免疫組織化學染色一步法如何檢查

A. 請教免疫組化的具體步驟！

免疫組化操作步驟

一 免疫組化（ LP 法）操作步驟 ：

1． 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步後進行

2. 緩沖液洗 3min/2 次。

3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色 , 將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鍾。

4. 緩沖液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鍾以封閉非特異性的背景染色。

（註：孵育不要超過 10 分鍾，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）

6. 緩沖液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定）

8. 緩沖液洗 5min/2 次。

9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增強子 ) , 在室溫下孵育 20 分鍾。

10 ．緩沖液洗 5min/2 次。

11 ．滴加 HRP Polymer( 酶標二抗 ) ，在室溫下孵育 30 分鍾。

（註： HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露並儲存在不透明的小瓶中。）

12 ．緩沖液洗 5min/2 次。

13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混勻後滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鍾。（具體時間由染色深淺決定。）

14 ．自來水充分沖洗 , 復染，脫水 , 透明 , 封片。

二．免疫組化 ( 三步法 ) 操作步驟 ：

（ 1 ）、石蠟切片脫蠟至水。

（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室溫孵育 5-10 分鍾，以消除內源性過氧化物酶的活性。

（ 3 ）、蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鍾 x2 （如需抗原修復，可在此步後進行）。

（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鍾，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。

（ 5 ）、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。

（ 6 ）、滴加適量 生物素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鍾。

（ 7 ）、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。

（ 8 ）、滴加適量的 辣根酶或鹼性磷酸酶標記的鏈霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鍾。

（ 9 ）、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。

（ 10 ）、顯色劑顯色 3-15 分鍾（ DAB 或 NBT/BCIP ）

（ 11 ）、自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

三. 冰凍切片免疫組化染色步驟：

冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鍾後，入 4 ℃丙酮固定 10分鍾，PBS洗，5分鍾x3，用過氧化氫孵育5-10分鍾，消除內源性過氧化物酶的活性。以下同石蠟切片免疫組化

B. 免疫組化 如何復染（免疫組化，蘇木精，鹽酸，石

（一）、儀器設備

1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐；2）水浴鍋

（二）、試劑

1）PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L.

2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g.

3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0，加水至1000ml.

4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris鹼，用1N的HCl調至pH8.0，加水至1000ml.

5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配製。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配製。

6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配製。

7）封裱劑：

a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0～9.5）等量混合；

b、油和TBS（或PBS）配製。

8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用於熒光顯微鏡標本；pH7.0～7.4適合於光學顯微鏡標本。

（三）、操作流程

1、脫蠟和水化

脫蠟前，應將組織晶元在室溫中放置60分鍾或60℃恆溫箱中烘烤20分鍾。

1）組織晶元置於二甲苯中浸泡10分鍾，更換二甲苯後再浸泡10分鍾；

2）無水乙醇中浸泡5分鍾；

3）95%乙醇中浸泡5分鍾；

4）70%乙醇中浸泡5分鍾；

2、抗原修復

用於福爾馬林固定的石蠟包埋組織晶元。

1）抗原熱修復

（1）高壓熱修復 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置於金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鍾，然後將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鍾後，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去後打開蓋子。本方法適用於較難檢測或核抗原的抗原修復。

（2）煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織晶元加熱10~15分鍾。

（3）微波熱修復 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰後將組織晶元放入，斷電，間隔5~10分鍾，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鍾；胃蛋白酶消化37℃時間為30分鍾。適用於被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

3、免疫組織化學染色

SP法

1）脫蠟、水化；

2）PBS洗2～3次各5分鍾；

3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鍾；

4）PBS洗2～3次各5分鍾； 5）抗原修復；

6）PBS洗2～3次各5分鍾；

7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鍾。甩去多餘液體。

8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。

9）4℃過夜後需在37℃復溫45分鍾。

10）PBS洗3次各5分鍾；

11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；

12）II抗中可加入0.05%的tween-20.

