1. 微生物的實驗室培養 倒平板操作 平板劃線法
其目的是一樣的：
1、防止雜菌掉落（最關鍵）
2、水氣是往上蒸發的，可以減慢其乾燥速度。
2. 微生物平板菌落計數法具體實驗步驟
一、目的要求
學習平板菌落計數的基本原理和方法。
二、基本原理
平板菌落計數法是根據微生物在固體培養基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的現象進行的,也就是說一個菌落即代表一個單細胞。計數時,先將待測樣品作一系列稀釋,再取一定量的稀釋菌液接種到培養皿中,使其均勻分布於平皿中的培養基內,經培養後,由單個細胞生長繁殖形成菌落,統計菌落數目,即可換算出樣品中的含菌數。
這種計數法的優點是能測出樣品中的活菌數。此法常用於某些成品檢定(如殺蟲菌劑),生物製品檢定以及食品、水源的污染程度的檢定等。但平板菌落計數法的手續較繁,而且測定值常受各種因素的影響。
三、器材
大腸桿菌懸液,牛肉膏蛋白腖培養基, 1ml無菌吸管,無菌平皿,盛有4． 5 ml無菌水的試管,試管架和記號筆等。
四、操作步驟
1．編號：
取無菌平皿 9套,分別用記號筆標明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有4．5ml無菌水的試管,排列於試管架上,依次標明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2．稀釋
用1ml無菌吸管精確地吸取0．5ml大腸桿菌懸液放入10-1的試管中,注意吸管尖端不要碰到液面,以免吹出時,管內液體外溢。然後仍用此吸管將管內懸液來回吸吹三次,吸時伸入管底,吹時離開水面,使其混合均勻。另取一支吸管自10-1試管吸0．5ml放入10-2試管中,吸吹三次,……其餘依次類推。整個稀釋過程如圖Ⅷ-3。
3．取樣
用3支1ml無菌吸管分別精確地吸取10-4、10-5、10-6的稀釋菌液0．2ml,對號放入編好號的無菌培養皿中。
4．倒平板
於上述盛有不同稀釋度菌液的培養皿中,倒入溶化後冷卻至45℃左右的肉膏蛋白腖瓊脂培養基約10—15ml,置水平位置,迅速旋動混勻,待凝固後,倒置於37℃溫室中培養。
5．計數
培養24小時後,取出培養皿,算出同一稀釋度三個平皿上的菌落平均數,並按下列公式進行計算：
每毫升中總活菌數=同一稀釋度三次重復的菌落平均數×稀釋倍數×5
一般選擇每個平板上長有30—300個菌落的稀釋度計算每毫升的菌數最為合適。同一稀釋度的三個重復的菌數不能相差很懸殊。由10-4、10-5、10-6三個稀釋度計算出的每毫升菌液中總活菌數也不能相差懸殊,如相差較大,表示試驗不精確。
平板菌落計數法,所選擇倒平板的稀釋度是很重要的,一般以三個稀釋度中的第二稀釋度倒平板所出現的平均菌落數在50個左右為最好。
平板菌蓓計數法的操作除上述的以外,還可用塗布平板的方法進行。二者操作基本相同,所不同的是塗布平板法是先將牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基溶化後倒平板,待凝固後編號,並於 37℃溫室中烘烤30分鍾左右,使其乾燥,然後用無菌吸管吸取 0．2ml菌液對號接種於不同稀釋度編號的培養皿中的培養基上,再用無菌玻璃刮棒將菌液在平板上塗布均勻,平放於實驗台上20—30分鍾,使菌液滲透入培養基內,然後再倒置於37℃的溫室中培養。
五、實驗報告
1．結果
將計數結果填入下表。
2．思考題
(1)為什麼溶化後的培養基要冷卻至45℃左右才能倒平板？
(2)要使平板菌落計數准確,需要掌握哪幾個關鍵？為什麼？
(3)同一種菌液用血球計數板和平板菌落計數法同時計數,所得結果是否一樣？為什麼？
(4)試比較平板菌落計數法和顯微鏡下直接計數法的優缺點。
3. 跪求 土壤微生物的測定：塗布平板法 測定細菌、真菌和放線菌的實驗步驟（詳細）
塗布平板法實驗器材 牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基配製 牛肉膏 0.3g
蛋白腖 1g
氯化鈉 0.5g
瓊脂 2g
自來水 100mL
pH 7.0～7.2 滅菌 1.05kg/cm2，22min
配製具體步驟
1．稱量
