㈠ 高中生物PCR技術的問題
PCR(聚合酶鏈式反應）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。
引物I和引物II局部發生鹼基互補配對這時引物就不能和單鏈結合，導致DNA不能合成。
課本中一對鹼基互補不影響後續。
㈡ 高中生物選修3pcr技術
PCR技術的基本原理
⑴PCR技術的基本原理：該技術是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴於DNA聚合酶的酶促合成反應。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，藉助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3´-OH末端，並以此為起始點，沿模板5´→3´方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。
PCR反應的基本成分包括：模板DNA(待擴增DNA)、引物、4種脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和適宜的緩沖液。類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的高溫變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的低溫退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的適溫延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
㈢ pcr的最佳工作溫度為
依據鏈式反應的不同步驟而適宜不同溫度。
聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。
由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到如今2013年，PCR已發展到第三代技術。1976年，中國科學家錢嘉韻，發現了穩定的TaqDNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。
基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。
㈣ 一道高中生物題 關於PCR擴增
B 和 C都不對
PCR實驗中沒有電場，B這句話雖然正確，但和PCR無關
C需要，PCR實驗中的DNA是在退貨後油一條單練為模板，以引物為起始，合成一條互補鏈，和體內的DNA復制時同時合成2條鏈不同。所以在這個過程中沒有岡崎片。TAQ酶自身有生成磷酸二酯鍵的活性，因此不需要DNA連接酶。
A中，TAQ酶的最適活性溫度是72度
D中，引物與DNA的結合，決定了之後的子鏈從哪裡開始合成。
㈤ 酵母菌液PCR所需裂解溫度是多少
您好，酵母是純天然的微生物。
高於47℃的溫度下,酵母細胞一般不能生長,最適生長溫度一般在20℃~30℃.
發酵溫度是40-42℃.
酵母細胞55～56℃幾分鍾就被殺死.
建議您在使用時可以先用溫水化開。
如果您想了解酵母，可以點擊這里：http://www.exploreyeast.com.cn/yeast-a-to-z
㈥ 怎樣確定pcr反應溫度
要是用引物設計軟體比如Primer設計的引物，軟體會直接顯示Tm值；如果不是的話，可以按下面這個公式計算：
大於10bp，Tm=81.5+41[GC%]-[675/引物長度]
小於10bp，Tm=[（GC%*總鹼基數）*4]+{[(1.00-GC%)*引物長度]*2}
變性溫度一般是94度，延伸溫度72度
㈦ PCR實驗室的溫濕度要求是多少錒 求指教 謝謝了哈
一般溫度要求不嚴，主要是潔凈度。溫度25正負2就可以。
㈧ 高中生物pcr技術擴增的是兩引物之間的核苷酸序列是什麼意思
引物1-->
5『 XXXXXXXXXX 3』
3『 XXXXXXXXXX 5』
<--- 引物2
在PCR反應過程中，每條引物結合一條模板DNA鏈，從5『-3』方向開始擴增，所以最後擴增得到的序列就只能是在兩條引物之間的序列。
多聚酶鏈式反應擴增dna片聚合酶鏈式反應簡稱PCR（Polymerase Chain Reaction） (又稱：多聚酶鏈式反應) PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等反應組成一個周期,循環進行,使目的DNA得以迅速擴增,具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用於基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究,還可用於疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方.PCR又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。
基本原理
PCR技術的基本原理 類似於DNA的 天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR是一種體外DNA 擴增技術，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴於DNA聚合酶的酶促合反應，將待擴增的DNA片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經"高溫變性--低溫退火--引物PCR擴增儀延伸"三步反應的多次循環，使DNA片段在數量上呈指數增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。在環境檢測中，靶核酸序列往往存在於-個復雜的混合物如細胞提取液中，且含量很低，對於探測這種復雜群體中的特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感。使用PCR技術可將靶序列放大幾個數量級，再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結構。PCR技術常與其他技術結合起來使用， 如RT-PCR、競爭PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。
類別
競爭性PCR是一種定量PCR，通過向PCR反應體系中加入人工構建的帶有突變的競爭模板、控制競爭模板的濃度來確定目的模板的濃度，對目的模板作定量研究。將PCR技術和限制酶切技術結合使用，用限制酶酶切目的基因的PCR擴增產物，通過對酶切產物的分析，探測該基因的多態性。RAPD(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)也是應用比較廣泛的一項技術。RAPD是用那些對某-特定基因的非特異性的引物來擴增某些片段。RAPD分析用於探測含有混合微生物種群的各種生物反應器中的微生物多樣性。用RAPD分析所得到的基因組指紋圖譜在比較一段時間內微生物種群的變化以及比較小試規模和中試規模的反應器方面是有用的，但還不足以用來估測群落的生物多樣性。
步驟
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:
模板DNA的變性 :模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備;
模板DNA與引 物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;
引物的延伸:DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的"半保留復制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需 2~4分鍾，2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平台期(Plateau)所需循環次數取決於樣品中模板的拷貝。
PCR的反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y=(1+X)n計算。Y代表DNA片段擴增後的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%， 但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進 入線性增長期或靜止期，即出現"停滯效應"，這種效應稱平台期數、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的競爭等因素。大多數情況下，平台期的到來是不可避免的。
優點
RT-PCR不僅能檢測出不能培養的微生物的基因，還能測量mRNA基因的轉錄水平。
反應特點
特異性強 PCR反應的特異性決定因素為:
①引物與模板DNA特異正確的結合;
②鹼基配對原則;
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性;
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循鹼基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。
靈敏度高 PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞;在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位);在細菌學中最小檢出率為3個細菌。
簡便、快速 PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好後，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2~4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
對標本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗製品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等粗製的DNA擴增檢測。 PCR擴增產物分析