13）PBS洗3次各5分鍾；

14）DAB顯色5～10分鍾，在顯微鏡下掌握染色程度；

15）PBS或自來水沖洗10分鍾；

16）蘇木精復染2分鍾，鹽酸酒精分化；

17）自來水沖洗10～15分鍾；

18）脫水、透明、封片、鏡檢。

SABC法

1）脫蠟、水化。

2）PBS洗兩次各5分鍾。

3）用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鍾，蒸餾水洗3次。

4）抗原修復。

5）PBS洗5分鍾。

6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鍾。甩去多餘液體。

7）滴加Ⅰ抗，室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜後在37℃復溫45分鍾）。

8）PBS洗三次每次2分鍾。

9）滴加生物素化二抗，20℃～37℃20分鍾。

10）PBC洗3次每次2分鍾。

11）滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鍾。

12）PBS洗4次每次5分鍾。

13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。

14）蒸餾水洗。蘇木素復染2分鍾、鹽酸酒精分化。

15）脫水、透明、封片、鏡檢。

C. 什麼是免疫組化染色，它的原理和步驟是什麼

是病理學診斷方法，尤其是免疫組化在腫瘤診斷和鑒別診斷中的實用價值受到了普遍的認可。
免疫組織化學的臨床應用主要包括以下幾方面：
(1)惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；
(2)確定轉移性惡性腫瘤的原發部位；
(3)對某類腫瘤進行進一步的病理分型；
（4）軟組織腫瘤的治療一般需根據正確的組織學分類，因其種類多、組織形態相像，有時難以區分其組織來源，應用多種標志進行免疫組化研究對軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的；
（5）發現微小轉移灶，有助於臨床治療方案的確定，包括手術范圍的確定。
（6）為臨床提供治療方案的選擇。

D. 免疫組織化學染色診斷是什麼意思

指在抗體上結合螢光或可呈色的化學物質，利用免疫學原理中抗原和抗體間專一性的結合反應，檢測細胞或組織中是否有目標抗原的存在，此方式不只可以用來測知抗原的表現量也可觀察抗原所表現的位置。只要是能夠讓抗體結合的物質，也就是具有抗原性的物質包括蛋白質、核酸、多糖、病原體等都可偵測。

免疫組織化學的優勢在於專一性、靈敏度、簡便快速以及成本低廉，所以廣為醫院採用，通常是藉由特定的腫瘤標記來篩選癌症。免疫組織化學染色法對基礎研究及預防和診療上都是相當重要的一個方法。

(4)免疫組織化學染色一步法如何檢查擴展閱讀

應用的基本原則簡述如下：

1、確定細胞類型和形態。組織細胞內有些蛋白具有組織特異性，如膠質原纖維酸性蛋白只存在於星形膠質細胞內，神經絲蛋白只存在於神經細胞內。通常把這些具有組織特異性的蛋白稱為標記性蛋白。通過標記性蛋白的特異性抗體可確定細胞種類。

有些細胞在光鏡下不易辨認，通過對胞質內的特定蛋白實施免疫組化染色，便能清楚顯示此類細胞外形輪廓。這種作用在神經科學研究和腫瘤臨床病理中顯得尤為重要。

2、辨認細胞產物的來源。利用某些細胞產物為抗原，制備相應的抗體，對組織細胞實施免疫組織化學染色，以確定細胞產物的來源。如內分泌細胞產生的各種激素，大多數可用免疫組化染色技術辨認，據此可研究細胞的分泌功能及對內分泌腫瘤作功能分類，檢測分泌異位激素的腫瘤等，了解細胞分化程度。

3、確定細胞的分化程度。不同的同一類細胞多表達不同的標志性蛋白，根據對這些不同蛋白的鑒定可確定細胞的分化程度。例如，神經上皮細胞的標志性蛋白是巢蛋白，當其分化為放射狀膠質細胞時表達波形蛋白。

在神經元發生期分化為成神經細胞時則表達Ⅲβ神經微管蛋白，成神經細胞分化為成熟的神經元時表達神經絲蛋白。

4、追蹤神經纖維束和它的投射區。用於此目的的免疫組織化學方法常與軸漿運輸示蹤法相結合來研究神經元之間的聯系，軸漿運輸示蹤法是利用某些物質可被神經末梢攝取，經軸質逆行運輸到胞體的特點，用組織化學方法顯示出神經元的輪廓。常用示蹤劑有辣根過氧化物酶和熒光金等。