按培養基配方比例依次准確地稱取牛肉膏、蛋白腖、NaCl放入燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化後倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量後直接放入水中，這時如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然後立即取出紙片。蛋白腖很易吸潮，在稱取時動作要迅速。另外，稱葯品時嚴防葯品混雜，一把牛角匙用於一種葯品，或稱取一種葯品後，洗凈、擦乾，再稱取另一葯品，瓶蓋也不要蓋錯。
2．溶化
在上述燒杯中可先加入少於所需要的水量，用玻棒攪勻，然後，在石棉網上加熱使其溶解。待葯品完全溶解後，補充水分到所需的總體積。如果配製固體培養基，將稱好的瓊脂放入已溶化的葯品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最後補足所失的水分。
3．調pH
在未調pH前，先用精密pH試紙測量培養基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培養基中逐滴加入1mol/L NaOH，邊加邊攪拌，並隨時用pH試紙測其pH值，直至pH達7．6。反之，則用1mol/L HCl進行調節。注意pH值不要調過頭，以避免回調，否則，將會影響培養基內各離子的濃度。
對於有些要求pH值較精確的微生物，其pH的調節可用酸度計進行（使用方法，可參考有關說明書）。
4．過濾
趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利結果的觀察。一般無特殊要求的情況下，這一步可以省去（本實驗無需過濾）。很多都是不需要過濾的。
5．分裝
按實驗要求，可將配製的培養基分裝入試管內或三角燒瓶內。分裝裝置見圖Ⅴ-1。
分裝過程中注意不要使培養基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。
(1)液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。
(2)固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌後製成斜面，如圖Ⅴ-2。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。
(3)半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌後垂直待凝。
6．加塞
培養基分裝完畢後，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進入培養基內而造成污染，並保證有良好的通氣性能（棉塞製作方法附本實驗後面）。
7．包紮
加塞後，將全部試管用麻繩捆紮好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩紮好。用記號筆註明培養基名稱、組別、日期。三角燒瓶加塞後，外包牛皮紙，用麻繩以活結形式紮好，使用時容易解開，同樣用記號筆註明培養基名稱、組別、日期。
8．滅菌
將上述培養基以1．05kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 20分鍾高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時滅菌，則應放入冰箱內暫存。
9．擱置斜面
將滅菌的試管培養基冷至50℃左右，將試管棉塞端擱在玻棒上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。
10．無菌檢查
將滅菌的培養基放入37℃的溫室中培養24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。
1．活材料：蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）菌劑。
2．培養基：牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基（附錄三、1）
3．器材：90ml無菌水、9ml無菌水、無菌平皿、lml無菌吸管、天平、稱樣瓶、記號筆、玻璃刮鏟等。
四、實驗方法