PCR產物是否為特異性擴增 ，其結果是否准確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結論。PCR產物的分析，可依據研究對象和目的不同而採用不同的分析方法。
凝膠電泳分析:PCR產物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產物的特異性。PCR產物片段的大小應與預計的一致，特別是多重PCR，應用多對引物，其產物片斷都應符合預訐的大小，這是起碼條件。瓊脂糖凝膠電泳: 通常應用1~2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。聚丙烯醯胺凝膠電泳:6~10%聚丙烯醯胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用於科研及檢測分析。
酶切分析:根據PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離後，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。
分子雜交:分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據，也是檢測PCR 產物鹼基突變的有效方法。
Southern印跡雜交: 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記後做探針，與PCR產物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用於科研。
斑點雜交: 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用於PCR產物特異性鑒定及變異分析。
氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉澱 核酸。提取的核酸即可作為模板用於PCR反應。一般臨床檢測標本，可採用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用於PCR擴增。RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+濃度:Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。
PCR反應條件的選擇:PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。
溫度與時間的設置:基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標准反應中採用三溫度點法，雙鏈DNA在90~95℃變性，再迅速冷卻至40 ~60℃，引物退火並結合到靶序列上，然後快速升溫至70~75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對於較短靶基因(長度為100~300bp時)可採用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般採用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。①變性溫度與時間:變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃~94℃lmin足以使模板DNA變性，若低於93℃則 需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。②退火(復性)溫度與時間:退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性後溫度快速冷卻至40℃~60℃，可使引物和模板發生結合。由於模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對於20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度:
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T).復性溫度=Tm值-(5~10℃)
在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30~60sec，足以使引物與模板之間完全結合。③延伸溫度與時間:Taq DNA聚合酶的生物學活性:
70~80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高於90℃時， DNA合成幾乎不能進行。
PCR反應的延伸溫度一般選擇在70~75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3~4kb的靶序列需3~4min;擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。循環次數 循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決於模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30~40次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。
反應條件
標準的PCR反應體系:
10×擴增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10~100pmol
模板DNA 0.1~2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul
PCR反應五要素: 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物: 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設計引物應遵循以下原則:
①引物長度: 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物鹼基:G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應與核酸序列資料庫的其它序列無明顯同源性。
引物量: 每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。
酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。
dNTP的質量與濃度
dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度後，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0~7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50~200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配製)，如其中任何一種濃度不同於其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。
模板(靶基因)核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常採用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。 SDS的主要功能是:溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，並解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉澱;蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA
擴增物
PCR擴增產物 可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5'端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由於引物所結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的，3'端則沒有固定的止點，長短不一，這就是"長產物片段"。進入第二周期後，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即"長產物片段")結合。引物在與新鏈結合 時，由於新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等於這次延伸的片段3'端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定於引物擴增序列以內、形成長短一致的 "短產物片段"。不難看出"短產物片段"是按指數倍數增加，而"長產物片段"則以算術倍數增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。
㈨ 為什麼在PCR反應過程中，使用三個不同的溫度變化
第一個一般在94－95度左右,叫做變性,就是通過加熱打開雙鏈.
第二個溫度點叫做退火,根據引物的TM算出,一般比TM低5度,有利於引物的結合.
第三個溫度叫做延伸,一般採用72度.是引物結合後DNA聚合酶按照模板合成新的鏈.一分鍾一千個鹼基對.
如此循環.
現在很多PCR都採用2部法,由於採用了不同的DNA聚合酶（最佳溫度60度）.這樣退火和延伸採用一個溫度.
㈩ pcr退火溫度一般為多少
唉，這種題就是中國特色，完全理論脫離實際。PCR退火溫度是一個范圍，一般是50度到65度，或者到70度做兩步法PCR。其中，模板的GC含量、模板的組成（單一模板還是cDNA還是全基因組DNA還是別的什麼）等等條件都會影響tm值。沒有一個確定的說是多少比較好，都是具體情況具體分析。有的時候引物設計回來，還要做溫度梯度測驗，設計的tm不一定就是最適合的tm。不得不說這題直接問一個數，純屬是閉門造車，一點實驗經歷都沒有隻憑空想，答對了也沒有得到任何有用的知識。 好了，如果非要說一個數的話，那麼習慣上是55度左右。選項中我更傾向於56度的答案。50度還是偏低，對於稍微復雜的模板來說，非特異性擴增的可能性會增大。我只能說，以我6年分子生物學實驗的經驗和實驗室同行的引物設計習慣來說，一般是55度左右。對於這樣的題，不必過於糾結，沒什麼意義。