5．在臨床病理中的應用。如鑒定病變性質，發現微小病灶，探討腫瘤起源或分化表型，確定腫瘤分期，指導治療和預後。輔助疾病診斷和分類，尋找感染病因等。

E. 酶免疫細胞如何進行化學染色

免疫細胞化學染色是將血液、骨髓液、漿膜腔積液等等各種體液組織製成的塗片和骨髓等組織的切片經各種單克隆抗體的標定和常用的過氧化物酶或鹼性磷酸酶顯色後對白血病細胞直接鏡檢，以確定細胞類型。
免疫組織化學染色方法繁多，可根據標記物的不同分為：免疫酶細胞化學染色、免疫熒光細胞化學染色、免疫金銀染色技術以及親合免疫組織化學染色技術等。目前血液系統疾病檢查常用免疫細胞化學染色方法有三種：過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法、鹼性磷酸酶-抗鹼性磷酸酶（APAAP）法和親和素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC-AP）法。PAP法抗原、抗體反應及酶標原理與APAAP法完全相同，都屬於免疫組織化學反應，只是所標記的酶不同。PAP法酶化學反應原理與ABC-AP法完全相同，但ABC-AP法為親合免疫組織化學反應。在染色步驟及方法上PAP法和ABC-AP法完全相同。
免疫細胞化學能夠識別抗原蛋白質一級結構中氨基酸的差別，從而對細胞結構、功能及細胞代謝等進行綜合分析，確定細胞的類型、來源及細胞的分化階段。應用骨髓切片免疫組織化學技術可以對骨髓細胞進行原位觀察，通過對細胞特異性抗原的定性、定位和定量分析，了解骨髓組織和細胞的結構和變化，這對血液系統疾病尤其是血液系統腫瘤的診斷、鑒別診斷，以及血液腫瘤的分類、分型和預後的判斷提供了有利的研究手段。

F. 免疫組化的操作步驟

一 免疫組化（SP法）操作步驟
1． 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步後進行
2.緩沖液洗 3min/2 次。
3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鍾。
4. 緩沖液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鍾以封閉非特異性的背景染色。
（註：孵育不要超過 10 分鍾，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）
6. 緩沖液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定）
8. 緩沖液洗 5min/2 次。
9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer（增強子），在室溫下孵育 20 分鍾。
10 ．緩沖液洗 5min/2 次。
11 ．滴加 HRP Polymer（酶標二抗） ，在室溫下孵育 30 分鍾。
（註：HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露並儲存在不透明的小瓶中。）
12 ．緩沖液洗 5min/2 次。
13 ．向 1ml DAB Plus Substrate （或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen），混勻後滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鍾。（具體時間由染色深淺決定。）
14 ．自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。 ⑴、石蠟切片脫蠟至水。
⑵、 3%H 2 O2 室溫孵育 5-10 分鍾，以消除內源性過氧化物酶的活性。
⑶、蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鍾 x2 （如需抗原修復，可在此步後進行）。
⑷、 5-10% 正常山羊血清（PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鍾，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。
⑸、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。
⑹、滴加適量 生物素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鍾。
⑺、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。
⑻、滴加適量的 辣根酶或鹼性磷酸酶標記的鏈霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鍾。
⑼、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。
⑽、顯色劑顯色 3-15 分鍾（DAB 或 NBT/BCIP）
⑾、自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。 冰凍切片 4-8μm ，室溫放置 30 分鍾後，入 4 ℃丙酮固定 10分鍾，PBS洗，5分鍾x3，用過氧化氫孵育5-10分鍾，消除內源性過氧化物酶的活性。

G. 免疫組化及特殊染色 是啥意思

其為製成病理切片，將病變組織包埋在石蠟塊里，用切片機切成薄片，進行染色。

病理切片是用組織病理學方法製作的一定大小的病理切片。病理組織包埋石蠟塊，切片薄，蘇木精－伊紅（H－E）染色，在顯微鏡下進一步檢查病變。觀察病變的發生、發展，最後作出病理診斷。

部分病變組織或器官通過各種化學葯品和埋葬方法進行處理，使其固定和硬化。在切片機上切成薄片，粘附於玻片上，染色後置於顯微鏡下觀察病理變化，進行病理診斷，為臨床診斷和治療提供幫助。