1．樣品稀釋液的制備 准確稱取待測樣品l0g，放入裝有90ml無菌水並放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置搖床上振盪20min，使微生物細胞分散，靜置20-30s，即成10-1稀釋液；再用1ml無菌吸管，吸取10-1稀釋液lml，移入裝有9ml無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10-2稀釋液；再換一支無菌吸管吸取10-2稀釋液1ml，移入裝有9ml無菌水的試管中，也吹吸三次，即成l0-3稀釋液；以此類推，連續稀釋，製成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀釋菌液（圖22-1）。
圖22-1 平板計數法中樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養
用稀釋平板計數時，待測菌稀釋度的選擇應根據樣品確定。樣品中所含待測菌的數量多時，稀釋度應高，反之則低。通常測定細菌菌劑含菌數時，採用10-7、10-8、10-9稀釋度，測定土壤細菌數量時，採用10-4、10-5、10-6稀釋度，測定放線菌數量時，採用l0-3、10-4、10-5稀釋度，測定真菌數量時，採用10-2、10-3、10-4稀釋度。
2．平板接種培養 平板接種培養有混合平板培養法和塗抹平板培養法兩種方法。
（1）混合平板培養法 將無菌平板編上10-7、10-8、10-9號碼，每一號碼設置三個重復，用無菌吸管按無菌操作要求吸取10-9稀釋液各1ml放入編號10-9的3個平板中，同法吸取10-8稀釋液各lml放入編號10-8的3個平板中，再吸取10-7稀釋液各lml放入編號10-7的3個平板中（由低濃度向高濃度時，吸管可不必更換）。然後在9個平板中分別倒入已融化並冷卻至45—50℃的細菌培養基(圖22-2)，輕輕轉動平板，使菌液與培養基混合均勻，冷疑後倒置，適溫培養。至長出菌落後即可計數。
（2）塗抹平板計數法 塗抹平板計數法與混合法基本相同，所不同的是先將培養基熔化後趁熱倒入無菌平板中，待凝固後編號，然後用無菌吸管吸取0.1ml菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上（每個編號設三個重復）。再用無菌刮鏟將菌液在平板上塗抹均勻（圖22-3），每個稀釋度用一個滅菌刮鏟，更換稀釋度時需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度塗抹時，也可以不更換刮鏟。將塗抹好的平板平放於桌上20—30min，使菌液滲透入培養基內，然後將平板倒轉，保溫培養，至長出菌落後即可計數。
4. 食品微生物檢驗中的大腸平板菌落數的選擇，選取菌落數在15到150之間，應怎麼做呢
1：指的是一個稀釋級別平板的平均數
2：是從同一稀釋度中共選取10個可疑的菌落..（再這里我也要打個疑問：會有10個可疑的菌落這么多嗎？？）
3：選取菌落數10～150之間的平板進行計數。一個稀釋度使用兩個平板，取兩個平板菌落數的平均值，乘以稀釋倍數報告。稀釋度選擇及菌落數報告方式可參考菌落總數測定的報告方式。
5. 食品微生物檢驗中的平板菌落數的選擇，選取菌落數在15到150之間，應怎麼做呢
（1）首先，我們寫報告選取的菌落數在30~300CFU，03版的和2010版的國標都是這么規定的，我不知道你們為什麼選15到150。其次，出現的典型和可疑大腸菌群菌落數是指一個稀釋級別的兩塊平板的菌落數的平均數。舉例：如果有一個超過了150，而一個沒有超過，有兩種可能，第一，你的實驗中受到了污染，或者說加樣品稀釋液的量少了。解決方法，實驗前要確保實驗的整個流程都是無菌的，實驗的環境是否紫外消毒，通風情況，樣品打開前是否對包裝進行75%酒精消毒，是否點酒精燈，實驗穿的白大衣是否經紫外照射，實驗時是否帶口罩，腳套，頭套；加稀釋液的時候應 用槍（微量移液器）加樣。第二說明你選的這個范圍無法彌補實驗中產生的誤差，簡單的說你可以選30~300CFU進行報告。
（2）指的是一個稀釋級別的2個平板共移種10管，每個板子5管。至於你說的3個稀釋級別問題，你可以想一下，加入第一個稀釋級別是150cfu，第二個就應該在15cfu左右，第三個就該是1~2cfu左右，不在15~150cfu之間啊，你沒必要報告它呀，只需報前兩個稀釋度的。所以，一般做實驗只用作兩個稀釋度的就行了。
