⑴ RT -PCR的操作步驟
1. 總RNA的提取:見相關內容。
2. cDNA第一鏈的合成:目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售,其原理基本相同,但操作步驟不一。現以長沙贏潤生物技術有限公司提供的操作手冊為例:
(1)在0.5ml微量離心管中,加入總RNA 1-5μg,補充適量的DEPC H2O使總體積達11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl,輕輕混勻、離心。
(2)70℃加熱10min,立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。
然後加入下列試劑的混合物:
10×PCR buffer 2μl
25mM MgCl2 2μl
10mM dNTPmix 1μl
0.1M DTT 2μl
輕輕混勻,離心。42℃孵育2-5min。
(3)加入SuperscriptⅡ1μl ,在42℃水浴中孵育50min。
(4)於70℃加熱15min以終止反應。
(5)將管插入冰中,加入RNase H 1μl ,37℃孵育20min,降解殘留的RNA。-20℃保存備用。
3.PCR:
(1)取0.5ml PCR管,依次加入下列試劑:
第一鏈cDNA 2μl
上游引物(10pM) 2μl
下游引物(10pM) 2μl
dNTP(2mM) 4μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶(2u/μl) 1μl
(2) 加入適量的ddH2O,使總體積達50μl。輕輕混勻,離心。
(3) 設定PCR程序。在適當的溫度參數下擴增28-32個循環。為了保證實驗結果的可靠與准確,可在PCR擴增目的基因時,加入一對內參(如G3PD)的特異性引物,同時擴增內參DNA,作為對照。
(4) 電泳鑒定:行瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結果。
(5) 密度掃描、結果分析:採用凝膠圖像分析系統,對電泳條帶進行密度掃描。
⑵ 我們院里要進質粒提取試劑盒求助
常規的使用小提試劑盒提取得到的質粒,並不適合用來轉染細胞,其原因在於:
1.小提質粒濃度較低,一般僅為0.1~0.2ug/ul。而用質粒轉染細胞,一般至少需要2~5ug左右,如果使用小提質粒,只能加大上樣量,這樣對轉染操作會有一定影響。
2.小提質粒純度不夠,且內毒素含量較高,會對目的細胞有一定毒性,影響轉染效率。
基於以上原因,如果提取的質粒在用質粒轉染目的細胞時,可以選擇長沙贏潤生物技術有限公司的質粒大量提取試劑盒。
⑶ 最近公司要采購組織細胞rna提取試劑盒哪家好推薦下
目前EASYspin 組織/細胞RNA提取試劑盒我覺得還是博凌科為的好,我們院里一直用的都是他家的,很有信賴度的
獨特的裂解液/β-巰基乙醇迅速裂解細胞和滅活細胞RNA酶,然後用乙醇調節結合條件後,RNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附於離心柱內硅基質膜, 再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟, 去蛋白液和漂洗液將細胞代謝物,蛋白等雜質去除, 最後低鹽的RNase free H20將純凈RNA從硅基質膜上洗脫。
產品特點:
離心吸附柱內硅基質膜全部採用進口世界著名公司特製吸附膜,柱與柱之間吸附量差異極小,可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。
不需要使用有毒的苯酚,,氯仿等試劑,也不需要乙醇沉澱等步驟。
快速,簡捷,單個樣品操作一般可在30分鍾內完成。
多次柱漂洗確保高純度,OD260/OD280典型的比值達1.9~2.0,基本無DNA殘留,可用於RT-PCR,Northern-blot和各種實驗。
⑷ 我構建了一個基因的真核表達載體,轉染293T細胞後以空質粒PCDNA3.1及未轉染質粒的孔為對照,還有一個以PBS
如果293T本身不表達這個蛋白的話,最大的可能是一抗質量不過關
你可以做一下免疫印跡看看。免疫組化假陽性多正常(非特異性吸附)。
免疫印跡Western blotting用分子量大小來判斷,很難出假的。
⑸ 我是贏潤生物的離職員工,試用期業績完全不會屬於員工本人,轉正以後的提成老闆說降就降,完全沒有規章制
申訴的前提是你要有足夠的證據,看起來不太可能。所以即便申訴勝算的可能性不大
⑹ 哪位高手指點一下植物RNA提取試劑什麼樣的最好啊
北京艾德萊的植物RNA提取試劑盒非常好用!他們有好幾款植物RNA提取的試劑盒。
現在給您好提供一些資料,希望能幫助到您;
(1) 首先有兩種選擇:第一是用他們的RN01 TRIpure reagent,這個就是Invitrogen的TRIzol,他們的質量完全和進口一樣可以100%替代進口TRIzol。 第二是用RN33 PLANTpure 通用植物總RNA快速提取試劑盒 (普通植物組織細胞),這個試劑盒的原理,是TRIzol加離心柱子,在TRIzol的基礎上加了離心柱子,速度更快,純度更高,操作更簡單。等於是TRIpure(RN01)加離心柱子。
(2) 然後根據特殊具體需求比如想速度更快,操作更簡單,還不想用TRIzol這種苯酚,氯仿毒性物質還有兩種選擇:一種選擇是RN09 EASYspin植物RNA提取試劑盒,這個盒子和Qiagen的74904完全一樣,不用苯酚,氯仿,速度最快,操作最簡單。但是對部分植物樣品來說,可能殘留基因組DNA稍多,只有做了試驗才知道客戶的樣品是不是殘留DNA稍多,就是Qiagen也不能確保100%的樣品沒有殘留DNA。北京艾德萊能確保的就是和Qiagen的效果一致。實在有DNA殘留的,就可能還要用DNA酶消化。具體只能自己權衡選擇或者和艾德萊技術人員溝通了再選擇。另一種就是RN38 EASYspin Plus植物RNA提取試劑盒這個試劑盒是RN09的改進版本(Qiagen也沒有這款,是艾德萊在Qiagen基礎上改進世界首創的),它使用基因組清除柱子的技術和配方在保持RN09不用苯酚,氯仿毒性物質,最簡單,最快速的基礎上消除了基因組DNA殘留,一般肉眼不可見DNA殘留。注意:目前北京艾德萊測試的幾種植物樣品中均已經獲得成功,使用RN09提取有殘留DNA的樣品種類使用這款後,均無DNA殘留。
希望我的回答能幫助到您好。
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