍色
B 步驟
在干凈
中放一
，用火柴棒取培養18－24h的鑒定菌苔黏在
上，滴一滴1％鹽酸二甲基對苯撐二胺溶液於菌苔上，進行觀察。

G. 微生物分離方法

微生物分離法是獲得微生物純培養物的一種分離方法。通過這個方法可實現一種微生物的培養，或獲得一個細胞的後代。其具體方法有：

1、稀釋倒平皿法。將待分離的材料作一系列稀釋，取不同稀釋度適量塗布於固體培養基平板上或與已熔化的固體培養基一起傾注入平板內，經過培養即有一個微生物細胞繁殖來的單個菌落。

2、劃線法。先將已熔化的固體培養基製成平板，待凝後，取分離材料在上面劃線，可作平行劃線、扇形劃線或其他形狀的連續劃線，使菌樣逐漸減少，最後得到單個孤立的菌落。

(7)微生物的分離包含哪些步驟擴展閱讀：

微生物分離技術的應用措施：

1、減少毒性氧物質的毒害作用：由於常規培養方法使用的高濃度營養基質不利於微生物生長，適當降低營養基質的濃度可以減弱這種不利影響。發現低濃度基質的培養基培養出的細菌在數量和種類上均多於高濃度基質的培養基，但營養濃度過低時會使培養出的微生物數量反而下降。

2、維持微生物間的相互作用：在培養基中加入微生物相互作用的信號分子就可簡單模擬微生物間的相互作用，滿足微生物生長繁殖的要求。

3、供應新型的電子供體和受體：不同微生物的代謝過程不同，因此對反應的底物要求也不盡相同。供應微生物需要的特有底物有助於新陳代謝反應的進行及微生物的正常生長。大量的研究表明，將新穎的電子供體和受體應用到微生物培養中，能夠發現未知的生理型微生物。

4、分散微生物細胞：自然界中很多微生物聚集生長，形成「絮體」和「顆粒」等，致使其內部的微生物不易被培養。對「絮體」和「顆粒」進行適度的超聲處理，將細胞分散再進行培養，可以使更多的微生物接觸培養基而得到培養。

5、延長培養時間：對「寡營養菌」的培養，可適當延長培養時間，使其能長至肉眼可見的尺度。當然培養時間不能無限增長，因為培養時間越長，對培養環境的無菌要求就越高[4]。

6、利用瓊脂替代物：瓊脂對某些微生物具有毒性作用，採用無害且凝結作用較好的替代物質作為培養基固化劑，可以增加微生物的可培養性。

H. 葡萄腐爛微生物的分離怎麼做

微生物分離法是獲得微生物純培養物的一種分離方法。通過這個方法可實現一種微生物的培養，或獲得一個細胞的後代。其具體方法有：
1、稀釋倒平皿法。將待分離的材料作一系列稀釋，取不同稀釋度適量塗布於固體培養基平板上或與已熔化的固體培養基一起傾注入平板內，經過培養即有一個微生物細胞繁殖來的單個菌落。
2、劃線法。先將已熔化的固體培養基製成平板，待凝後，取分離材料在上面劃線，可作平行劃線、扇形劃線或其他形狀的連續劃線，使菌樣逐漸減少，最後得到單個孤立的菌落。
微生物分離技術的應用措施：
1、減少毒性氧物質的毒害作用：由於常規培養方法使用的高濃度營養基質不利於微生物生長，適當降低營養基質的濃度可以減弱這種不利影響。發現低濃度基質的培養基培養出的細菌在數量和種類上均多於高濃度基質的培養基，但營養濃度過低時會使培養出的微生物數量反而下降。
2、維持微生物間的相互作用：在培養基中加入微生物相互作用的信號分子就可簡單模擬微生物間的相互作用，滿足微生物生長繁殖的要求。
3、供應新型的電子供體和受體：不同微生物的代謝過程不同，因此對反應的底物要求也不盡相同。供應微生物需要的特有底物有助於新陳代謝反應的進行及微生物的正常生長。大量的研究表明，將新穎的電子供體和受體應用到微生物培養中，能夠發現未知的生理型微生物。
4、分散微生物細胞：自然界中很多微生物聚集生長，形成「絮體」和「顆粒」等，致使其內部的微生物不易被培養。對「絮體」和「顆粒」進行適度的超聲處理，將細胞分散再進行培養，可以使更多的微生物接觸培養基而得到培養。
5、延長培養時間：對「寡營養菌」的培養，可適當延長培養時間，使其能長至肉眼可見的尺度。當然培養時間不能無限增長，因為培養時間越長，對培養環境的無菌要求就越高 [4] 。
6、利用瓊脂替代物：瓊脂對某些微生物具有毒性作用，採用無害且凝結作用較好的替代物質作為培養基固化劑，可以增加微生物的可培養性。

I. 自然界分離微生物的一般操作步驟

自然界的微生物，幾乎都是混雜在一起的。人們要想觀察、研究和利用某一種微生物，就必須將它從各種微生物混生的環境中分離開來。所以微生物的分離是一項十分重要的技術。

一、分離的基本方法

微生物分離的方法很多，主要有連續稀釋分離法，平板劃線分離法和單細胞分離法等方法。其中，單細胞分離法需要貴重精密儀器，中學無法開展，而連續稀釋分離法和平板劃線分離法卻簡便易行，中學完全具備開展條件。現將這兩種方法說明如下。