(7)免疫組織化學染色一步法如何檢查擴展閱讀：

病理切片的相關內容：

1、根據各器官的組織結構確定切片方向。垂直或橫向切割通常是顯示組織形態的關鍵，如長管狀器官。

2、根據解剖部位準確取樣。病理標本應根據病理部位和性質的不同取樣。

3、用鋒利的刀剪開紙巾，不要來回剪文件。不要把組織夾得太緊，以免使組織、細胞因擠壓而變形。

H. 免疫組化原理

免疫組化技術是一種綜合定性、定位和定量；形態、機能和代謝密切結合為一體的研究和檢測技術。在原位檢測出病原的同時，還能觀察到組織病變與該病原的關系，確認受染細胞類型，從而有助於了解疾病的發病機理和病理過程。
免疫酶組化技術是通過共價鍵將酶連接在抗體上，製成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，於普通顯微鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位，根據酶標記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯法（多步法）等，用於標記的抗體可以是用免疫動物制備的多克隆抗體或特異性單克隆抗體，最好是特異性強的高效價的單克隆抗體。直接法是將酶直接標記在第一抗體上，間接法是將酶標記在第二抗體上，檢測組織細胞內的特定抗原物質。目前通常選用免疫酶組化間接染色法。

I. 求免疫組化冰凍切片熒光染色具體流程

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石蠟切片免疫組化染色步驟

石蠟切片免疫組化染色步驟
1、載玻片的處理： 抗原修復過程中，由於高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進行，可選用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑，對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下：
1.1 APES：現用現配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鍾，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES，置通風櫥中晾乾即可。用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位，並盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結果。
1.2 HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留1~2分鍾，然後用雙蒸水快速清洗三次，室溫乾燥或60oC烤箱烘烤一小時，裝盒備用。
1.3 Poly-L-Lysine：將洗凈、乾燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鍾，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜乾燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃製品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時間為37℃、10~40分鍾，主要用於細胞內抗原的顯示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37℃、30~180分鍾，主要用於細胞間質抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原）等。
g/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鍾。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10 3、抗原熱修復： 可根據實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復。抗原熱修復可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配製，取該粉劑一包溶於1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調整。
3.1 石蠟切片微波爐抗原修復操作方法：切片脫蠟至水後，3％H2O2處理10分鍾，蒸餾水洗2分鍾×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間並持續10~15分鍾（注意：無論是使用醫用或家用微波爐，請根據具體機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鍾（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。
3.2 石蠟切片高壓抗原修復操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置於金屬架上，放入鍋內，使切片位於液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5~6分鍾後），計時1~2分鍾，然後將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫後，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗後，PBS洗2分鍾×3，下接免疫組化染色步驟。
3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方法：切片脫蠟至水後，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，並將此容器置於盛有一定數量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鍾，然後端離電爐，室溫冷卻20~30分鍾，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。 4、免疫組化染色步驟： （以美國ZYMED公司SP試劑盒為例）
石蠟切片脫蠟至水。
3%H2O2室溫孵育5~10分鍾，以消除內源性過氧化物酶的活性。
蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鍾，(如需採用抗原修復，可在此步後進行)。
5~10％正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鍾。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時或4℃過夜。
PBS沖洗，5分鍾×3次。
滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鍾；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~30分鍾。
PBS沖洗，5分鍾×3次。
滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鍾；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30分鍾。
PBS沖洗，5分鍾×3次。
顯色劑顯色（DAB或AEC）。
自來水充分沖洗，復染，封片。
冰凍切片免疫組化染色步驟
m，室溫放置30分鍾後，入4℃丙酮固定10分鍾，PBS洗，5分鍾×3。用3％過氧化氫孵育5~10分鍾，消除內源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鍾×2。冰凍切片4~8