6. 如何製作微生物培養皿
一、如何製作：
分離培養微生物，離不開固體培養基。在微生物實驗室里，固體培養基的使用是如此地頻繁和常規，以至於這一方法看起來也理所當然。然而，回溯至1881年固體培養基出現以前，微生物的培養還只能在液體培養基中進行。為了能直接觀察培養物的形態及生長情況，科學家希望能將微生物培養在固體表面上，就像微生物生長在橘子皮或土豆上一樣。德國醫生羅伯特·科赫（Robert·Koch，1843—1910）曾用煮沸消毒的土豆來培養細菌。此後，他試著用明膠作培養基的凝固劑。他將明膠加入液體培養基中進行融化，然後將混合均勻的液體緩慢地倒在一塊玻璃板的表面。當明膠冷卻凝固後，就在玻璃板表面形成一層固體培養基。為了防止空氣中雜菌的污染，科赫還用玻璃罩將玻璃板與周圍環境隔離開來。但是，人們很快發現，明膠在20 ℃以上就變軟了，很難進行分離微生物的劃線操作。在溫度高於25 ℃時，明膠就液化了，而大多數細菌的培養溫度都不低於25 ℃。
二、培養皿的定義：
培養皿是一種用於微生物或細胞培養的實驗室器皿，由一個平面圓盤狀的底和一個蓋組成，一般用玻璃或塑料製成。培養皿材質基本上分為兩類，主要為塑料和玻璃的，玻璃的可以用於植物材料、微生物培養和動物細胞的貼壁培養也可能用到。塑料的可能是聚乙烯材料的，有一次性的和多次使用的，適合實驗室接種、劃線、分離細菌的操作，可以用於植物材料的培養。
7. 微生物實驗室培養後的平板及培養物(大量)怎麼處理
大量培養物的話最確保的是高壓濕熱滅菌處理，記得要將有瓊脂的一面置於底部，不然高溫會融化瓊脂，結果是可以想像！滅菌後還需要用新潔爾滅重新平皿後晾乾
8. 微生物實驗平板製作方法
（1）培養基的營養構成：各種培養基一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽。分為液體培養基和固體培養基。
制備牛肉膏蛋白腖固體培養基的方法：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。
（2）常用消毒方法：煮沸消毒法、紫外線照射、巴氏消毒法和化學葯劑消毒。
（3）常用滅菌方法：灼燒滅菌、乾熱滅菌和高壓蒸汽滅菌法。
培養基、培養皿、接種環、實驗操作者的雙手、空氣、牛奶所採用的滅菌和消毒方法依次：高壓蒸汽滅菌、乾熱滅菌、灼燒滅菌、化學消毒、紫外線滅菌、巴氏消毒法。
（4）平板培養基的制備：計算、稱量、融化、滅菌、倒平板。
（5）接種方法：平板劃線法和稀釋塗布法。
倒平板的方法：右手持盛培養基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地撥出，試管或瓶口保持對著火焰；然後用右手手掌邊緣或小指與無名指夾住管（瓶）塞（也可將試管塞或瓶塞放在左手邊緣或小指與無名指之間夾住。如果試管內或三角瓶內的培養基一次用完，管塞或瓶塞則不必夾在手中）。左手拿培養皿並將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速例入培養基約15mL，加蓋後輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，然後平置於桌面上，待凝後即為平板。
平板劃線操作：
①挑取他含菌樣品：選用平整、圓滑的接種環，按無菌操作法挑取少量菌種。
②劃A區：將平板倒置於煤氣（酒精）燈旁,左手拿出皿底並盡量使平板垂直於桌面，有培養基一面向著煤氣燈（這時皿蓋朝上，仍留在煤氣燈旁)，右手拿接種環先在A區劃3—4條連續的平行線(線條多少應依挑菌量的多少面定）。劃完A區後應立即燒掉環上的殘菌，以免因菌過多而影響後面各區的分離效果。在燒接種環時，左手持皿底並將其覆蓋在皿蓋上方(不要放入皿蓋內)，以防止雜菌的污染。
9. 微生物研究中的傳統平板法是什麼方法具體怎麼做的
傳統的平板法為：稀釋混合倒平板法
平板是指經熔化的固體培養基倒入無菌培養皿中, 冷卻凝固而成的盛有固體培養基的平皿。該法是先將待分離的含菌樣品, 用無菌生理鹽水作一系列的稀釋(常用十倍稀釋法, 稀釋倍數要適當), 然後分別取不同稀釋液少許 (0.5-1.0ml)於無菌培養皿中, 傾入已熔化並冷卻至50℃左右的瓊脂培養基, 迅速旋搖, 充分混勻。待瓊脂凝固後, 即成為可能含菌的瓊脂平板。
於恆溫箱中倒置培養一定時間後, 在瓊脂平板表面或培養基中即可出現分散的單個菌落。