1.連續稀釋分離法

①取1克土樣，在火焰旁放入裝有99毫克無菌水的錐形瓶內，充分搖勻，將菌分散。

②用移液管吸取上述菌懸液1毫升，放入盛有9毫升無菌水的試管中，並進一步稀釋成1000倍，即10-3的菌懸液。按10倍稀釋法連續稀釋到10-8（每1次稀釋，都須更換移液管）。

③取3支1毫升移液管分別從10-8、10-7、10-6菌懸液中吸取1毫升菌懸液，分別注入編號10-8、10-7和10-6的培養皿內，同一稀釋液重復做3個培養皿。

④將溫度為45～50℃的營養瓊脂培養基（其成分和配製方法見本章第三節）倒入上述各培養皿內，輕輕旋轉使菌懸液充分混合均勻，凝固後，將培養皿倒扣放置在溫暖處（28℃左右），每天觀察培養基表面有無微生物菌落。

⑤經過一定時間培養後，培養基上長出菌落，根據菌落特徵，初步判斷屬於何種類型的微生物，並在顯微鏡下檢查，若菌體形態一致，則可認為是初步分離到純菌種。

⑥將分離培養所得的純菌種，從平板培養基轉移到試管斜面培養基上培養。

2.平板劃線分離法

①取1克土樣，在火焰旁加進裝有99毫升無菌水的錐形瓶中，堵塞棉塞，製成菌懸液待用。

②取一培養皿置於實驗台上，左手將培養皿打開稍許，向培養皿內注入熔化的營養固體培養基10～12毫升，輕輕轉動培養皿，使其中的培養基分布均勻，平放桌上，使其凝成平板。然後在皿底用蠟筆劃分A、B、C、D幾個區。應連續製作幾份平板培養基。

③將培養皿底部用姆指和無名指固定成傾斜狀態，在火焰旁將培養皿稍微打開。在此同時，用環狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養皿內，在平板培養基的一邊，作第1次平行劃線 6～7條，轉動培養皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然後再用同樣方法，作第3次平行劃線。劃線時，應使平板培養基表面向下，以免空氣中雜菌落入。接種針應與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養皿邊緣，也不要將培養基劃破。

④將劃線後的培養皿倒放在28℃左右的溫暖處進行培養，待長出菌落後，鑒定微生物類群，並根據鏡檢結果，判斷是否已分離到了純菌種。如果菌種很純，則可轉移到斜面培養基上進一步培養。

連續稀釋分離法和平板劃線法，均須在無菌室或接種箱內進行。

二、各類微生物的分離

1.從土壤中分離好氣性及兼性厭氣細菌

其分離方法見本節「分離的基本方法」

2.從土壤中分離放線菌

①製作高氏一號培養基，趁熱注入培養皿中，凝成平板，待用。

②稱取土壤10克，放入裝有100毫升無菌水的錐形瓶中，並加入10%酚10滴，以抑制細菌生長。振盪10分鍾，製成10-1菌懸液。按照連續稀釋分離法，進一步製成10-3菌懸液。

③用移液管吸取0.1毫升10-3菌懸液，注入平板培養基上，用無菌玻璃刮刀將菌懸液均勻塗抹在整個培養基上。然後將培養皿倒置於25～30℃溫箱中，培養7～10天，培養基上會出現微生物菌落。如果菌落的硬度較大，乾燥緻密，且與基質緊密結合，不易被針挑起，這就是放線菌菌落。

④挑取放線菌菌落，接種於斜面培養基上。

3.從土壤中分離黴菌

①製作豆芽汗葡萄糖培養基，並添加80%乳酸數滴，以抑制細菌生長。將培養皿中，凝成平板，待用。

②稱取10克土壤，按上述分離放線菌的方法製成10-4或10-5的菌懸液。

③取0.1毫升菌懸液注入培養皿內培養基上，用玻璃刮刀塗抹均勻。然後將培養皿倒置於25～30℃溫箱內培養3～4天。培養基上會出現微生物菌落。黴菌菌落常長成絨狀、棉絮狀或蜘蛛網狀，可根據這一特徵尋找黴菌菌落。

④挑取培養皿內的黴菌菌落接種於斜面培養基上。

4.從飲水中分離大腸桿菌

①製作伊紅美藍培養基，趁熱注入培養皿中，凝成平板，待用。

②用滅過菌的錐形瓶盛取河水或溝水，按1：10稀釋。

③取0.1毫升稀釋液接種於伊紅美藍培養基上。用平板劃線分離法進行分離。

④將劃線後的培養皿倒置37℃溫箱中培養18～24小時。培養基中會出現大腸桿菌菌落，菌落中心呈暗藍黑色，發金屬光澤。

⑤將菌落接種於斜面培養基上（由營養瓊脂培養基製成）。

J. 自然界分離微生物的一般操作步驟土樣的採取, 預處理, 培養, 菌落的選擇產品的鑒定

1、採集土樣
2、稱取合適量，加水，靜置30min
3、取上清液1ml進行梯度稀釋
4、取合適梯度塗平板（按照自己要分離的菌選擇培養基），每個做3個平行
5、培養，觀察，鑒定菌種