免疫組化非特異性染色的消除方法
一、非特異性染色的主要因素
組織的非特異性染色的機理很復雜，其產生的原因主要可分為以下幾點：
（1）一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去
。
（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。
（3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應抗體結合。
（4）從組織中難於提純抗原性物質，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。
（5）抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附於正常組織上而呈現非特異性染色。
（6）熒光素不純，標本固定不當等。 二、消除非特異性染色的方法
消除熒光抗體非特異性染色的方法應根據產生的原因採取適當的方法，常用的方法有以下幾種：
（一）動物臟器粉末吸收法
常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50～100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000～15000r/min）30min，1～2次後，即可使用其上清液。吸收一般應在臨用前進行，吸收後之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應作吸收前後之比較，吸收時可先用緩沖鹽水將組織乾粉浸濕，離心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入熒光抗體進行吸收，以免消耗過多的抗體。
肝粉或新鮮細胞吸收是一種非特異性的消除方法，對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時，也可用相同的組織乾粉或勻漿沉澱物吸收之。
用臟器肝粉吸收對熒光抗體損失較多，如果根據Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2～3次，12000r/min
10min離心沉澱，用其沉澱物吸收其熒光抗體即能完全達到目的，京極方久氏認為這樣吸收對熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收後放置一周左右，用時有必要再吸收一次。
【肝粉的製法】
（1）將若干只小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝臟，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝掉表面的結締組織的脂肪。
（2）剪碎，用生理鹽水反復洗滌至無血色止，然後再加生理鹽水少許，用組織搗碎機或勻漿器作成勻漿。
（3）將肝勻漿裝入離心管內（1/3左右），交換地用2～3倍量生理鹽水和丙酮反復洗滌各三次，至上清無血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉澱15 min後，再除去上清液。
（4）最後用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉澱，將沉澱物平鋪在潔凈的玻璃板上，37℃烤乾（過夜）。
（5）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過後，分裝，密封，低溫乾燥保存。
2006-12-22 13:24 wifgw
二）透析法
熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質大分子不能透過，可將未與蛋白結合的熒光素透析除去。
（1）將標記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內，液面稍留空隙，緊扎。
（2）浸入0.02mol/pH
7.1～7.4的PBS中（懸於大於標記物體積約50～100倍的PBS內），在4℃中透析，每日更換3～4次PBS，約5～7天，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝膠G-50柱層析法
除游離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細方法參閱第二章。加入熒光抗體15～18ml（按床體積的5%～10%加樣），使其緩慢滲入柱內，待即將全部入柱時，加入PBS少許，關閉下口，停留30～40min ，使游離熒光充分進入細篩孔中，然後再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量後，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留於上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來越大，熒光抗體最先流出，分前、中、後三部分收集，測F/P比值，合格者合並，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測定蛋白（發生沉澱反應），繼續洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來，至洗脫液中無蛋白和熒光素後，此層析柱即可再用。
若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，NH4+太濃，在蛋白未完全洗脫時即出現NH4+，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現蛋白時，即進行收集，之後出現SO4++（用1%BaCl2檢查發生白色沉澱）。最後是NH4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉澱），待洗脫液無SO4++及NH4+後可再用。
如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2～3.5ml熒光抗體。
（四）DEAE纖維素柱層析法
標記過多或過少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下： DEAE-纖維素柱的裝柱，洗脫、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以乾重每克交換20～50mg標記蛋白量為宜
。常用梯度洗脫法如下：
（1）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，標記物上柱後，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脫，洗出無色或淡綠色液體，洗脫液量（根據床體積大小每梯度乘3），然後依下列各種離子強度洗脫液，
分別洗脫和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脫部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脫部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脫部分3。
將此三部分收集液（每管5ml）分別測定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合並，濃縮保存備用。因這部分非特異性染色熒光最少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。
（2）柱上吸附的過度標記蛋白可繼續增加NaCl的濃度至
2.0mol/L洗脫完。
經過DEAE-纖維素層析後的標記抗體，其抗體量一般約損失50%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細菌熒光抗體，不一定要這樣處理，可用染色效價測定的稀釋法除去非特異性染色。
（五）熒光抗體稀釋法
先測定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價，若二者效價相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價測定方法相同。
（六）純化抗原法
用各種方法提純單一成分的抗原是產生單價特異性抗體的最主要條件。近代免疫化學技術（免疫吸收法）和柱層析法等提供了很大的可能性，可參考有關專著。
（七）純化抗體法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的純化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（ SIgA）抗原純度不高，所制的抗血清常與IgG呈交叉反應，為此需要吸收，常採用純化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收純化。方法如下：
1．人IgG聚合物的制備 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸緩沖溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，邊加邊攪，5min即出現混濁，逐現大塊膠塊，放置30min後，用研缽將凝膠磨細，繼用1.0mol/L pH7.0磷酸緩沖溶液反復洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即為人IgG聚合物懸液。
2．免疫吸收法 將待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物懸液，置室溫攪拌60min,離心沉澱，上清液即稀釋1倍的純化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏藍（Evans blue）襯染法
用0.01%伊文氏藍的0.01mol/L pH7.2PBS稀釋熒光抗體，可將背景細胞和組織染色，呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對比，減少了非特異性熒光，宜作常規應用。伊文氏藍一般先配成1%溶液，保存於4℃，用前再稀釋至0.01%用以
和然釋熒光抗體。
此外，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染色。